第十三章
植物离体低温保存
植物种质保存
植物种质——植物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质。
植物种质保存——在适宜的环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性。
?就地保存：建立自然保护区、森林公园等。?迁地保存：建立种子园、种子库、离体保存等。
离体保存种质的意义
?节约土地及人力物力
?减少病虫害及自然灾害的影响
?避免了种子繁殖需要繁种的麻烦?有些树种无种子需长期无性繁殖
?有利于种质的利用与推广
本章主要内容
?超低温冷冻保存技术
?低温保存技术
?常温保存
超低温冷冻保存技术
一、基本原理
超低温冷冻保存是将植物材料加入一定的冷冻防护剂，再经一定的方法处理一段时间后，贮存在-80℃至-196℃的超低温条件下。
所用材料包括离体培养的原生质体、细胞、组织、器官、小植株、植物的花粉等。
超低温冷冻保存技术
二、保存液
为了保持离体植物材料的活力，模拟细胞质组成成分而配制的用以提供其生活环境及营养物质的溶液。由以下几部分组成：
①电解质平衡盐溶液
②高渗溶液，如葡萄糖、甘露醇、蔗糖等。
③营养液，如氨基酸、核苷类等营养物。
超低温冷冻保存技术
三、超低温冷冻保存的程序
植物材料的选择预处理加入冷冻防护剂
冷冻贮存解冻细胞生活力测定再培养
植物材料的选择
?细胞质浓厚的分生细胞更易存活，高度液泡化的成熟细胞不易成活；
?旺盛分裂的细胞抗冻能力强，易存活；
?常选细胞培养物及植物茎尖、幼胚、幼苗等作为冷冻保存的材料；成熟与老的组织不宜。
?悬浮培养的细胞或愈伤组织应选取代数低的材料；且结构紧密的细胞团比松散的更耐受冷冻。
预处理
●低温预处理；
●在培养基中加入渗透剂，如脯氨酸等；●在培养基中加入二甲基亚砜（DMSO）预培养24~48h，或进行预冷处理20~60min；
●将培养细胞脱水到适当程度。
加入冷冻防护剂
常用的冷冻防护剂分为2类：
I.渗透性冷冻防护剂，如二甲基亚砜、甘油等；II.非渗透性防护剂，如聚乙二醇，蔗糖等。
大部分冷冻防护剂具细胞毒性，故预处理须
在0℃下进行，处理时间一般不超过1h。
冷冻
?慢速冷冻法?快速冷冻法
?预冻法?干冻法
?包埋脱水法?玻璃化法
贮存
贮存期间，关键是要把冷冻温度持续维持在-196℃条件下，不发生温度的上下波动。有研究发现，在-196℃时，材料的活力几乎不损失。
解冻
?快速解冻法，即把超低温冷冻材料直接放入35~40℃的水浴中解冻，一般约需1~2min 时间。冰完全融化后，应迅速移开材料以避免热伤害。
?慢速解冻法，即在0℃、2~3℃或室温下进行解冻，多用于脱水处理材料的解冻。
植物细胞生活力测定
?荧光素双醋酸酯法?TTC法
?伊万斯兰染色法
再培养
植物材料解冻后，再培养是最直接的
测定其生活力的方法，将材料转入新鲜培养基培养，观察其愈伤组织形成、分化或增殖的能力。该方法需费时数天至几个月。
低温保存技术
一、低温保存的方法和原理
低温保存，是将种质用离体培养的方式贮存在非冻结程度的低温下（1~9 ℃），热带亚热带植物在10~20℃间也能延缓生长，也称中低温调控生长保存。
植物在低温下生长速度减缓，继代间隔时间可以延长，只需在常温下培养，即可恢复生长。此
方法简单且存活率高，适用于中短期的种质保存。
低温保存技术
二、结合化学和物理的方法
?加入生长抑制剂，如脱落酸，多效唑等；?提高培养基渗透压，如使用高浓度蔗糖；
?低气压和低氧压可抑制植物生长。
常温保存
在常温（20±5℃）条件下，应用化学或物理方法，改变培养基的成分或环境条件，延缓培养物生长，达到保存种质的目的。
●培养基添加生长抑制剂
●提高培养基渗透压
●降低培养瓶内氧分压
●培养物干燥保存
本章复习重点
?掌握植物种质的概念及植物种质保存的方法；
?了解超低温冷冻保存的原理及程序；?了解低温保存及常温保存的原理和方法。
第三章 种质资源 一、名词解释 1.种质：指决定生物遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给后代的遗传物质。 2.种质库：又称基因库，是指以种为单位的群体内的全部遗传物质，它由许多个体的不同基因所组成。 3.种质资源：指具有种质并能繁殖的生物体。 4.作物起源中心：指现在栽培作物都是在不同的历史年代，分别陆续从相应的野生植物演化而成。早期人类被难以跨越的沙漠、山脉和海洋所阻隔，在这种情况下，各个隔离区产生了自己的农业，只能在特有的隔离范围内利用和驯化当地的植物，这就形成了地球上大大小小的独立的作物起源中心。 5.有性繁殖：指生物通过有性过程产生的雌雄配子结合，形成合子发育成新个体繁殖后代的繁殖方式。 6.无性繁殖：指生物利用营养器官或体细胞等繁殖后代的繁殖方式。 7.自花授粉：在自然情况下，雄蕊的花粉一般不需借助外力即可直接授到本花雌蕊的柱头上，一般自然异交率在5%以内。 8.异花授粉：在天然授粉情况下，雌蕊主要依靠异株或同株异花的花粉完成授
