荧光分析法在生物领域的应用与进展
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摘要：本文综述了荧光分析法在生物领域的研究进展，其中包括检测细胞活性，测定生物样品，研究生物群落动态，研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用等，并展望了荧光分析法在生物领域的应用前景。
关键词：荧光分析法研究进展应用发展前景
0.引言
分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。它有如下特点：灵敏度高，选择性优于吸收光谱法，试样量小，操作简便，发光检测的灵敏度高，发光参数多。正是因为这些优点，荧光分析法在生物领域内获得了广泛的应用。
1.荧光分析法的发展状况
1.1近十年发展状况
近10年来，由于微量分析的需要迅速增加，灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增，内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展，应用遍及各个领域。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿，成为一种重要的仪器分析方法。
1.2荧光分析法在药物分析中被广泛应用
荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐，将荧光分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药物与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学等领域的痕量分析。
常规荧光分析法最早被应用与分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。为使荧光
分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，近年来，还发展了各种新型荧光分析技术，如激光诱导荧光法，同步荧光法等，这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。
2.荧光分析法的基本原理
2.1.荧光产生的机理
2.1.1分子的激发态—单重激发态和三重激发态
电子激发态的多重度：M=2s+1 （S为电子自旋量子数的代数和）
基态单重态：M=2s+1=1
激发单重态：M=2s+1=1
激发三重态：M=2s+1=3[1]
2.1.2分子的去活化过程
处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁或非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速率最快、激发态寿命最短的途径占优势。
2.2激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，既激发光谱和发射光谱。荧光的激发光谱和发射光谱是荧光物质的基本特征，他们是荧光定性和定量分析的基本参数和依据。
荧光光谱的特征：a.斯托克斯（Stokes）位移，b. 镜像规则，c.发射光谱的形状与激发波长无关
3.荧光分析法的注意事项
3.1荧光的减退
荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退。3.2试剂的浓度
有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试剂还有吸收荧光的作用，因此分析时所加试剂的量不可太多。
3.3 pH的影响
大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。
4.荧光分析法在生物领域的应用
4.1荧光分析法检测细胞活性
应用二乙酸荧光素(FDA)-溴化乙锭(EB)双染色同步荧光分光光度法测定细胞活性变化,灵敏度和特异性与普通荧光分光光度法相比较有所提高。方法：FD A-EB对已知比例的死、活细胞双染色,选择△入=40nm进行同步荧光扫描,与普通荧光分光光度法测定值进行比较。结果：该方法与通常的荧光法相比,灵敏度有较大提高,并能确定溶液中死、活细胞比例关系。结论：FDA-EB双染色同步荧光分光光度法可用于细胞活性变化的定性定量分析。[2] [3] [4]
4.2荧光分析法测定生物样品
通过电化学氧化肾上腺素，使其生成羟基吲哚类荧光物质(λem=490nm)，实现了药物中肾上腺素含量的电化学氧化-荧光检测。研究结果表明,荧光强度与肾上腺素浓度分别在2.00×10-7—1.00×10-6mol/L和1.00×10-6—4.00×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为6.70×10-8mol/L。该方法用于药物制剂中肾上腺素含量的测定，相对标准偏差小于1.88%(n=7)，加标回收率为88.4%—116.6%。[5] [6] [7] [8]
4.3荧光分析法研究生物群落动态
目前常用于分析色素浓度的分光光度法灵敏度较低，当样品中色素含量很低时，难以检出[9]。也有研究曾经采用了同步荧光法测定了海洋浮游植物的叶绿素[10]，但至今还未见用于湖泊底泥中色素分析的报道。Yuk等人应用高效液相色谱(HPLC)法分析了Baikal湖湖泊沉积物中的色素L，该方法检测限很低，灵敏度极高。但此法样品前处理过程较为复杂，且成本较高。而荧光分析法灵敏度较高，所需样品量少，更为简便、快速和经济。虽然蓝藻一般在夏季形成水华，但是认识藻类在底泥中初春的动态规律有助于了解水华形成的机理。以太湖梅梁湾地区的底泥为材料，利用荧光分析法测定藻蓝素含量，并用同步荧光分析法同时测定湖泊底泥中的叶绿素a、叶绿素b含量，目的是利用不同色素的定量分析来表征底泥中不同类群藻类的比例，为探讨不同季节底泥中水华蓝藻存在状态与春季蓝藻复苏以及随后水华发生的时空关系提供技术支持。4.4药物小分子与生物大分子的相互作用
4.4.1蛋白质与药物小分子的相互作用
研究小分子与生物大分子之间的相互作用，特别是具有生物活性的药物小分子与生物大分子的相互作用，有助于了解药物在体内的运输和分布情况，对阐明药物的作用机制、药代动力学及药物的毒副作用有重要意义。
Yuri Vll’ichev等研究了赭曲霉素与人血清白蛋白的相互作用，以及相互作用的结合位点数、赭曲霉素和其他酸性化合物与蛋白质的竞争性结合。潘祖亭等应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究了双嘧达莫[11]、盐酸多西环素[12]、甲苯咪唑[13]等药物与牛血清白蛋白的结合反应，并根据 Foster理论模型计算出给体与受体间的结合距离和一些物理化学、热力学参数，为研究药物与蛋白质结合作用提供了借鉴。
4.4.2核酸与药物小分子的相互作用
DNA和核糖核酸（RNA）是重要的遗传物质，也是某些药物作用的靶分子，研究DNA和RNA与小分子荧光探针及药物的相互作用有重要意义[14]。
应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究药物与DNA 相互作用的主要依据是，药物与 DNA作用后吸收光谱和荧光光谱发生了变化。但与蛋白质不同的是，DNA的吸收波长在260nm，而其荧光很弱，直接利用荧光光谱法研究药物与DNA的相互作用受到一定的限制。因此，在用荧光光谱法研究药物与DNA的作用时，一般要利用与之相互作用的药物的自身荧光，或者利用荧光探针试剂与DNA作用后产生的荧光。
核酸是当代新药发展的首选目标。李志良等[15]将荧光法用于抗癌药物的初步筛选。唐宏武等[16]根据吖啶橙可穿过完整的细胞膜并能用于细胞内DNA和RNA染色的特点，提出一种新的抗癌药物的筛选方法。袁小英等[17]用荧光法研究了环丙沙星与小牛胸腺DNA的结合反应，并利用所测的结合常数研究了铜(II）对环丙沙星和DNA相互作用的影响及其可能的机理。
