数据采集接口网关Gateway
ForeverCredit Gateway数据采集接口网关是北京华恒信远专门为工业标准通讯接口OPC Server软件、数据采集接口软件配套定制开发的一款嵌入式硬件产品，内置两个标准RS-232串口（其中一个串口可以通过跳线设置成RS-485）和两个RJ45以太网口，型号为Gateway-227B，如下图所示：
此外，还有Gateway-240B、Gateway-230B等嵌入式工控机型号，如下图所示。
该设备操作系统有Windows、Linux两种，其功能与特点如下：
1、OPC服务器：可连接DCS、PLC等控制系统，读写实时数据，包装成OPC Server工业标准通讯接口，提供给实时数据库系统、先进控制系统和MES系统集成商；
2、安全隔离：当数据采集接口网关为实时数据库系统提供实时数据时，它一般位于自动化控制系统和实时数据库服务器之间，因为数据采集接口网关采用了内置单向数据传输技术，可达到自动化控制系统和实时数据库服务器之间的安全隔离目的。
3、该产品操作系统、数据采集程序等均固化，不可修改。一旦被修改，重新启动后，自动恢复到初始状态，可防止病毒以及黑客软件攻击。
4、结构先进、安装方便，该产品高度1U，可以直接安装在
标准机柜中，独特的散热技术，1U机箱有多个磁悬浮风扇散热。
5、数据采集冗余设计：支持双机双网冗余通讯。
6、可作为InfoPlus.21、PI、PHD等实时数据库系统的数据采集终端，也可写数据至关系数据库，为MIS、ERP等管理信息系统提供生产实时数据。
网闸FC-Safety
FC-Safety管控单向物理隔离网闸，又称管控单向物理隔离网关，是专门为企业过程控制系统和管理信息系统之间进行单向物理隔离而开发的一款网络安全隔离设备。
在石油、石化、钢铁、冶金、电力、化工等流程型企业的工业自动化过程中，DCS、PLC、电力综合自动化等过程控制系统越来越广泛地应用在流程型企业的生产控制过程中。流程型企业信息化建设在国内越来越普及，因为担心控制网被攻击，企业往往要求企业信息化系统集成商将控制网和管理网络完全隔离。凭借雄厚的技术实力和丰富的项目经验，北京华恒信远为解决工业控制网和管理网络连接而带来的网络安全问题，研制了专门针对控制网络和管理网络连接保护的管控单向物理隔离网闸Safety，Safety只允许DCS控制网采集的数据流向管理网，不容许任何数据返回到控制网络。Safety已经成功地应用于电力、石化等大型国有企业。采用绝对安全的单向物理隔离技术解决了企业领导对企业信息化系统安全的担忧，获得极大的好评。
目前国内普通网闸产品很多，企业购买普通网闸应用企业信息化管控之间的进行安全隔离时，主要实现了限定IP及端口通讯，实质仍然进行双向TCP/IP通讯，与防火墙、三层交换机、路由器实现的功能类似；即使设置成单向，也是通过软件设置来实现，没有实现绝对单向物理隔离，并且如果普通网闸设备配置成单向通讯，网闸设备提供商一般不提供配套的数据采集及传输软件，需要系统集成商自己开发数据采集及传输软件，增加了系统集成商系统集成的难度；普通网闸主要功能是用于过滤不良的上网信息，主要应用于政府机关等各行各业，功能很多，并不是针对管控隔离专用，同事价格也特别昂贵，目前该类普通网闸产品在企业信息化的管理和控制网络之间的安全隔离应用不是很普及。
随着企业信息化在我国大中型企业的普及，企业信息化的管理和控制网络之间的安全隔离越来越得到了广大企业领导的重视，为此，研制了管控单向物理隔离网闸Safety，并且配套提供了实时数据穿透网闸的数据采集及传输相关软件，该设备安装位置有以下两种情况：
(a) DCS、PLC等控制系统和数据采集接口机之间；
(b)位于工业控制系统网络的实时数据库服务器和位于企业信息管理网络的实时数据库镜像服务器（或企业信息管理系统的关系数据库服务器）之间。
该设备的控制系统侧可以采集DCS等控制系统实时数据（通过OPC等协议），将实时数据通过绝对单向物理隔离传输到管理信息系统侧，重新包装成OPCServer，将实时数据提供给实时数据库系统。
该设备为双主机系统，采用专利网络隔离技术，从物理层彻底隔断外网与DCS网络的连接，保证了DCS等控制系统的安全，该设备支持OPC等工业标准通讯传输协议，数据吞吐量达到25000点/秒。
典型应用如下图所示：
管控单向物理隔离网闸又称数采安全防护网关，以下简称网关机，工作原理如下：
数采安全防护网关GatewayⅡ内置两台主机，从主机1到主机2是绝对单向物理隔离电路（网络），从物理层进行了隔离，信息只能从主机1单向传输到主机2，从根本上杜绝了病毒和恶意攻击。
该设备具体工作流程如下：主机1的一个以太网口连接DCS 系统，主机1运行OPC2Safety程序，OPC2Safety通过OPC协议从DCS系统获取的实时数据发送到绝对单向物理隔离电路上，如果DCS系统没有OPC Server软件，则可以在主机1上安装一套该DCS
系统的OPC Server软件，主机1和DCS系统之间可以通过TCP/IP 进行通讯。
主机2的一个以太网口连接实时数据库服务器，主机2运行OPC4Safety、CIM-IO For OPC两个程序，OPC4Safety从绝对单向物理隔离电路上接收到从主机1发送过来的DCS系统实时数据，包装成OPC Server，CIM-IO For OPC将OPC4Safety中的实时数据通过网络传输，并且写入实时数据库服务器中。
真正适用于工业SCADA的工业网络安全防护装置
支持标准SCADA通信协议传输的工业网络通信网关
力控工业网络安全防护网关pSafetyLink
关键特性：
双独立主机系统
专利网络隔离技术，彻底隔断外网与SCADA网络连接
支持标准SCADA通信传输协议：OPC、Modbus、DNP3等
每端多个10/100兆网口
高数据吞吐量，可达20,000TPS
支持远程配置及监视管理
测点级访问权限控制
简介：
在现代工业企业的信息系统中，由各种DCS、PLC、RTU、测控设备、SCADA构成的过程控制系统负责完成基本的生产控制。随着企业信息化的发展，迫切要求实现过程控制系统与上层管理信息系统之间互通、互联，消除信息孤岛。但是一旦信息网络与控制网络直接连通，就相当于将控制网络直接暴露给外网而面临被攻击、入侵的可能，甚至发生破坏生产的严重后果。
现有通用的网络安全产品要么无法实现彻底的网络阻断，存在着安全隐患；要么实现了网络阻断同时也阻断了各种标准SCADA通信协议的传输。