粉、受精，天然异交率在50%以上。 9.常异花授粉：在自然情况下，这类植物以自花授粉为主，但也能异花授粉，天然异交率达5%~50%。 二、问答题 1.论述种质资源的重要性及保护种质资源的迫切性。 种质资源是地球生命的基础，也是人类赖以生存和发展的根本，是人类最为宝贵的自然财富。 种质资源是农业生产和育种工作成败的关键，一个国家或研究单位拥有的种质资源的数量、质量以及对其保存、特性研究的深度和广度，是其育种效果的决定因素，也是衡量其育种工作发展水平的重要标志之一 种质资源正在流失，无法再现的基因、物种和生态系统正以人类历史上前所未有的速度消失。 2.起源于中国的园艺植物有那些？ 蔬菜：韭菜、大白菜、茼蒿、山药、荸荠、大豆、金针菜、萝卜、慈菇、茭白等。果树：苹果、梨、桃、李、杏、樱桃、枣、柿、栗、猕猴桃、柑桔类、枇杷、龙眼、荔枝等。观赏植物：银杏属、金钱松属、水杉属、水松、珙桐属、观光木属；百合属、龙胆属、
作物种质资源保存现状及发展方向 我国是世界上最古老的农业国之一，，有丰富的栽培和野生植物资源，被认为是栽培植物遗传多样性中心之一。据初步统计，我国重要栽培作物有600 多种，其中粮食作物30 多种，经济作物约90 种，蔬菜120 余种，花卉140 余种，果树约150 种，牧草约50 种，绿肥约20 种。在现有作物中起源于我国或在史前已栽培的有237 种。但由于人口迅速增长等原因，我国农业植物资源遭到严重的人为破坏和侵蚀，如野生稻、野生大豆及小麦近缘野生植物在原生长地已很难找到；外来种侵袭使土生土长的植物物种数减少，加上大量病虫天敌的减少，使作物病虫害加重；农业机械化和良种的大面积推广种植导致了大量地方品种被淘汰。在生产上种植的许多作物的骨干品种种质基础日趋狭窄，存在遗传脆弱性和突发毁灭性病害的隐患。为此，近20 年来，作为拓宽育种遗传基础的源头，种质资源的收集、保存及研究一直受到有关部门的高度重视，并取得令人瞩目的成就。种质资源保存过程中需要使用到的仪器有自动数粒仪。 如今，作物种质资源保存利用体系已初步建立，根据作物繁殖方式等生物学特性，实行种质资源原生境保存与非原生境保存相结合的保存策略。原生境保存是指在植物原来的生态环境中建立保护区或保护地，使重要作物野生种及野
生近缘植物就地进行自我繁殖以保存种质。非原生境保存，即将种质保存于该植物原产地以外的地方，包括在低温种质库中进行的种子体保存、在种质圃中的植株保存、在试管苗种质库中的组织培养物保存等。 种子保存技术有好多种，如低温储存技术。利用低 温种质库保存种子，除贮藏温度较低外，作为种质保存的种子，还须经过生活力检测、干燥脱水、密封包装等一系列入库保存前处理。还有离体种质保存技术，许多植物种质资源无法通过种子贮藏达到资源保存的目的，如椰子、油棕、咖啡等是顽拗型种子，它们或不耐干燥脱水和低温贮藏，或作物不产生种子，这种植物不能采用低温库种子贮藏的方式，只能通过种质圃，以植株或块根、块茎等活体方式在田间保存。它包括试管苗组织培养技术和超低温保存技术。 随着人们对种质资源保护的不断认识，国家对种质 资源的研究也不断深入，从“七五”以来，作物种质资源收集保存一直被列入国家科技攻关项目，在1984 年建成我国自行设计建设的国家种质库1 号库（后改为国家种质分发交换库），又在在1986 年和1992 年建成了国家长期库和青海复份长期库。可见国家对种质资源保存的重视。通过国家的科技攻关，我国种质资保存技术研究已进入一个新的阶段，在国家库已建立一套先进的管理和种子入库前处理技术。通过系统地研究，解决了各种作物的安全有效干燥条件
观赏植物种质资源的研究 1.1 中国观赏植物对世界园林的贡献 中国被西方国家称为“世界园林之母”，从十六世纪开始，西方国家就到中国采集植物标本，在1839～1938年的一百年的时间内，西方国家从中国引走了数千种植物，目前，仅爱丁堡植物园就保存了中国原产的植物1500多种，我国观赏植物能够在世界园林中确立如此高的地位，主要有以下几个方面的原因：①世界上许多著名的观赏植物为我国特产，如山茶花（Camellia japoica）、金花茶（Camellia chrysantha）、牡丹（paeonia suffructicosa）、银杏（Ginkgo biloba）、珙桐（Davidia involucrata）、金钱松（Pseudolarix amabilis）、银杉（Cathaya argyrophy-lla）、白豆杉（Pseudotaxus chienii)、水松（Glyptostrobus pensilis）、台湾杉（Taiwania cryptomerioides）、水杉（Metasequoia glyptostnobcides）、蜡梅（Chimonanthus praecox）、七子花（Heptacodium