5.荧光分析法的发展前景
随着科学的发展，生物分析已成为现代分析化学发展的最重要的前沿领域之一。为了适应这种形势的要求，众多分析化学工作者正在不断努力开发着新的方法和技术。纳米尺度上的生物分析化学就是其中的一个重要代表。纳米生物分析材料和器件及其在生物分析中的应用是当今国际分析科学领域的研究前沿及发展方向之一，是各国关注重视的研究热点。在生物医学及生命科学中应用最多的是分子光谱分析方法。其中由于荧光光谱的灵敏度高选择性好，因此对分子荧光方面的研究更是十分活跃。此外，随着药学学科的发展，人们对药
物分析的要求越来越高，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求。今后的发展方向是：探索并提出常规药物荧光分析新方法，与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器，发现和合成选择性优良的药物荧光试剂，与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息。
荧光探针作为研究生物大分子（如：核酸、蛋白质）的有力工具，在 20 世纪 90 年代取得了长足的进展，新的靶扩增技术（PCR）已日臻完善，发光标记探针也已经与放射性同位素标记具有同等重要的地位，而且已应用于 DNA 杂交研究、疾病诊断和食品微生物检测等方面。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色，DNA电泳，核酸分子杂交，定量 PCR 技术以及 D NA 测序上都有着广泛的应用前景。
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1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征) 。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： (1)形成单键的c电子；(2)形成双键的n电子；(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： (c)v(n)v( n) v(n * )v( c * ) c，冗是成键轨道，n是非键轨道， c* , n *是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含 有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。
紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的 横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A （吸光度）、T （透射比或透光率或透过率）、 1-T （吸收率）、?（吸收系数）中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置, 纵坐标为它的吸收强度。 250 A /nm 翠腔的紫外光谨图 四、紫外光 谱中常用的几个术语 1. 发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基团，不论是否显示颜色 都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（ C=C C=O N=N 、三键、苯环等） 200 300
第十二章荧光分析法（药学） 一、A型题 1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法（）。 A、荧光光度法 B、磷光光度法 C、化学发光法 D、X荧光光谱法 E、原子荧光光谱法 答案：A 2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。 A、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱 B、能发射荧光的物质比较少 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长 D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰 E、分子荧光分析线性范围更宽 答案：B 3荧光量子效率是指（）。 A、荧光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比 C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比 E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比 答案：B 4.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱
C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：C 5.荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为（）。 A、吸收光谱 B、激发光谱 C、荧光光谱 D、工作曲线 E、标准工作曲线 答案：B 6.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。 A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性 E、激发光的强度 答案：A 7.下列结构中荧光效率最高的物质是（）。 A、苯酚 B、苯 C、硝基苯 D、苯甲酸 E、碘苯 答案：A
8.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子 E、激发光强度增大 答案：D 9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比，必须使（）。 A、激发光足够强 B、吸光系数足够大 C、试液浓度足够稀 D、仪器灵敏度足够高 E、仪器选择性足够好 答案：C 10.在测定物质的荧光强度时，荧光标准溶液的作用是（）。 A、用做调整仪器的零点 B、用做参比溶液 C、用做定量标准 D、用做荧光测定的标度 E、以上都不是 答案：D 11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。 A、光源 B、光路 C、单色器 D、检测器
