分子生物学综合性实验结题报告
绿色荧光蛋白基因
左xx1
学 10110902014 10110904007 班 10G20
专生物制药
学生物医药
摘要
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；
Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.
Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；
1..引言 ------------------------------5页
2..应用前景 ------------------------------6页
3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页
4..实验材料及试剂 ------------------------------12页
5..实验流程 ------------------------------13页
6..实验结果 ------------------------------19页
7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
现今科学家已经成功地将绿色荧光蛋白基因表达在E.coli及线虫等异源细胞中, GFP在各种异源细胞如,细菌﹑昆虫﹑动物及植物细胞中发现。
本实验通过基因工程手段，将存储在含有pEGFP-N3的GFP基因连接到载体pET-28ａ的启动子区构成重组体，最后在表达菌BL-21中完成GFP基因的表达，结果能成功的观察到GFP发出的荧光。
2 应用前景
在2008年的诺贝尔化学奖上，绿色荧光蛋白成了主角。诺贝尔获奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁?查尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光。
2.1生物技术中的应用研究
2．1．1．分子标记作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP
GFP标记的微管
基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育
和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
2.1.2．药物筛选
许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针
c为药物筛选的GFP
分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。
2.13融合抗体
近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体（Single-chain v
GFP在植物研究中的应用
ariable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。
绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中
3 分子生物学实验原理
3.1 DNA重组技术
DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合，把外源目的基因装配到载体上的过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。
3.2 DNA片段和载体的连接
（1）带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外源目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。为防止载体DNA自身环化，连接前用碱性磷酸脂酶（CIP）去除载体分子的5’-P，使之最大限度地抑制载体环化现象。
（2）带有非互补的粘性末端：用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生这样的末端，一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶切位点；用两种酶分别消化载体和目的DNA后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。
（3）带有平末端：由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶Klenow片段补平3’凹陷，使不相匹配的末端转变为平端。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
（4）成功的连接反应需纯净的目的DNA片段和载体DNA，一般采用插入片段（目的DNA）与载体DNA分子数比为3～5：1。目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体。
3.3绿色荧光蛋白基因重组步骤
本实验将通过限制性内切酶双酶切法将EGFP片段从该质粒中克隆出来，并转入另一常用表达载体Pet28a。在质粒酶切验证后，得到含有EGFP的阳性克隆，并将EGFP蛋白在E.coli BL21菌株中进行表达，最后，所表达的EGFP蛋白可以通过SDS-PAGE法得到验证。
BamHⅠ
NotⅠ
BamHⅠNotⅠ回收回收DH5a
(pEGFP-N3)
DH-5a
(pET-28a)
质粒
pEGFP-N3
质粒
pET-28a
插入片段
4 实验器材与试剂
4.1实验仪器
恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱，1.5mLEP管，0.5mLEP管，塑料离心架，微量加样器各一个，三角瓶，培养皿，电泳仪,玻璃刮刀，制冰机，紫外仪，电子天平，高压灭菌锅。
4.2实验材料及试剂
E．coli DH5a包括含有pEGFP质粒的DH5a菌株，含有Pet-28a（+）质粒的DH5a 菌株和空载的DH5a以及E．coli BL21(DE3)菌株，含Kan的LB液体培养基，LB固体培养基，溶液Ⅰ（GET缓冲液ph8.0），溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,SDS），溶液Ⅲ（乙酸钾溶液，ph4.8）酚-氯仿，TE缓冲液，异丙醇，70％乙醇，无水乙醇，BamhⅠ、XhoⅠ和NotⅠ酶切试剂，0.1mol/L CaCI2溶液(灭菌)。
(1) 液体LB培养基（PH 7.0）
蛋白胨（10 g/L）1％
酵母提取物（5 g/L）0.5％
NaCl （10 g/L）1％
（固体LB培养基是在液体LB的基础上中加琼脂粉2%）
(2) 溶液Ⅰ（0~4 ℃贮存）
葡萄糖50 mmol/L
Tris-Cl(pH 8.0) 25 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L