三维力控pSafetyLink系列网络隔离式工业通信网关专用于解决工业SCADA控制网络如何安全接入信息网络（外网）的问题。pSafetyLink内部为双独立主机架构，双主机之间采用专有网络隔离技术，彻底阻断任何网络形式的连接，同时pSafetyLink通过内嵌的高性能工业通信软件，支持各种主流工业SCADA通信标准，如：OPC、Modbus、DNP3等。
适用领域：
pSafetyLink适用于各种工业SCADA系统的网络安全防护
典型应用领域：
流程工业DCS控制系统的网络安全防护；υ
电力系统现场IED设备的网络安全防护；υ
轨道交通ISCS的网络安全防护；υ
煤矿、冶金行业现场控制系统的网络安全防护；υ
典型应用：
典型应用
１、基于OPC通信标准的MES应用
OPC标准因为其开放性和高效性，现在已被广泛应用于自动化控制领域及生产信息管理中。目前大多数DCS系统、SCADA系统对外都提供了OPC Server，以便为上层MES、生产调度等管理信息系统提供实时生产数据。同时几乎所有的MES系统、生产调度系统的采集接口也都提供了OPC Client以便能实现对OPC Server数据的采集。然而OPC Server与OPC Client的通信依赖过程控制系统网络与管理信息系统网络的直接连通。管理信息系统的网络出于业务需要一般要连接到互联网络，这样会对过程控制系统网络的安全带来极大的隐患。如果在这两种网络之间接入常规的网安产品，如：防火墙、隔离装置，要么网络没有彻底阻断，始终存在着安全隐患；要么因为网安产品自身的限制在阻断网络的同时也阻断了OPC通信。
pSafetyLink的双独立主机系统分为控制端和信息端，分别接入过程控制系统网络和管理信息系统网络，各自完成与OPC Server和OPC Client的通信，同时两主机之间采用PSL专用网络隔离技术，在保证OPC数据快速交互的同时彻底阻断了网络的连接，保证了过程控制系统网络的安全。
２、基于Modbus、DNP3等通信规约的调度自动化应用
Modbus是基于PLC的一组通信协议。它已经成为行业内互相通信的标准协议，也是目前最常用的工业系统电子设备之间的连接方式。DNP3.0(分布式网络协议)是使用在工序自动化系统各部件之间的通信协议规约。它主要用于像电力、水力等公用事业单位。此外，它的发展使得不同形式的数据获取与控制设备之间的交流更为便利。
调度自动化系统的后台为了实时获取现场设备的数据，经常需要通过网络使用Modbus、DNP3等通信规约进行数据传输。然而调度数据网络与现场控制设备的直接连通，就相当于将控制系统直接暴露给外网而面临被攻击的可能。互联网攻击者可能会利用一些大型项目自动化软件的安全漏洞获取诸如发电厂、污水处理厂、天然气管道以及其他大型设备的控制权，一旦这些控制权被不良意图黑客所掌握，那么后果不堪设想。因为生产控制网络中的计算机可以控制诸如发电机组、化学反应釜、供水管阀门、烘干设备器材甚至核电站的安全
系统等大型项目化设备。黑客一旦控制该系统，就意味着可能利用被感染的控制中心系统切断整个城市的供电系统，恶意污染饮用水甚至是破坏核电站的正常运行。随着近些年来越来越多的项目系统内部网络接入到互联网当中，这种可能就越来越大。
虽然很多隔离装置(也称网闸)通过强制完全单向通讯方式，控制数据长度等方法阻断网络连接，但同时也限制了Modbus、DNP3等所有标准通信规约，用户须针对隔离装置重新定制开发特殊通信接口，给信息集成带来了额外成本和困难。
pSafetyLink内嵌高性能工业通信软件，支持Modbus、DNP3等标准通信规约，可以实现调度自动化后台系统与现场设备的实时通信，并根据需要可设置数据方向。当设置为单向方式时，后台系统的所有数据回置操作将被屏蔽，以保证现场控制设备的安全。
产品说明：
系统架构
pSafetyLink内部两端由两个独立主机系统组成，每个主机系统分别具有独立的运算单元和存储单元，各自运行独立的操作系统和应用系统。其中一端的主机系统为控制端，负责接入到SCADA控制网络；另一端为信息端，负责接入到信息网络（外网）。控制端与信息端主机分别运行专用高性能工业通信软件。控制端提供各种标准
SCADA通信标准的客户端或主端通信功能，如：OPC Client、Modbus Master，实现对SCADA系统的接入与通信；信息端主机提供服务器端或从端通信功能，如：OPC Server、Modbus Slave，实现与各种远程后台系统、数据中心系统、数据库系统的接入和数据交互。
网络隔离技术
pSafetyLink的控制端与信息端主机之间采用专有的PSL网络隔离传输技术。PSL的物理层采用专用隔离硬件，链路层和应用层采用私有通信协议，加密传输方式。
PSL技术通过物理隔离与专有隔离传输技术，实现了数据完全自我定义、自我解析、自我审查，传输机制具有彻底不可攻击性，从根本上杜绝了非法数据的通过，确保控制端不会受到攻击、侵入。
SCADA通信标准
控制端：
OPCλClient（支持OPC DA1.0,DA 2.0,DA3.0,AE1.0）；Modbus Master、IEC60870-5-104λMaster、DNP3.0 Master 等；
支持自定义通信协议扩展；λ
信息端：
OPCλServer；
Modbus Slave、IEC60870-5-104 Slave、DNP3.0λSlave等；
支持自定义通信协议扩展；λ
系统特点
提供远程配置及监视工具，可在线监测通信报文；λ支持从通道到设备到测点的三级测点树管理；λ
具备看门狗管理、系统在线自诊断/复位功能；λ
具有对通信链路状态的监视和报警功能；λ
具有完备的诊断调试、故障监视、日志输出等功能；λ具备二次计算功能；λ
性能指标
数据吞吐量：20,000λ点/秒；
单机额定连接数：控制端512个，信息端512个；λ
Gateway克隆技术，简单易操作 在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。 Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。 即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。GeneCopoeia的EZShuttle?重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。 BP反应-构建入门载体： 通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020