第十一章 荧光分析法 、选择题 1．荧光分析法是通过测定 ( ) 而达到对物质的定性或定量分析。 A 、激发光 D 、散射光 2．下面 ( )分析方法不属于分子发射光谱法。 3．荧光发射光谱含有 ( )个发射带。 A 、 1 B 、 2 C 、 3 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B 、 荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像 C 、 荧光光谱属于分子的受激发射光谱 D 、 荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是( ) A 、 荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应 B 、 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应 C 、 荧光光谱的形状与激发光波长无关 D 、 荧光波长大于激发光波长 6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激 发三重态， 再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级， 然后发出光辐射跃迁至基态的各个振 动能级，这种光辐射称为 ( )。 A 、分子荧光 B 、分子磷光 C 、瑞利散射光 D 、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是 ( )。 A 、振动弛豫只能在同一电子能级内进行 B 、振动弛豫属于无辐射跃迁 C 、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动 能级 D 、振动弛豫是产生 Stokes 位移的原因之一 8．荧光寿命指的是 ( )。 A 、 从激发光开始照射到发射荧光的时间 B 、 受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间 C 、 从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间 D 、 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间 9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是( ) A 、 具有长共轭的 n~ ；跃迁的物质具有较大的荧光效率 B 、 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大 C 、 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体 学习资料 D 、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同 10．采用下列 ( )措施可使物质的荧光效率提高。 学习资料 B 、磷光 C 、发射光 A 、紫外一可见分光光度法 C 、磷光分析法 B 、荧光分析法 D 、化学发光分析法 D 、不一定
分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
荧光分光光度法 一、 实验目的 1、学习荧光分光光度法的基本原理； 2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法； 3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。 二、 实验原理 荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS ）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。荧光（fluorescence ）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。由此可见，荧光是一种光致发光。 任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum ）和发射光谱（emission spectrum ）或称荧光光谱（fluorescence spectrum ）。激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。 荧光强度（F ）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即 该式即荧光分光光度法定量分析的依据。使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。 三、 仪器与试剂 F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL ）；牛血清白蛋白（BSA ） 四、 实验内容 1、 开机准备：接通电源，启动电脑。打开光谱仪主机电源，预热15分钟。 2、 运行FL solution 软件，设定检测方法和测量参数： EX （激发波长）：280nm EM （发射波长）：340nm EX 扫描范围：210nm ～330nm EM 扫描范围：290nm ～450nm EX 缝宽：2.5nm ，EM 缝宽：2.5nm 扫描速度：240nm/min PMT 电压：700V 3、 激发光谱和发射光谱的绘制： 先固定激发波长为280nm ，在290～450nm 测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm 附近为最大发射波长λem ；再固定发射波长为λem ，测定激发波长为200nm ～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm 附近为最大激发波长λex 。 4、 退出FL solution 软件，关闭光谱仪主机电源，关闭计算机。 Kc F
S2 S 1 S0 T1吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换振动弛豫 能量 l l l 3 外转换 l' 2 T2 内转换 振动弛豫 第一节荧光分析法的基本原理（2）
(二) 有机化合物分子结构(molecular structure)与荧光(fluorescence)的关系 1. 分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构：强的紫外-可见吸收； （2）具有一定的荧光效率。 2. 有机化合物的结构与荧光 (1）跃迁类型：π→ π*跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；
(2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移(3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 (4）取代基效应：芳环 上有供电基团，使荧光 增强。 综上所述：具有π→π*跃迁， 长的共轭结构，刚性平面以 及具有供电子基团的一类化 合物，有利于荧光的产生。
(三) 荧光试剂：为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。常用的荧光试剂有： 1 荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物； 2 邻苯二甲醛(OPA)： 3 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯）： 4 测定无机离子的荧光试剂：
三影响荧光强度的外部因素： 1.溶剂的影响：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强 而长移，荧光强度也增强。 2.温度的影响：荧光强度对温度变化很敏感，温度增加，外 转换去活的几率增加，使荧光效率和荧光强度降低。 3. 溶液pH：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格 控制； 4. 荧光熄灭剂：又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分 子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。 如果荧光熄灭强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系， 可以利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。