miconioides）、喜树（Camptotheca acuminata）、青檀（Pteroceltis tatarinowii）、连翘（Forsythia suspensa）、猬实（Kolkwitzia amabilis）等等；②世界上许多重要观赏植物的分布中心在中国，如槭属、山茶属、百合属、石蒜属、含笑属、木犀属、丁香属、报春属、竹类植物、兰科植物、蔷薇属等；③世界许多重要观赏植物品种的形成都离不开中国植物，中国的月月红和香水月季是现代月季最重要的亲本，没有中国的月月红就没有周年开花的现代月季，没有中国的香水月季就没有现代月季的芳香气息；中国的高山杜鹃（Rhododen-dron）是形成杂种常绿阔叶杜鹃的亲本，英国人常说“没有中国的杜鹃花，就没有英国的园林”；中国的金花茶是培育黄色茶花的亲本；其它著名的种类还有报春属、兰属、绣线菊属、落新妇属等。 1.2我国观赏植物种质资源的概况 我国是世界上植物资源最为丰富的国家之一，全世界有植物种类约30万种以上，我国有3万多种植物，约占1/10，其中苔藓植物106科，占世界科数的70%；蕨类植物52科，2600种，分别占世界科数的80%和种数的26%；木本植物8000种（包括种、变种、变型和栽培种），其中乔木约2000种。全世界裸子植物共12科71属750种，中国就有11科34属240多种。针叶树的总种数占世界同类植物的37.8%。被子植物占世界总科、属的54%和24%。 经过近３０年的调查和研究，我国观赏植物资源基本搞清，全世界观赏植物约有3万种，常用的约6000种；我国原产的观赏植物约1～2万种，常用的约2000种。 1.３观赏植物种质资源的收集和保护研究 观赏植物种质资源的传统保存方法主要有原地保存和异地保存两种，超低温保存和核心种质构建是近年才开始的新技术。 1.3.1原地保存（conservation in situ） 指将种质资源在原生地进行保存，又称就地保存。设立植物种质资源原地保存区是主要形式，目前，全国各地建立的各种类型自然保护区、国家公园、自然地理标识、生境/物种保护区、景观/海景保护地、自然资源保护地等都属于这种类型。 1.3.2异地保存（conservation ex situ） 指将种质资源迁移出原生地栽培保存，又称迁地保存。异地保存的主要形式有国家和地方建立的植物种质资源库、植物良种基地收集区（圃）、植物园、树木园及种子资源贮藏库等。 1.３.3超低温保存（cryopreservation） 是指将植物活体材料在超低温条件下（-196℃）长期保存，待需要的时候将其恢复到常温状态，并确保其正常生长的一套技术。种质资源低温保存（cryopreservation）是由cryo 和preservation组成，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。习惯上，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度（－70℃）称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，
第二章植物离体繁殖 植物离体繁殖: 利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁。 和传统方法突出特点： 1、繁殖效率高:增值率高，生长速度快，可周年生产，在一个短暂的时间，由单一个体开始，能产生出大量的遗传组成相同的植株。（如苹果矮化砧木茎尖8个月可繁殖6万株，石刁柏一个腋芽一年可繁殖７万株） 2、培养条件可控性强：人为提供培养基及小气候，便于对环境进行控制，省去田间栽培繁杂劳动。 3、便于管理、占地面积小：30m2可存放1万多培养瓶，约10万多苗木。 4、利于种质资源的保存及交换。 快速繁殖的应用 （1）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。（2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物的繁殖有更重要的意义。 （3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。如远缘杂种、多倍体、突变体。 （4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。 一、植物快繁的器官形成方式 由于植物种类不同，器官再生及快速繁殖的方式也不同。 1、短枝发生型：外植体为带叶单芽茎段，培养为完整植株。 特点：一次成苗，培养过程简单，容易移栽成活，遗传性状稳定。例如：葡萄、红薯等试管苗繁殖。 2、器官型：外植体带有顶芽或腋芽。培养后形成丛生芽，转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。 