LR反应-构建表达载体： 制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020
物联网智能网关工业采集网关数据采集网关的功能及应用方案 文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]
物联网智能网关、工业采集网关、数据采集网关的功能及应用方案 无线通讯网关，亦称数据采集网关，数据采集、协议转换网关，工业采集网关，可采用GPRS，433，，,wifi及以太网等多种通讯方式，快速实现近距离、中远程数据采集传输，适用于工业、农业、建筑、环保、医疗、运输等领域。目前，比较常用的工业智能网关主要包括XL91智能网关和XL90智能网关。 一、XL91智能网关，也叫无线网关，工业物联网智能网关，，无线传感管理主机等，集通讯管理、数据接收、协议转换、数据处理转发等功能，支持手机现场调试的，属于无线传感器网络产品。 XL91智能网关，可同时接收多个无线传感器数据，支持1路以太网口（Ethernet）、1路RS485串口、无线传输等上行方式，可选GPRS，433MHZ，，WI-FI等无线传输方式。 特点： 1、XL91适用于构建小容量的传感网络； 2、读取、处理、转发传感节点的数据：通讯管理、协议转换、数据处理、数据转发； 3、提供用户要求的协议； 4、1路或490MHz，组成星型或MESH型的网络； 5、可提供用户要求的协议； 构建小型智能传感网络； 协调、管理传感网络节点通讯；
智能传感网络和外部网络枢纽和桥梁：通讯网络转换、通信协议转换；拓扑图如下↓ XL91物联网智能网关应用领域： 1、油田、油井、气田监测； 2、蒸汽管道、供暖管道监测； 3、水泵房的监测； 4、冷藏、仓储环境监测； 5、农业、养殖环境监测。 XL91物联网智能网关应用方案一：拓扑图如下↓ 1、构建小型智能传感网络； 2、传感网络和外部网络的网络转换和协议转换设备。 3、通过433MHz、无线方式读取传感节点的数据； 4、通过GPRS方式将数据上传至云服务器； 5、可在现场加装触摸屏，用于现场监视； 6、能源管理系统（EMS）：采集局部传感接点的数据上传。 XL91物联网智能网关应用方案二：拓扑图如下↓ 1、构建小型智能传感网络； 2、传感网络和外部网络的网络转换和协议转换设备。 3、通过433MHz、无线方式读取传感节点的数据； 4、通过Ethernet将数据上传至监控计算机； 5、DCS系统：采集压力、温度、气体等节点数据，通过Ethernet、RS485上传至DCS；
基于Gateway技术的表达载体构建 1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应 pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。 该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。 pGWC载体的酶切反应体系如下： pGWC 10 μl（约2μg） 10×Eam1105 I Buffer 5 μl Eam1105 I 2 μl ddH2O 34 μl 共计 50 μl 将反应混和液于37℃温育6h。取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。 2. PCR产物的回收与连接反应 PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。 DNA片段与pGWC-T的连接： pGWC-T 1μl（约50ng） DNA回收片段 4μl（600bp片段约需40ng） Solution I （TaKaRa） 5μl 共计 10μl 反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。 3. 连接产物的转化 取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。 4. LR反应与表达载体构建 表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（Entry
分布式数据采集系统中的时钟同步[图] 在高速数据传输的分布式数据采集系统中，各个组成单元间的时钟同步是保证系统正常工作的关键。由于系统工作于局域网，于是借鉴了IEEE1588时钟同步协议的原理，设计出简易、高效的时钟同步方案，并在基于局域网的分布式数据采集系统中实现微秒级的精确同步。鉴于方案的高可行性和高效性，可将其推广到其他分布式局域网系统中。 引言 随着网络技术的发展，各种分布式的网络和局域网都得到了广泛的应用[1]。分布式数据采集系统广泛应用于船舶、飞机等采集数据多、实时性要求较高的地方。同步采集是这类分布式数据采集系统的一个重要要求，数据采集的实时性、准确性和系统的高效性都要求系统能进行实时数据通信。因此，分布式数据采集系统中的一个关键技术就是实现数据的同步传输。由于产生时钟的晶振具有频率漂移的特性，故对于具有多个采集终端的分布式系统，如果仅仅在系统启动时进行一次同步，数据的同步传输将会随着系统运行时间的增长而失步。因此时钟的同步就是保证数据同步传输的关键所在。2002年提出的IEEE1588标准旨在解决网络的时钟同步问题。它制定了将分散在测量和控制系统内的分离节点上独立运行的时钟，同步到一个高精度和高准确度时钟上的协议。 由于分布式数据采集系统工作于局域网的环境中，于是借鉴IEEE1588标准中的思想，设计出一种针对基于局域网的分布式系统的时钟同步的机制，成功地在分布式数据采集系统中实现了μs级的同步。 1 时钟同步原理及实现 时钟同步原理借鉴了IEEE1588协议中的同步原理。IEEE1588 定义了一个在工业自动化系统中的精确同步时钟协议(PTP 协议)，该协议与网络交流、本地计算和分配对象有关。IEEE1588 时钟协议规定，在进行时钟同步时,先由主设备通过多播形式发出时钟同步报文,所有与主设备在同一个域中的设备都将收到该同步报文。