荧光分析法在生物领域的应用于发展摘要：本文对荧光分析法在检测细胞活性，测定生物样品，推断生物成虫日龄，研究生 物群落动态的应用与进展进行了综述与分析。并就其包含的不同方法进行一一介绍，展望了荧光分析法技术在生物领域中的应用前景。 关键词:荧光分析法生物领域应用发展 引言：利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光超过此限度即称为磷光。特点：灵敏度更高10-10-10-12g/ml，应用不如UV广泛。SO2分子受特定光照射后处于激发态的SO2分子返回基态时发出荧光, 其荧光强度与SO2呈线性关系, 从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后，荧光总光强I与SO2浓度的之间的关系可表示为：I=KC 在稳定的条件下，这些参数也随之确定，k可视为常数。因此，式I=kC 表示的紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。 荧光色谱法相关内容 1.荧光色谱法的近期发展状况 （1）近10年来,由于微量分析的需要迅速增加,灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增,内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展,应用遍及各个领域。荧光光谱图册也陆续出版,美国费城Sadtler研究实验室自1974年起出版标准荧光光谱图及各专用荧光光谱图(如药物)。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿,成为一种重要的仪器分析方法。 （2）荧光分析法在纳米生物分析中的应用巨大。纳米荧光探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的应用。对发光量子点、复合型荧光纳米粒子和具有光学活性的金属纳米粒子作为生物分子的标记探针取得了成果。 2.荧光分析法基本原理分子角度 分子的激发态，单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱,就是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征(即物质分子的能量具有不连续的特征)。一个分子有一系列能级,其中包括许多电子能级,分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱分子的紫外吸收光谱就是由于分子中价电子的跃迁而产生的,从化学键的性质上考虑,与电子光谱有关的主要就是三种电子: (1)形成单键的σ电子;(2)形成双键的π电子;(3) 分子中非键电子即n电子。 化合物不同,所含的价电子类型不同,所产生的电子跃迁类型不同,根据分子轨道理论,分子中这三种电子能级的高低次序大致就是: (σ)＜(π)＜(n)＜(π*)＜( σ* ) σ,π就是成键轨道,n 就是非键轨道,σ* ,π* 就是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动与转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级与转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图就是由横坐标、纵坐标与吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长,用nm(纳米)为单位。
纵坐标表示吸收光的吸收强度,可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置,纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语
1、发色基团与助色基团 发色基团:就是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团,不论就是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱与的基团都就是发色基团(C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等) 助色基团:指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团,但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波,同时使吸收强度增加。助色基团通常就是由含有孤对电子的元素所组成(-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等),这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度,从而使电子跃迁的能量下降。 2.红移、蓝移、增色效应与减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其她发色基团而产生结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向长波方向移动的现象称为红移。与此相反,如果吸收带的最大吸收波长向短波方向移动,则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响,使吸收带的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级与转动能级。分子吸收能量后,从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级(这一过程速度很快,大约10-15s),成为激发单重
荧光分析法测定维生素B2 一、实验目的 1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法; 2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法; 3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。 二、实验原理 当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。 实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。 图1.荧光分光光度计的结构原理图
荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。 荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。 荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。 定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。对同一物质而言,荧光强度F 与该物质的浓度c 有以下的关系: F = 2、303Фf I0 a b c ⑴ Фf－荧光过程的量子效率; a－荧光分子的吸收系数; I0－入射光强度; b－试液的吸收光程。 在I0 与b 不变时,2、303Фf I0 a b为常数,则⑴式可以表示为 F＝Kc ⑵ ⑵即可作为荧光定量检测的依据。 图2 VB2的结构式