特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定，多数花卉、苗木的快繁属于此类。 3、器官发生型：直接由外植体上或从愈伤组织产生不定芽，经过脱分化与再分化成苗。 特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不稳定。烟草、水稻、小麦、番茄等。 4、胚胎发生型：外植体脱分化产生愈伤组织或细胞团，再分化为胚状体产生小植株（球形期、心形期、鱼雷期、子叶期）特点：发生数量大，速度快，结构完整，人工种子繁殖，遗传变异。 5、原球茎发生型：兰科。 茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，而发育为完整植株。 二、植物快繁的程序和关键技术 离体无性繁殖的程序包括：无菌母株的制备，继代芽的增殖，芽苗生根培养，再生植株的锻炼和移栽。 1、无菌母株的制备 初代培养：在无菌条件下，制备无菌繁殖的材料称为无菌母株，或繁殖母株。 选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体，经适当有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑芽或不定芽）和愈伤组织。 注意:培养基激素配比，取材的年龄、大小和生理状态。 初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长;茎段、叶片、其它器官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。此阶段一般需要4-6周。 ↗愈伤组织 2、继代芽的增殖 无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。 在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为驯化现象，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖速度。 3、芽苗生根培养 诱导无根苗生根的方法有两种：试管内生根和试管外生根。 1）试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。 提高生根率的措施： ①降低无机盐和有机物含量（如1/2MS或1/4MS培养基）
目录 摘要 (1) 关键词…………………………………………………………………………………………… 1 Abstract…………………………………………………………………………………………… 1 Keywords (1) 1 污染 (2) 1.1 污染的种类 (2) 1.2 污染的因素 (2) 1.2.1 外植体本身 (2) 1.2.2 外植体灭菌 (2) 1.2.3 接种和培养环境 (3) 2 褐化 (3) 2.1 褐化原因 (3) 2.2 影响褐变的因素 (3) 2.3 防止褐变的方法 (4) 2.3.1 外植体的选择 (4) 2.3.2 适宜的培养基和培养条件 (4) 2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂 (4) 2.3.4 反复转接 (4) 3 玻璃化 (4) 3.1 玻璃化苗的特点与发生原因 (4) 3.1.1 玻璃化苗的特点 (4) 3.1.2 发生原因 (4) 3.2 影响玻璃化苗的因素 (5) 3.2.1 生长调节剂 (5) 3.2.2 温度 (5) 3.2.3 湿度 (5) 3.2.4 消毒方法 (5) 3.2.5 光照时间 (5) 3.2.6 培养基 (5) 3.2.7 继代次数 (5) 4 其他常见问题及其解决措施 (5) 4.1 初始培养阶段 (5) 4.2 继代培养阶段 (6) 致谢 (7) 参考文献 (7)
浅析植物离体快繁过程中常见的问题 摘要 探讨了影响了植物组织培养的主要因素，分析了污染、褐变、玻璃化及其他常见问题，并提出了解决措施。认为：污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的，加强外植体和培养基的灭菌，对培养环境及其用具彻底消毒，可大大降低污染率。植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关，选择适宜的外植体，进行外植体，调价抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生，选择适当培养基，降低温度，增强光照，改善通风等可使玻璃化率降低。 