(3) 溶液Ⅱ
NaOH 0.2 mol/L
SDS 1% (W/V)
（用时由母液2 mol/L NaOH、10 % (W/V) SDS稀释现配）
(4) 溶液Ⅲ（0~4 ℃贮存）
乙酸钾(5 mol/L) 60 mL
冰乙酸11.5 mL
H2O 28.5 mL
(5) 0.5×TBE电泳缓冲母液（500 mL量）
Tris-碱 2.7 g
硼酸 1.4g
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 1mL
(6) 6×DNA电泳缓冲液
溴酚蓝0.25 %
蔗糖水溶液40 % (W/V)
(7) 卡那霉素（Kan）配成浓度为50 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用。
(8) IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用。
5 实验流程
5.1菌株的培养【第八周,星期一,10月29日】
将含有的PEGFP质粒的DH5α菌株，含有PET-28α(+)质粒的DH5α菌株分别用3-4mL含有Kan的LB液体培养基37℃摇床培养过夜。
5.2质粒提取【第八周：星期二,10月30日,13：00-16：00】
①分别取已培养好的含有PET-28α(+)质粒的DH5α150uL置于Eppendorf管中，以12000rpm离心1min,弃上清液，再重复操作一次。然后将小管倒扣在吸水纸上，尽量除去液体，加入溶液I1 50uL ，室温下放置10min。
②配制溶液II（现配现用）加入溶液II 200uL，缓慢轻柔的颠倒4-5次，混匀后冰上放置5min。
③加入150uL预冷的溶液III，缓慢轻柔的颠倒4-5次，冰上放置15min。
④12000rpm，离心5min，取上清液450uL至新EP管中加入等体积的异丙醇，混匀室温放置5min，以12000rpm离心5min，弃上清液。
⑤加入200uL蒸馏水溶解，加入100uL乙酸胺混匀后冰上放置5min。
⑥以12000rpm离心5min,移取上清液250uL至一新EP管中，再加入500ul 无水乙醇,室温放置5min后，以12000rpm离心10min，弃上清液。
⑦沉淀用70%乙醇500uL,漂洗。以12000rpm离心5min，弃上清液，除尽乙醇冷冻干燥5-10min。
⑧加入含有RNaseA 20uL,充分溶解提取物。
5.3琼脂糖电泳鉴定质粒【第九周：11月6号8：00-10；30】
①称琼脂糖0.4g置于锥形瓶中，加入0.5×TBE缓冲液40mL,用微波炉将琼脂糖融化。
②倒入插入有梳子的有机玻璃胶槽中，待胶凝固完全，然后拔出梳子。
③倒入0.5XTBE缓冲液至刚好没过胶面。
④取2uL质粒样品稀释到6uL，加入5×上样缓冲液2uL混匀，加入胶孔，每人做一份，同时电泳，再加5uL maker。
⑤接通电源，用100V稳压电泳。
5.4将pEGFP质粒，PET-28α质粒进行酶切。【第十周：11月13日，星期二13:00-16:00】
BamHI和NotI酶切体系
试剂pEGFP质粒PET-28(+)质粒
DNA/ uL 20 20
k缓冲液/ uL 3 3
BamHI/ uL 2 2
NotI/ uL 2 2
BsA/ uL 3 3
总体积/uL 30 30
混匀，37℃酶切3h。
5.5 DNA琼脂糖电泳鉴定质粒酶切产物。【第九/十二周：11月6/27日】
①称取0.25g琼脂糖加入0.5×TBE缓冲液25mL,用微波炉将琼脂糖融化
。
②制备胶板
③将酶切产物25uL加入加样孔中
④电泳结束后观察结果并拍照。
5.6切胶回收酶切产物片段【第十二周：13：00-16：30】
①在紫外灯下切含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用吸水纸洗尽凝胶表面液体
并切碎，计算重量。
②加入3倍体积的BufferDE-A，混合均匀后75℃加热，直到凝胶块融化
。
③加入1/2体积BufferDE-A的加入量的BuffreDE-B，混合均匀
④正确连接负压装置，DNA制备管插入负压装置的插口上，吸取③中的混
合液，移到制备管中，开启并调节负压至20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中液体。
⑤加500uLBufferW1,洗尽管中液体
⑥加700uLBufferW2,洗尽管中液体，用同样的方法再洗第一次。
⑦将制备管置于2 uL管中以18000rpm离心1min
⑧将制备管置回 2mL离心管中，18000rpm离心1min
⑨将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30uL Eluent
或去离子水，室温静置1min,18000rpm离心1min洗脱DNA。
连接反应的体系
EGFP酶切产物/uL 10
PET-28质粒酶切产物/ uL 6
T4DNA连接酶/ uL 2
T4DNA连接酶缓冲液/ uL 2
总体积/ uL 20
5.7宿主菌培养及感受态细胞制备【十三周12月3/4日星期一/二，8:00-13：30】
⑴制备BL21菌株的感受态细胞【8：00-11：30】
①星期一早上将BL21菌液10 uL加到LB液体培养基中37℃过夜摇床培
养。（6人/瓶）
②二次活化：按1：50比例（约400 uL）将菌液接入新的LB液体培养
基中，摇床培养2h。
③将细菌1.5mL转到无菌Eppendorf管，冰置10min，6000rpm离心2min,
弃上清液。
600 uL悬浮细胞，置于冰中10min。6000rpm
④取冰冷的0.1mol/LCaCl
2
离心4min,弃上清。
300 uL悬浮细胞，于冰上放置30min，均分
⑤取冰冷的0.1mol/L CaCl
2
至3个0.5mLEppendorf管中，分别编号‘1,2,3’。
⑵细胞转化【10：30-13：30】
①在制备好的感受态细胞2号管中加入10 uL连接产物，摇匀，冰置30min
。
②42℃,水浴热击90s,迅速于冰上冷却5min（时间必须准确）。
③每管加LB液体培养基100 uL,(总体积约200 uL)摇床37℃，25min。
④取感受态细胞液100 uL均匀涂于含有Kan的LB平板上，37℃摇床过
夜培养。
⑤在第二天，用灭菌牙签挑取单菌落在Kan平板上划线培养。同时另取
一根牙签挑取同一菌落在LB液体培养基中培养。
注：LB平板制备方法（2人/组，180mL）：
酵母提取物0.9g
NaCI 1.8g
蛋白胨 1.8g
琼脂粉 3.6g
混匀定容至180mL，转入锥形瓶，密封高温灭菌后，立即制2个板(约15mL/个)，当能用手托住锥形瓶后，＋75uL 含kan的溶液，混匀制
10个板，分别编号马1-,2+，3+，4+，5+，6+；
左1-,2+，3+，4+，5+，6+
操作过程中注意温度，制板温度高易使kan失活，低不易制板；涂菌温度高易杀死接种物。
5.8重组体筛选鉴定【十四周：12月10/11日，星期一/二08：00-16：40】
①星期一
菌落PCR扩增体系（50 uL量制备后以10 uL /管分装在4只PCR管中）反应物体积/uL