荧光分析法 思考题和习题 1．如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？ 荧光：是某些物质吸收一定的紫外光或可见光后，基态分子跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫回到第一激发态的最低振动能级，在发射光子后，分子跃迁回基态的各个不同振动能级。这时分子发射的光称为荧光。荧光的波长比原来照射的紫外光的波长更长。 磷光：是有些物质的激发分子通过振动弛豫下降到第一激发态的最低振动能层后，经过体系间跨越至激发三重态的高振动能层上，再通过振动弛豫降至三重态的最低振动能层，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能层．这种光辐射称为磷光。磷光的波长比荧光更长。 瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时．不发生能量的交换，仅是光子运动的方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长和入射光相同。 拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换，使光于能量发生改变。当光子将部分能量转给物质分子时，光子能量减少，波长比入射光更长；当光子从物质分子得到能量时，光子能量增加，波氏比入射光为短。这两种光均称为拉曼光。 为了消除瑞利光散射的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行，并通过调节荧光计的狭缝宽度来消除 为消除拉曼光的影响可选择适当的溶剂和选用合适的激发光波长 2．何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？ 荧光效率又称荧光量子效率，是物质发射荧光的量子数和所吸收的激发光量子数的比值称，用Ψf表示。 以下分子结构的物质有较高的荧光效率： (1)长共轭结构：如含有芳香环或杂环的物质。 (2)分子的刚性和共平面性：分子的刚性和共平面性越大，荧光效率就越大，并且荧光波长产生长移。 (3)取代基：能增加分子的π电子共轭程度的取代基，常使荧光效率提高，荧光长移，如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等。 3．哪些因素会影响荧光波长和强度？ (1)温度：物质的荧光随温度降低而增强。 (2)溶剂：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有增强。溶剂如能与溶质分子形成稳定氢键，荧光强度减弱。 (3)pH：荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH对该荧光物质的荧光强度有较大影响。 (4)荧光熄灭剂：荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 (5)散射光的干扰：包括瑞利光和拉曼光对荧光测定有干扰。 4．请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法） 配位滴定：利用铝与EDTA的配位反应进行滴定分析，因铝与EDTA的反应速率比较缓慢，而且铝对指示剂有封蔽作用，因此铝的测定一般用EDTA作为标准溶液，返滴定法或置换滴定法测定。 仪器分析法：利作铝离子与有机试剂如桑色素组成能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以来测定铝离子的含量。另可采用原子吸收分光光度法或原子发射光谱法进行测定。
实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量五．数据处理 1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 苯丙氨酸的荧光光谱图 苯丙氨酸扫描激发波长在214nm和285m两处出现最高峰，本实验选择214nm为最大激发波长。此外，激发波长曲线在280－300nm处出现了一个十分完美的峰，此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证，如图，我们通过同步扫描荧光光谱技术获得的激发波长也在215nm，与之前基本吻合。 色氨酸的荧光光谱图
色氨酸扫描激发波长在217nm处有一个最大峰，所以激发波长为217，发射波长为361。发射波长曲线在450－460nm处出现了一个十分完美的峰（在这张图上没显示出来），此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证。 六．讨论与思考 1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？ 从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，根据我们得到的初步结果对仪器进行设置，然后对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。 2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？ 激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现以很强的峰，是倍频峰。不适合定量分析。 3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。 同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，提高对荧光性质相近化合物同时测定的选择性和灵敏度。同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱， 得到的峰比较窄，更明显。同步荧光光谱不是荧光物质的激发光谱和发射光谱
分子荧光光谱法实验报告范文 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，
使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。 三、实验试剂和仪器
荧光分析法在生物领域的应用与进展 班级：姓名：学号： 摘要：本文综述了荧光分析法在生物领域的研究进展，其中包括检测细胞活性，测定生物样品，研究生物群落动态，研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用等，并展望了荧光分析法在生物领域的应用前景。 关键词：荧光分析法研究进展应用发展前景 0.引言 分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。它有如下特点：灵敏度高，选择性优于吸收光谱法，试样量小，操作简便，发光检测的灵敏度高，发光参数多。正是因为这些优点，荧光分析法在生物领域内获得了广泛的应用。 1.荧光分析法的发展状况 1.1近十年发展状况 近10年来，由于微量分析的需要迅速增加，灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增，内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展，应用遍及各个领域。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿，成为一种重要的仪器分析方法。 1.2荧光分析法在药物分析中被广泛应用 荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐，将荧光分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药物与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学等领域的痕量分析。 常规荧光分析法最早被应用与分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。为使荧光