关键词 组织培养；污染，褐化，玻璃化 According to the rapid propagation process of in vitro in common problem Abstract Discusses the influence of the main factors of plant tissue culture, this paper analyzes the pollution, Browning, vitrification and other common problems, and proposes the measures. Think: pollution is mainly composed of sterilization is not complete and the environment caused by the unclean, strengthen the explant and culture medium sterilization for training environment and its appliance disinfection, can greatly reduce the rate of pollution. Plant variety, based site and environment and the occurrence of Browning closely related, the choice of appropriate explant, explant, introduce antioxidants and adsorbent, etc can effectively control the Browning. The kinds of culture medium, temperature and ventilation situation will influence the occurrence of glass seedlings, choose proper culture medium, reduce the temperature, and enhance the illumination, improve ventilation can make glass transition rate to decrease. Keywords Tissue culture; Pollution, Browning, vitrificatio
植物组织培养练习题 1.植物组织培养：指要人工控制的条件下，将植物体的任何部分，或器官、或组织、或细胞， 进行离体培养，使之发育形成完整植物体。所谓人工控制的条件，即营养条件和环境条件； 植物体的任何一部分是指根、茎、叶、花、果、实以及它们的组织切片和细胞。 2.愈伤组织培养：将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在，而使其细胞 脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。 3.外植体：植物组织培养中的各种接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质 体等。 4.脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。 5、接种：把经过表面灭菌后的外植体切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的 全部操作过程。 6、褐变：外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类 物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。 二填空 植物组织培养根据培养方式分为固体培养和液体培养。 2、植物组织培养类型分为愈伤组织培养、器官培养、胚培养、细胞和原生质体培养。 3、组织培养的主要应用领域有快速繁殖、脱毒、体细胞无性系变异和新品种培育、单倍体育种、种质保存、遗传转化、次生代谢物的生产等几个方面。 4、茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为快速繁殖和脱毒培养两种类型。 5、一般组织培养的几道工序如下：培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和高压灭菌；无菌操作——材料的表面灭菌和接种，培养；试管苗的驯化、移栽与初期管理。 6、在进行植物组织培养室设计时，其设计应包括洗涤室、准备室、灭菌室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室、摄影室等分室，另加驯化室、温室和大棚。 7、培养基的成分主要包括无机营养、氨基酸、有机附加物、维生素、糖、琼脂、激素、活性炭、PH。 8、植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 9、细胞全能性是指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。 10、玻璃化现象是指试管苗的一种生长失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。其苗称为玻璃化苗。