10×PCR缓冲液 5.0 Dntp 2.5
正向引物 1.5
反向引物 1.5
DNA重组体挑取
单菌落
重蒸水 38.5
混匀
Taq酶 1.0
总体积 50.0
②PCR扩增
③DNA检验特意条带
制备好胶板(2人/块)，实验组每管+3uL Buffer染液，Marker6ul+3uL Buffer染液，10uL/孔加样至胶板中，60V电压电泳至蓝色条带至胶中开始100V电泳；
④提取阳性菌落DNA
取1500uL至EP管中10000rpm，离心2min，弃上清，重复操作一次；→→＋150uL GET缓冲液，混匀，室温10min；→→＋新配制溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1％SDS)200ul，颠倒4-5次混匀，冰上放置5min；→→＋冰冷的乙酸钾150uL，颠倒数次混匀，冰置15min，12000rpm离心5min，转移上清至另一EP管中（约470uL）；→→＋等体积异丙醇，混匀，室温5min，12000rpm离心5min，弃上清；→→＋无菌蒸馏水200uL溶解沉淀，＋1/2体积NH4Ac(约100uL)，混匀后冰浴5min，12000rpm离心5min；→→上清转移至另一EP管中，＋2倍体积无水乙醇，冰上放置20min，12000rph离心10min，弃上清；→→＋70％乙醇洗涤一次，12000rph离心5min，EP 管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温晾干；→→＋30 uL无菌水溶解＋2uL RNA酶，室温放置。
5.9感受态细胞制备及转化，重组GFP的诱导表达【十五周12月
17/18星期一/二】
① 星期一，整个班共接种2瓶，取-20 ℃保存的BL-21菌种200uL/瓶接种到
LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜。由刘佩、王攀完成。
② 星期二，每组1瓶，过夜菌：LB 按1:50接种，取400uL 于LB 液体培养基
中37 ℃ 活化培养2 h 。由王嫄、王志成完成；→→取活化菌1.5mL 于EP
管中，6000rpm ，离心2min ，弃上清；→→＋600uL 冷的CaCI 2，轻轻悬浮
细胞，冰上放置10min ，6000rpm 离心5min ，弃上清；→→＋300uL 冷的
CaCI 2，悬浮细胞，冰上放置30min ，100uL/管分装3管，分别编号
1号,
2号, ＋2uL 自提质粒
→→42℃热击90s ，迅速冰上放置5min ；→→ 3号，＋1uL 标准质粒 ＋3个管中各加100uL LB 液体培养基，37℃摇床培养15-30min 。在提前
备好的LB 固体培养皿中按如下量加样：
加完样品后37℃恒温培养。
注：
LB 平板制备方法（100mL ）：
酵母提取物
0.5g NaCI
1g 蛋白胨
1g 琼脂粉 2g
1 2 3 4 5 6 自标 100uL 100uL 100uL 50uL 50uL 50uL
混匀定容至100mL，转入锥形瓶，密封高温灭菌后，立即制1个板(约15mL/个)，当能用手托住锥形瓶后，＋75uL 含kan的溶液，混匀制成板，分别编号1,2,3,4,5,6号；冷却后在3,4,6号平板中各＋100uL IPTG。
③在十六周周一（12月24日）早上挑取一个GEP菌在LB液体培养基中，37℃
摇床过夜培养。
④取过夜菌1000 uL加入到新的LB液体培养基中，＋10uL Kan活化2h，如
下操作：
10:30时取3mL（分两次取） 12000rpm离心1min，弃上清，菌液继
续活化；
12：30时取3mL（分两次取） 12000rpm离心1min，弃上清，菌液加
100uL IPTG后继续活化；
14:30时取3mL（分两次取） 12000rpm离心1min，弃上清，保存提取
物；
⑤在较大的LB固体培养皿中＋100uL IPTG涂匀，在培养皿里涂成一个如下
图形：37℃摇床培养
6 实验结果
1.5.3琼脂糖电泳鉴定质粒结果
只需验证质粒是否提取成功，实验中仅对样液进行电泳，图谱中有两条较清晰的条带。带2迁移得最远，可能为共价闭合超螺旋DNA，带2可能是线性DNA，
图 1
2. 5.7宿主菌培养及感受态细胞制备
1-4号都是单菌落划线培养出。
图 2
3. 重组体筛选鉴定
没有出现预期的700bp 条带，可能是操作过程中加的菌液过量。
4. 5.9感受态细胞制备及转化，重组GFP 的诱导表达结果如下图
GFP 基因在IPTG 的诱导下正常表达出绿色荧光，没有涂IPTG 的没有正常表达出绿色荧光。
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月
目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
绿色荧光蛋白GFP综述 生命科学学院 2010级李积锋 1241410007 【摘要】绿色荧光蛋白(GFP) 是一种最先来源于水母的蛋白质，现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时小峰可高效发射清晰可见的绿光。它已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记。在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景。 【关键词】水母绿色荧光蛋白生色团变种 1绿色荧光蛋白简介 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，发射绿色荧光。其独特之处在于：它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。 水母的绿色荧光蛋白很稳定，无种属限制，已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。GFP的荧光受外界的影响较小，另外GFP的检测十分方便，而对细胞的伤害极小。由于这些优点，GFP已经成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的极为重要的报告分子。 2绿色荧光蛋白的表达和成熟 GFP的表达水平受多种因素的影响。在植物细胞中表达GFP时，改变一些原GFP 基因的密码子为该植物使用的偏爱密码子，并消除潜在的剪接位点。目前适用于哺乳动物的表达系统不受影响。GFP还可以顺利的在无细胞的体外翻译系统中表达并自发折叠。 用一些小体积的氨基酸残基取代大体积残基可以提高GFP在高温下正确折叠的速度。这些突变位点分布于成熟蛋白质三维结构的各个部位，几乎不能提供如