从设备收到同步报文后,根据同步报文中的时间戳和主时钟到从时钟的线路延时计算出与主时钟的偏差,对本地的时钟进行调整[2]。 系统由各个单元的系统控制板（简称“系统板”）来完成同步的工作。同步模型与IEEE1588时钟协议一致，采用主从结构。主从单元采用相同频率的晶振，此时时钟同步的关键就是解决时钟相位对准问题和时钟漂移的问题。 系统中采用的时间同步算法，是借鉴IEEE1588的同步原理，主要是采用约定固定周期同步的算法。和IEEE1588同步算法一样，同步过程分为两个阶段: 延迟测量阶段和偏移测量阶段。下面以一主一从模式为例介绍其原理。 1.1 延迟测量 延迟测量阶段用来测量网络传输造成的延迟时间[3]。定义一个延迟请求信息包(Delay Request Packet) ,简称“Delay_Req”。延迟测量示意图。 图1 延迟测量示意图 为了简化程序，采用固定的周期测量网络延迟，一般系统每工作一个小时进行一次测量。从属时钟TSd 时刻发出延迟请求信息包Delay_Req ,主时钟收到Delay_ Req 后再立刻返回一个延时响应包delay_back发送给从属时钟,因此从属时钟就可以非常准确地计算出网络延时: TM2 →TS2∶Delay1 = TS2-Offset-TM2 TS3 →TM3∶Delay2 = TM3-(TS3 - Offset) 其中的Offset为从时钟与主时钟之间的时间偏差。 因为网络延迟时间是对称相等的,所以: Delay =（Delay1 + Delay2）/2=（（TS2-TM2）+（TM3-TS3））/2 需要说明的是,在这个测量过程中,假设传输介质是对称均匀的，且线路是对称的[4]。
数据采集接口网关Gateway ForeverCredit Gateway数据采集接口网关是北京华恒信远专门为工业标准通讯接口OPC Server软件、数据采集接口软件配套定制开发的一款嵌入式硬件产品，内置两个标准RS-232串口（其中一个串口可以通过跳线设置成RS-485）和两个RJ45以太网口，型号为Gateway-227B，如下图所示： 此外，还有Gateway-240B、Gateway-230B等嵌入式工控机型号，如下图所示。 该设备操作系统有Windows、Linux两种，其功能与特点如下： 1、OPC服务器：可连接DCS、PLC等控制系统，读写实时数据，包装成OPC Server工业标准通讯接口，提供给实时数据库系统、先进控制系统和MES系统集成商； 2、安全隔离：当数据采集接口网关为实时数据库系统提供实时数据时，它一般位于自动化控制系统和实时数据库服务器之间，由于数据采集接口网关采用了内置单向数据传输技术，可达到自动化控制系统和实时数据库服务器之间的安全隔离目的。 3、该产品操作系统、数据采集程序等均固化，不可修改。一旦被修改，重新启动后，自动恢复到初始状态，可防止病毒以及黑客软件攻击。 4、结构先进、安装方便，该产品高度1U，可以直接安装在
标准机柜中，独特的散热技术，1U机箱有多个磁悬浮风扇散热。 5、数据采集冗余设计：支持双机双网冗余通讯。 6、可作为、PI、PHD等实时数据库系统的数据采集终端，也可写数据至关系数据库，为MIS、ERP等管理信息系统提供生产实时数据。 网闸FC-Safety FC-Safety管控单向物理隔离网闸，又称管控单向物理隔离网关，是专门为企业过程控制系统和管理信息系统之间进行单向物理隔离而开发的一款网络安全隔离设备。 在石油、石化、钢铁、冶金、电力、化工等流程型企业的工业自动化过程中，DCS、PLC、电力综合自动化等过程控制系统越来越广泛地应用在流程型企业的生产控制过程中。流程型企业信息化建设在国内越来越普及，由于担心控制网被攻击，企业往往要求企业信息
Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆就是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1与att L2两个侧端重组序列,来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”(Gateway Entry Clone)。据Invitrogen宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应,如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法,避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性,大大提高了克隆效率,常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体,因此又称之为高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology)。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点与重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。 Gateway的原理就是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体与细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点与大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL与attR。这就是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis与IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB与attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来(见图1)。这一过程的方向就是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白与重组位点。