植物离体快繁技术的综述 黄新 （生物科学技术学院2009级生物技术一班） 摘要：植物快繁技术是一种全新的育苗技术，是现代计算机智能控制技术与生物技术有机结合的高新农业技术。运用植物生长模拟计算机为植物创造最为适宜的温、光、气、热、营养、激素环境，使植物的生理潜能得到最大的发挥，植物的生根基因尽快表达，从而实现植物的快速生根。它的推广应用将会带来一次全新的育苗革命。本文简要介绍植物快繁技术程序、相关培养技术以及植物快繁相关问题的讨论。同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。 关键词：植物离体快繁、愈伤组织、不定芽增殖、腋芽增殖、愈伤组织增殖、体细胞胚增殖、玻璃化问题、褐化问题、应用前景 1植物离体快繁概况 1.1研究简史 离体微繁殖技术的应用，首先应归功于Morel，他在1960年首先建立了兰花离体繁殖的方法（原球茎繁殖）。目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功，其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、菊花、石竹)、果树(草莓、无籽西瓜、葡萄)、经济作物(马铃薯、甘蔗)、林木(桉树、杨树)均已在种苗生产上广泛应用，取得了巨大的经济和社会效益。 我国快速繁殖植物的种类达443种之多荷兰是试管苗的生产王国 1.2植物离体快繁的定义 快速繁殖（rapid clone propagation）：也叫离体繁殖（in vitro
propagation）、微体繁殖（Micropropagation），是指在无菌条件下，将植物体的器官、组织或细胞培养于人工培养基中，并辅以人工控制环境，使其生长出完整植株的繁殖技术。 追究植物组织培养脱毒快繁技术的发展简史，在11世纪就出现的热处理脱毒法，最早解决一些作物的病毒病害问题[1]。本世纪50年代发展的植物组织培养技术为脱毒提供了一条有效途径。现在植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将不同的方法相结合起来应用效果更好。它们的脱毒原理各不相同。 2植物离体快繁的技术程序 无菌材料的建立芽苗的增殖生根及移苗 2.1无菌材料的建立 （1）初代培养：取材消毒接种培养 （2）外植体的选择主要应考虑以下问题： a)繁殖对象的品种典型性。 b)植物在自然条件下的繁殖特点。尽可能取自然繁殖器官的适当 部位作外植体， c)外植体的取材部位和大小、生理状态。 2.2芽苗的增殖 增值方式：不定芽增殖、腋芽增殖、愈伤组织增殖、体细胞胚增殖 2.2.1不定芽增殖 a)不定芽：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形 成的芽称之为不定芽。 b)特点：繁殖系数高、遗传稳定性较好、继代次数有限 c)注意事项：激素浓度不能过高；避免使用2，4-D等活性强的生长素， 以减少变异发生。 2.2.2腋芽增殖 腋芽进行离体培养时可不断生长，逐渐形成芽丛，反复切割和转移可不
中国观赏植物种质资源特点 中国观赏植物种质资源特点 观赏植物（花卉）种质资源 观赏植物（花卉）种质资源（Germplasm Resources of Ornamental Plants）是指携带一定可利用价值的遗传物质，表现为一定的优良性状，通过生殖细胞或体细胞能将其遗传给后代的观赏植物的总称 花卉种质资源包括野生种、栽培种及人工选育或杂交的品种。 种质资源的载体可以是种子，也可以是花卉的块根、块茎、鳞茎等无性繁殖器官或根、茎、叶等营养器官 还包括愈伤组织、分生组织、花粉、合子、原生质体及染色体和核酸片段等。 花卉种质资源是育种、科学研究、创造有价值栽培作物新类型的重要物质基础。 一、观赏植物物种多样性丰富 中国是一个观赏植物（花卉）资源多样性十分丰富的国家，蕴藏宝贵的观赏植物资源。 中国的被子植物总数为世界第三，仅次于巴西和马来西亚； 中国原产的木本植物约有7500种，在世界树种总数中占有很大比例。