何帮助GFP折叠和成熟的线索。另外，分子伴侣的存在也有助于GFP的折叠，反过来，这个发现也使GFP成为检测分子伴侣功能的一个好底物，因为GFP可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。 3绿色荧光蛋白的应用 3.1报告基因和细胞标记 GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP的浓度则相对提高了许多倍。 3.2融合标记 应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位 和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP可融合于宿主蛋白的C端或N端，也可插入其内部迄今为止，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。 3.3 其它 GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP，它们可用作环境指示剂如：对PH敏感GFP的可以测定细胞器内的PH值；通过基因工程，可GFP在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP的荧光。另外，最近报道的利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。 4应用特点 GFP这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析 姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学 摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。 关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有
效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表 达和粗提取 欧阳歌谷（2021.02.01） 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取
目录 1 前言3 2 实验目的4 3 实验设备4 4 材料及试剂5 5 实验操作步骤5 5.1操作流程5 5.2质粒DNA的分离与纯化6 5.2.1 质粒的培养6 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法6 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化7 5.3酶切及连接8 5.3.1 双酶切8 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接9 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化9 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附 录）9
绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用 杨军廷 201141804054 华大基因 摘要来源于水母 (AequoreaVictoria)的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP) ,现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。其内源性荧光基团在受到紫外或蓝光激发时可发 现清晰可见的绿光。由于检测方便 ,对生物体基本没有毒性 ,在很多领域已有取代LacZ ,荧光素酶等传统标记方法的趋势 ,在制作转基因动物过程中更是如此。本文综述了GFP在标记目的基因、筛选阳性胚胎等方面的应 用 关键词绿色荧光蛋白；转基因 在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为标记。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上!此方法难以控制化学剂量和染料附着部位!若该标记蛋白用于活细胞内检测!则难以通过细胞膜。因此，该方法已基本淘汰现在常用的报告基因如荧光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因也不尽人意。LUX所检测到的荧光产生部位不一定反映荧光素酶基因的特异表达部位；GUS则需要昂贵的反应底物且由于其它因素的干扰。反应颜色的深浅有时不能说明GUS活性的高低或有无.源于水母等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)可吸收蓝光而后发出绿光是生物发光现象中能量传递的受体之一。它克服了上述缺陷，具有灵敏度高、操作简便，不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等优点。已成为目前最优良的标记基因之一。 1GFP的生化性质及其发光原理 1.1 GFP的发光特性 GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测. 1.2GFP的性质特点 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 1.3GFP的发光原理
分子生物学综合性实验结题报告 绿色荧光蛋白基因 左xx1 学 10110902014 10110904007 班 10G20 专生物制药 学生物医药
摘要 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。 关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；
Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification. Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；
对绿色荧光蛋白的了解及应用 学院：生命科学学院 姓名：马宗英 年级：2011 学号：2011012923
前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。 【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用 一、绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。 野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。 生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。 图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列 图2生色团的形成机制 目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机