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 图1 Gateway技术的灵活性 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。 Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内
切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。 二、一项强大而可靠的技术 Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 图2 Gateway技术总结 下载 (22.19 KB) 6 天前 19:23 Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
本技术涉及信息采集领域，具体涉及基于wifi的数据采集网关，包括用于数据采集的数据采集装置、用于对采集的数据进行处理的处理装置、用于进行远程控制的远程控制终端、用于处理装置与远程控制终端通讯的通讯装置。本技术数据处理能力强、采集精度高、时效性强、运行成本低、便于大规模推广使用。 技术要求 1.基于wifi的数据采集网关，其特征在于：包括用于数据采集的数据采集装置、用于对采集的数据进行处理的处理装置、用于进行远程控制的远程控制终端、用于处理装置与远 程控制终端通讯的通讯装置；所述通讯装置包括wifi信号放大器和wifi无线路由器；所述 处理装置包括用于数据采集装置输入数据的输入接口、连接于输入接口用于储存数据的 储存单元、连接于储存单元用于处理数据的处理单元、连接于处理单元用于向通讯装置 进行数据输出的输出接口、连接于处理单元用于接收通信装置反馈信号的远程信号接 口；所述处理装置的输出接口与wifi无线路由器的信号输入端之间通过wifi无线连接，所 述wifi无线路由器的信号输出端与wifi信号放大器的信号输入端之间通过wifi无线连接，所述wifi信号放大器的信号输出端与处理装置的远程信号接口连接，所述wifi无线路由器的 远程通信端与远程控制终端之间通过互联网连接。
2.根据权利要求1所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述数据采集装置包括数字量输入接口电路装置、模拟量输入接口电路装置、RS485输入装置、RS232输入装置、视频输入装置和时钟装置，所述视频输入装置前端连接用于采集图像的摄像头，所述数字量输入接口电路装置前端连接有用于采集电压的电压传感器、用于采集电流的电流传感器，所述模拟量输入接口电路装置前端连接有用于采集温度信息的温度传感器、用于采集湿度信息的湿度传感器，所述RS485输入装置前端连接有用于采集振动信息的振动传感器，所述RS232输入装置前端连接有用于进行条码扫描的条码传感器、用于进行二维码扫描的二维码传感器，所述时钟装置连接于处理装置以提供实时时钟信号。 3.根据权利要求2所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述wifi无线路由器包括供电模块、CPU模块、4G模块和wifi模块，所述供电模块连接于CPU模块、4G模块和wifi 模块以供电；所述CPU模块通过PCI连接于4G模块，所述4G模块与广域网络通信；所述CPU模块与WIFI模块连接，将4G模块从广域网络接收或者发送的信息转换后通过WIFI模块无线转发。 4.根据权利要求3所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述wifi信号放大器包括wifi模拟信号解调模块、数字信号处理模块、wifi数字信号调制模块和wifi模拟信号放大模块，所述wifi模拟信号解调模块与所述数字信号处理模块相连，所述数字信号处理模块与所述wifi数字信号调制模块相连，所述wifi数字信号调制模块与所述wifi模拟信号放大模块相连。 5.根据权利要求4所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述wifi模拟信号放大模块为线性放大器，所述wifi模拟信号放大模块为RF2126芯片。 6.根据权利要求5所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述远程控制终端为PC 机或手机或PAD，所述远程控制终端包括用于收集服务器反馈信息的信息收集单元、用于进行远程控制的控制单元、用于启动系统的启动单元，所述启动单元内部嵌设有指纹加密协议以及指纹解密协议。 7.根据权利要求6所述的基于wifi的数据采集网关，其特征在于：所述处理装置为实体处理器或云服务器。
Gateway? Cloning Protocols The Basics of Gateway? Reaction ?BP reaction—to create a Gateway? entry clone ?LR reaction—to create a Gateway? expression clone ?One tube format—to create a Gateway? expression clone from a PCR product ?Gateway? Vector Conversion—converting your favorite cloning vectors to Gateway? Technology TOPO? TA Cloning - To Create a Gateway? Entry Clone Step One - Produce PCR product Produce PCR products using Taq polymerase and your own protocol. End the PCR reaction with a final 7 to 30 minute extension step. Step Two - Perform the TOPO? Cloning Reaction 1. Set up one of the following TOPO? Cloning reactions using the reagents in the order shown. For electroporation, dilute Salt Solution 4-fold to prepare Dilute Salt Solution. Reagent Chemical Txn Electroporation Fresh PCR product0.5 to 4 μl0.5 to 4 μl Salt Solution 1 μl-- Dilute Salt Solution -- 1 μl Sterile Water to a final volume of 5 μl to a final volume of 5 μl TOPO? Vector 1 μl 1 μl Total volume6μl6μl 2. Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature. 3. Place on ice and proceed to transform One Shot? chemically competent E. coli, below
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邮局订阅号：82-946360元/年技术创新 数采与监测 《PLC 技术应用200例》 您的论文得到两院院士关注 时间同步在分布式数据采集系统中的实现 The Implementation of the time synchronization in the distributed data collection system (空军工程大学) 徐锋樊晓光刘东 XU Feng FAN Xiao-guang LIU Dong 摘要:文中介绍了分布式数据采集系统中精确时间同步的实现方法以及相应的测试结果。该设计方案以IEEE1588标准中的精确时间协议(PTP)为基础,通过使用美国国家半导体公司生产的以太网物理层控制芯片DP83640,使得采用以太网架构的分布式数据采集系统主从节点上的时钟达到精确的时间同步。关键词:精确时间同步;IEEE1588;DP83640中图分类号:TP393文献标识码:A Abstract:The implementation of precise time synchronization in the distributed data collection system and test results is illuminated in this article.By use of DP83640Ethernet PHYTER produced by the National Semiconductor corporation,the design is based on the Precise Time Protocol (PTP)of the IEEE1588standard,and finally implemented the precise time synchronization between the master clock and slave clocks of the distributed data collection system based on standard Ethernet.Key words:precise time synchronization;IEEE1588;DP83640 文章编号:1008-0570(2009)11-1-0091-02 1引言 分布式数据采集系统广泛应用于采集数据多、实时性要求 较高的现场测控领域。 因此,分布式数据采集系统中的一个关键技术就是实现数据的同步传输。但由于网络传输延迟以及晶振频率漂移的原因,如果仅仅在系统启动时进行一次同步,状态数据的同步传输将会随着系统运行时间的增长而失步,因而不能够对系统的全局状态获得准确的掌握。 随着以太网技术逐渐应用于工业自动化测控领域,2002年国际电气和电子工程师协会(IEEE)发布了IEEE1588标准,该标准中的精确时间协议(Precise Time Protocol,简称PTP 协议)定义了一个以太网模式下的时间同步协议,主要应用在分布式测量和控制系统中,目的是提高工业以太网的实时性,使运行于各个独立测控节点上的时钟在系统范围内达到一个较高的同步精度。 本文以IEEE1588标准中的PTP 协议为基础,通过使用以太网物理层控制芯片DP83640,在分布式数据采集系统中实现了精确的时间同步。 2分布式数据采集系统概述 图1分布式数据采集系统结构图 分布式数据采集是带传感器的多个微计算机节点借助现 场总线或工业以太网连接在一起的分布式工业测控系统。传感器采用输出温度、压力、流量、位移等模拟量,再通过模数转换所生成数字量并由微计算机独立地进行处理,最后将局部的处理结果传输到总控单元上进行集中分析处理并得出全局状态的实时信息。拓扑结构如图1所示。 3IEEE1588标准和PTP 协议概述 IEEE1588标准的技术基础最初来源于安捷伦公司,是由安捷伦实验室的John C.Edison 以及来自其它公司和组织的12名成员共同研究的。经过多次修改后于2002年由国际电气和电子工程师协会(IEEE)正式发布。IEEE1588标准全称是:网络测量和控制系统的精密时钟同步协议标准。它定义一种在分布式测量和控制系统中实现高精度时钟同步的精确时间协议PTP 。该协议能够在所有支持多播的网络上实现,特别适合于以太网,但并不局限于以太网,目的是使分布式网络中的所有时钟保持精确的同步。 PTP 协议是一个关于时钟同步的协议标准,它被应用于由多个节点组成的分布式系统中,在系统中每个节点代表一个独立运行的时钟。PTP 协议将整个网络内的时钟分为普通时钟(ordinary clock)和边界时钟(boundary clock),而从通信关系上看又可把时钟分为主时钟(master clock)和从时钟(slave clock),整个系统中的最优时钟为最高主时钟(grandmaster clock),系统只能有一个最高主时钟,而一个PTP 协议的通信子网中只能有一个主时钟,从时钟与主时钟保持同步。 PTP 协议在现有的UDP/IP 协议基础之上实现局域网架构内的时钟同步,有关同步信息的协议报文共有4种,分别是:同步报文Sync,跟随报文Follow_up,延迟请求报文Delay_req,延迟应答报文Delay_Resp 。 PTP 协议的同步过程分为两个阶段:偏移(offset)测量阶段和延迟(Delay)测量阶段。 偏移阶段的工作是修正主时钟和从时钟之间的时间偏差。 徐锋:硕士研究生 91--