分子荧光光谱实验报告 篇一：分子荧光光谱实验报告 分子荧光光谱实验报告 一、实验目的： 1.掌握荧光光度法的基本原理及激发光谱、发射光谱的测定方法；学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性分析。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.了解影响荧光产生的几个主要因素。二、实验内容：测定荧光黄/水体系的激发光谱和发射光谱； 首先根据已知的激发波长（如果未知，则用紫外分光光度计进行测量，以最大吸收波长为激发波长）测定发射光谱，得到最大发射波长；然后根据最大发射波长测定激发光谱，得到最大激发波长；然后在根据最大激发波长测定测定发射光谱； 根据所得数据，用origin软件做出光谱图。三、实验原理： 某些物质吸收光子后，外层电子从基态跃迁至激发态，然后经辐射跃迁的方式返回基态，发射出一定波长的光辐射，此即光致发光。光致发光现象分荧光、磷光两种，分别对应单重激发态、三重激发态的辐射跃迁过程。本实验为荧光光谱的测定。
激发光谱：在发射波长一定的条件下，被测物吸收的荧光强度随激发波长的变化图。 发射光谱：在激发波长一定的条件下，被测物发射的荧光强度随发射波长的变化图。 各种物质均有其特征的最大激发波长和最大发射波长，因此，根据最大激发波长和最大发射波长，可以对某种物质进行定性的测定。 四、荧光光谱仪的基本机构 五、实验结果与讨论： XX00 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 150000 100000 50000 0Wavelength (nm) 400000 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 300000 XX00 100000 Wavelength (nm)
1、分子处于受激态后，去活化过程有哪些方式？分子荧光是如何发生的？ 处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余的能量而返回至基态。 无辐射跃迁（不是以光辐射的形式放出）： 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。只能在同一电子能级内进行。 内部能量转换：简称内转换。是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。 外部能量转换：简称外转换。是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。 体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。 辐射跃迁： 分子荧光：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 2、哪些物质容易发生电子由单线激发态到三线激发态的体系间跨越？ 含有重原子如碘、溴等的分子时，体系间跨越最为常见，原因是在高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。另外，在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。 3、如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？ 荧光：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。荧光波长总比激发光波长长。 磷光：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。磷光的波长比荧光更长。因为分子在激发三重态的寿命较长，所以磷光发射比荧光更迟。 瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长与入射光波长相同。 拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种散射光是拉曼光。 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。（P224） 4、如何测定激发光谱与荧光光谱？ 固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度与激发波长的关系曲线，即激发光谱，其形体与吸收光谱极为相似。 使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即荧光光谱。 5、何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？ 荧光效率，又称荧光量子产率，是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比。 共轭程度越大，分子的刚性越强，荧光效率越大。
荧光分析法在药物分析中的应用The Application of Fluorimetry in Pharmaceutical Analysis 摘要 药物分析主要应用在药物的质量控制、新药研究、药物代谢、体内药物分析等方面。荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、方法简便、重现性好、取样量少、仪器设备简单且不昂贵等特点,近年来被广泛地运用于各种药物制剂和生物体液中的药物分析工作中.本文对荧光分析法在药物分析中的应用现状及其进展进行了综述。 关键词药物分析；荧光分析法 ABSTRACT Pharmaceutical analysis mainly used in the quality control, research, metabolism, and drug analysis in vivo. Fluorescence analysis method with its high sensitivity, good selectivity, simple method, equipment simple and inexpensive, in recent years is widely used in various pharmaceutical formulations and biological fluids works. In this paper, we will illustrate the progress of the fluorescence analysis and the application of the method in pharmaceutical analysis. Key word: Pharmaceutical analysis, Fluorescence analysis
实验荧光光谱分析 一、实验目的与要求： 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理； 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样
荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。 关键词：荧光分析；环境分析；应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记
1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。