制也有很大差异。 二、GFP在生命科学中的应用 1、作为蛋白质标签（protein tagging） 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。 GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。 2、药物筛选 利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。 3、用于免疫学 可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。 线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。 除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。 三、GFP的突变及其应用 GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧
知识介绍 绿色荧光蛋白 马金石 (中国科学院化学研究所 北京 100190) 摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。 由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领 域。本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。 关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光 Green Fluorescent Protein Ma Jinshi (Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190) Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has been widely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expression in cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper. Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence 由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。 化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。 我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。 1 生物发光与水母 先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。从发光生物的分布来 2008 10 25收稿,2008 11 04接受
石河子大学 分子生物学实验结课论文 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析 学生姓名 学号 专业 年级、班级 指导教师 所在学院 中国·新疆·石河子 2016年1月 绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。 关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达 1 前言 1.1实验目的 掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。 1.2实验背景 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种
绿色萤光蛋白 (green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm 分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。 GFP的性质 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～ 490nm蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP 转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光 便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。 在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。 肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些
《生物工程进展》1997,V o l.17,N o.4 绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子 生物学研究领域的新标记物 岳莉莉 齐义鹏 (武汉大学病毒学研究所 武汉430072) 摘要 从多管水母属A equoren v ictu ria分离出的绿色荧光蛋白(GFP),因其特有的生物化学性质及该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广阔前景。本文就其研究进展及其应用进行简要综述。 关键词 GFP 荧光 基因表达 突变株 应用 基因的表达或蛋白质的定位及时序的变化常需要用荧光物质作为标记。这种标记也是免疫荧光和免疫组化的基础。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上,但是化学计量和染料附着的部位难于控制,因此尚需再次纯化。若该蛋白需用于活细胞内检测,最关键的问题是如何使其通过细胞膜。现在可用分子生物学的方法产生荧光蛋白,以取代传统的标记方法。常用的有荧火虫和细菌的荧光素酶基因,但由于它们都需要底物和辅助因子,因而在活体组织中的应用受到限制。由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质,且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。 一、绿色荧光蛋白的生物发光现象 早在六十年代初期,Sh i m om u ra等[1]首先从多管水母属(A equoria v ictoria)中分离出一种称为aequo ria的蛋白,该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光,当时称为光蛋白(p ho top ro tein)。它是分子量为20kD的单一多肽链,在其发光前,1M o l的aequo ria结合3M o l 的钙离子及1M o l非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋白体系本身发射蓝光,然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色,推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(green fluo rescen t p ro tein,GFP)[1,2]。