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910362059.8 (22)申请日 2019.04.30 (71)申请人 广东侍卫长北斗科技股份公司 地址 528300 广东省佛山市顺德区杏坛镇 德富路68号军民融合产业园11楼 (72)发明人 袁泽宇 庄福业 邓维爱 彭文斌 (74)专利代理机构 长沙科明知识产权代理事务 所(普通合伙) 43203 代理人 陈靖 (51)Int.Cl. H04L 29/06(2006.01) (54)发明名称 一种多协议北斗数据采集的网关通信交互 服务方法 (57)摘要 本发明提供一种多协议北斗数据采集的网 关通信交互服务方法，各不同厂商生产的设备将 二进制信息传输至对应的协议解析服务项目，各 个项目根据各自的厂商协议将二进制信息解析 成可读的信息，存入同一个mongo数据库中，平台 获取数据时只需与gRPC功能模块通讯，让gRPC模 块于mongo数据库中查出需要的信息，展示在平 台上，实现了协议和数据的解耦，消去了设备协 议对平台获取定位数据的影响，可扩展性强，硬 件不制约业务扩展；当要接入新设备时，只需建 立新协议服务便可让设备在系统中运作，省去了 建新平台的时间。上层出入口唯一，方便记录管 理。权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 110138755 A 2019.08.16 C N 110138755 A
权 利 要 求 书1/1页CN 110138755 A 1.一种多协议北斗数据采集的网关通信交互服务方法，其特征在于包括如下步骤： S1：车载定位设备将信息上传至北斗数据平台； S2：北斗数据平台对数据处理后进行指令下发。 2.根据权利要求1所述的一种多协议北斗数据采集的网关通信交互服务方法，其特征在于：在S1中，各不同厂商生产的设备将二进制信息传输至对应的协议解析服务项目，各个项目根据各自的厂商协议将二进制信息解析成可读的信息，存入同一个mongo数据库中，平台获取数据时只需与gRPC功能模块通讯，让gRPC模块于mongo数据库中查出需要的信息，展示在平台上，实现了协议和数据的解耦，消去了设备协议对平台获取定位数据的影响。 3.根据权利要求1所述的一种多协议北斗数据采集的网关通信交互服务方法，其特征在于：在S2中，平台按照预整理的设备类型对应指令格式表向gRPC发送指令请求，gRPC将请求存入mysql数据库中，当指令的目标设备上线时，对应的协议解析服务项目从数据库中取得该指令的下发请求，将该条指令按照协议转为二进制编码发送给设备，同时修改该条指令状态为已发送，以供平台查询下发结果，平台不用关心指令是否传至对应的协议解析服务项目或是否成功解析，只需通过gRPC查询下发结果，削弱了协议和平台下发指令的耦合性。 4.根据权利要求2所述的一种多协议北斗数据采集的网关通信交互服务方法，其特征在于：利用gRPC对外提供数据接口，直接读取mongo数据库中由协议解析服务解析出来的设备信息,同时向外提供以下功能:获取设备最新的定位和状态，获取设备历史轨迹，设置报警规则，下发设备指令等，外部的操作都经由gRPC功能模块进入系统。 5.根据权利要求1所述的一种多协议北斗数据采集的网关通信交互服务方法，其特征在于：在S2中，平台将预设的指令码和参数传入gRPC功能模块中，gRPC将其写入指令表中，协议网关根据上线的设备来搜索这张指令表中未下发的对应设备的指令，如果搜到了就解析为字节流推送，并将指令状态改为发送成功,如果该种设备不支持该指令，则将指令状态修改为未推送。 2
Gateway?技术提供以下可能： ?通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 ?将您的基因转入到多个表达系统 ?在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 Gateway?技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。 这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的 克隆效率高达95％或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时， 还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway?也有助于进行带不同数目纯化和 检测标签的表达。 Gateway?利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway?改造过的的各种表达载体（目的载体）。 此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway?技术的灵活性 *目的基因克隆进入门载体后， 可以同时转移目的基因到多个目的载体。 一种强大而可靠的技术 Gateway?技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway?技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway?技术（表1和图2）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 Gateway?技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。典型的效率是＞95％。需要了解更多的有关ccdB的信息，请
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