M o rise 等[3]对GFP进行了分离和纯化,他们的实验结果表明,GFP的荧光发射峰在509nm,最大激发波长为395nm,并在475nm处有一肩峰。当将Ca2+加入到含低浓度GFP的aequo rin溶液中时,光谱接近于aequo rin发射的蓝光(Κm ax 472nm);而将aequo rin和GFP按大自然比例混合时,加入Ca2+,则光谱接近于活体的发射光(Κm ax509nm)。推测在活体内,GFP通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程,吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光。A equo rea发光系统分子间的能量转换过程如下: A equo rin Ca2+ B FP3+b lue L igh t GFP ↓ 激发 GFP3+ green ligh t (B FP为蓝色荧光蛋白) 二、GFP的生色基团 从jellyfish A equorea v icioria分离出的GFP分子量约27230kD,为一单链多肽,它的生色基团(ch rom opho re)在各种苛性条件下(如热、极端pH、化学变性剂)都很稳定,比如用
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展 一、关键词： 绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健 二、背景 2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。 三、GFP的主要性能 GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮。GFP的晶体结构是由11个β-折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋，发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心。蛋白的二级结构大部分为α-螺旋和β-折叠。GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 四、GFP的应用 1、酵母双杂交系统 原理： 将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。人们可用GFP直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用,因此GFP广泛使用于此技术。 利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取
1 前言 (3) 2 实验目的 (4) 3 实验设备 (4) 4 材料及试剂 (5) 5 实验操作步骤 (5) 5.1操作流程 (5) 5.2质粒DNA的分离与纯化 (6) 5.2.1 质粒的培养 (6) 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6) 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7) 5.3酶切及连接 (8) 5.3.1 双酶切 (8) 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8) 5.3.3 连接 (9) 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9) 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9) 5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (9) 5.4.3 转化涂板 (10) 5.5GFP蛋白的诱导表达 (10) 5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 1LB培养基的配制： (12) 2.溶液Ⅰ (12) 3.溶液Ⅱ (12) 4.溶液Ⅲ（100ML） (12) 5.DN ASE-FREE RN ASE A (13) 6.TE缓冲液（P H8.0） (13) 7.20×TBE (13) 8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13) 9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13) 10．P ET-28A质粒全图谱 (14)
实验五用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白 一、目的要求 1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术； 2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。 二、原理 pET 系统是有史以来在E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET 质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见I. F.部分)。如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的T7 RNA 聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。两种T7 启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。 三、试剂与器材 试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。 器材：摇床、显微镜等。 四、操作步骤 A、诱导 许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。 1. 对照菌和重组菌分别挑取1～2个菌落，接入1 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃培养过夜。 大肠杆菌在室温的生长速率比在37℃慢4倍，所以～20℃培养过夜（16 h）可能达不到饱和。但低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体。 2. 取400μl过夜培养物接入40 ml含氨苄青霉素（50μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2 h以上，至对数中期（A550=0.5～1.0）。