第一章数据采集与监控系统 第一节数据采集系统的基本结构 近年来，世界各国的火力发电设备发展方向是采用高参数大容量的单元式机组。机组容量越大，热力系统越复杂，需要监视的参数和操作的对象也就越多。特别是在机组的启停和事故处理过程中，机组处于不稳定的状态下工作，各种参数不断迅速变化，在同一瞬间需要同时进行几个参数的监视和操作，甚至有时要求运行人员在几分钟内完成几十个操作动作，稍有贻误就容易造成重大事故。以一台300MW机组为例，它需要监视的项目在900～1100点左右，如此多的数据如果用常规仪表去监视和测量，无论是在设计还是在运行上都有相当大的困难，一方面将使控制盘的尺寸大幅度增加，另一方面会给运行人员的监盘造成极大困难，劳动强度大，更易造成误操作，直接威协机组的安全运行。为了改变这一状况，在国内外大型火力发电机组上都广泛采用计算机对生产过程进行监视和测量，该计算机系统一般称为数据采集系统(Data Acquisition System 简称DAS)，或者将其称为计算机安全监视系统、计算机信息处理系统、数据采集监视和处理系统等。 计算机数据采集系统，可采用小型机、单台微型机、或多台微型机构成。 一、小型计算机数据采集系统 以小型计算机构成的典型数据采集系统如图6-1所示。 小型计算机数据采集系统采用双总线式结构，即内存总线与I/O总线分开。系统中所有的过程变量经过程通道连接在I/O总线上，其中包括各种模拟量输入、开关量输入、脉冲量输入、模拟量输出、开关量输出等。在I/O总线上还挂有专用接口，用以连接其它计算机装置或系统。在I/O总线上挂有硬盘驱动器，用以存贮操作系统、各种文件及数据。磁盘由专门的文件管理系统进行管理。主要人机联系设备有：运行人员操作台、工程师操作台和程序员操作台，亦挂在I/O总线上。 由小型计算机构成的数据采集系统具有以下特点： （1）由于小型机一般设有专门的I/O总线和I/O处理机，所以它与外部或外围设备交换的信息可以由I/O处理机进行处理，这样就可以加快I/O处理的速度和提高外设与主机之间工作的并行程度。 （2）小型计算机具有较高的运算速度和处理能力，可以进行大量的、复杂的运算和数
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程
实验方案 Gateway? 反应的基本原理 ?BP反应—构建Gatew ay? 入门克隆 ?LR 反应—构建Gatew ay? 表达克隆 ?一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay? 表达克隆 ?Gatew ay? 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay? 载体 TOPO? TA 克隆- 创建Gateway? 入门克隆 ? ?步骤一–制备PCR 产物 使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。通过 最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。 步骤二- 进行TOPO? 克隆反应 1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO? 克隆 反应。对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释 盐溶液。 试剂化学转染电穿孔法 新鲜的PCR 产物0.5 至 4 μl 0.5 至 4 μl 盐溶液 1 μl -- 稀释盐溶液-- 1 μl 无菌水至终体积为 5 μl 至终体积为 5 μl TOPO? 载体 1 μl 1 μl 总体积 6 μl 6 μl ? 2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。 3. 置于冰上，然后开始转化One Shot? 化学感受态 E. coli，步骤如下 步骤三- 转化One Shot? 化学感受态E. coli 1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot? E. coli 细胞。 2. 在一小瓶One Shot? 化学感受态E. coli 中加入 2 μl TOPO? 克隆反应液， 轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。 4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。立即 将试管转移至冰上。 5. 加入250 μl 室温S.O.C. 培养基。 6. 在37°C 下振荡孵育 1 小时。 7. 在预热的LB 琼脂平板上涂布10-50 μl 细菌培养物（琼脂平板含有 100 μg/ml 大观霉素），并于37°C 下过夜孵育。 Gateway? 反应的基础知识 ? ? ? ?BP 反应 从含有att B 侧翼序列的PCR 产物到生成Gatew ay? 入门克隆只需 1 小时的简单反应。参见下文的实验设置概述。更多详细信息，请参阅说明书。 1. 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀： attB-PCR 产物（=10 ng/μl；最终量~15-150 ng）1-7 μl 供体载体(150 ng/μl) 1 μl TE缓冲液，pH 8.0 补充至8 μl 2. 将BP Clonase? II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。对BP Clonase? II 酶混合物稍 微震荡两次（每次 2 秒）。 3. 对于每份样品（上述步骤1），向反应液中加入 2 μl BP Clonase? II 酶混合物，稍微震 荡两次以充分混匀。进行短暂的低速离心。 4. 将BP Clonase? II 酶混合物放回-20°C 或-80°C 储存。 5. 反应体系25°C 孵育 1 小时。 6. 向每份样品中加入 1 μl 蛋白酶K 溶液来终止反应。稍微震荡。在37°C 下孵育样品10 分钟。 转化 7. 取 1 μl 的各LR 反应液转化50 μl One Shot? OmniMA X ? 2 T1 噬菌体抗性细胞（目 录号C8540-03).冰上孵育30 分钟。通过30 秒的42°C 孵育对细胞进行热休克。加入250 μl S.O.C. 培养基并在37°C 震荡孵育 1 小时。将20 μl 和100 μl 每种转化液分别涂布于选择 性平板上。注意：任何转化率达>1.0 × 10 8 转化子/μg 的感受态细胞均可以使用。