英国丘园（Royal Botanical Gardens，Kew）中从中国引种成功的观赏树木占全园树木总数的三分之一，在亚洲，中国花卉资源最为丰富，尤以西南山区最为突出，这一地区的植物种类约比毗邻的印度、缅甸、尼泊尔等国山地多４－５倍。 据陈嵘教授在《中国树木分类学》中的统计，中国原产的乔灌木种类比全世界其它北温带地区所产的总数还多， 非我国原产的乔灌木种类仅有悬铃木、山月桂、北美红杉、南洋杉、罗汉柏等10个属而已。 在中国原产的花卉中，有很多是中国特产的优良种类。是中国花卉中的宝贵财富。 中国观赏植物的资源另一个特点是变异范围大。 l仅以常绿杜鹃亚属而言，小的杜鹃仅为５－１０厘米。巨型的大树杜鹃茎围达近３米，花型、花色、花香、花序差异很大。 l中国的百合约为６０种，占世界的６０％，种类多。花色变异大，是世界重要的观赏球根花卉的种质资源； l中国蔷薇属、紫薇、乌头属、报春花属等类型丰富是世界上是少有的。设计就是指具有美感、使用与纪念功能的造形活动或营造活动 建筑是一个有关木材、砖块、石头、钢铁和玻璃的专业。它也是一种基于语言、理念和概念框架的艺术形式。
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件 外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性 李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。 1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术 Guha和Maheshwari等——花药培养 Cocking等-原生质体培养
目录 绪论 (1) 1. 离体快繁过程中的问题、原因及防治措施 (1) 1.1 污染问题 (2) 1.1.1 污染的来源 (2) 2.1.2 污染的防治措施 (2) 1.2 褐变问题 (3) 1.2.1 褐变的原因 (4) 1.2.2 克服外植体褐变的措施 (4) 1.3 玻璃化问题 (4) 1.3.1 玻璃化发生的原因 (4) 1.3.2控制组培苗玻璃化的措施 (5) 1.4 遗传稳定性 (5) 1.4.1 影响遗传稳定性的因素 (6) 1.4.2 提高遗传稳定性，减少变异的措施 (5) 1.5 黄化问题 (5) 1.5.1 黄化原因 (6) 2. 离体快繁的前景与探讨 (6) 2.2适应现状的需求 (6) 2.3存在问题 (6) 参考文献 (6) 致谢 (6)
浅析植物离体快繁中常见的问题 摘要 植物组织培养是20世纪初发展起来的一项新技术，是现代农业生物技术的一个重要组成部分，已经日益广泛地应用于园艺植物的脱毒和快繁等方面。本文针对植物组织培养中常出现的问题进行了分析，探讨了污染、褐变、玻璃化、遗传稳定性、黄化等发生的可能原因，并提出了相应的防治措施。 关键词 离体快繁；污染；褐变；玻璃化；遗传稳定性；黄化 Analysis of the Common Problems in Plant Vitro Propagation Pick to Plant tissue culture is developed in the early 20th century, a new technology of modern agricultural biotechnology, is one of the important constituent, has increasingly widely applied in the enviroment of horticultural plants and rapid propagation, etc. Aiming at the plant tissue culture often appears the question were analyzed, pollution, Browning, vitrification, genetic stability, such as possible reasons Browning, and puts forward the corresponding prevention cuo Key words Propagation in vitro; contamination; browning; vitrification; genetic stability; etiolation
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
植物快繁技术/植物克隆技术/植物傻瓜克隆技术/植物非试管高效快 繁技术 减小字体增大字体作者：本站来源：本站整理发布时间： 2008-1-1 18:33:32 植物快繁技术简介 所谓植物非试管高效快繁技术也就是植物克隆技术，也有人称之为植物非试管快繁技术、植物快繁技术、植物全光照喷雾育苗技术、全光雾插技术、微材料或微组织扦插育苗技术，喷雾育苗技术、喷雾扦插育苗技术、傻瓜克隆。无论叫做植物快繁还是植物克隆其原理和方法是一样的。 植物克隆技术（植物快繁技术）的关键是喷雾，十几年前就有权威单位推广全光照喷雾育苗技术，实际上也就是后来有人称之为植物非试管高效快繁技术，而现今更多被称为植物克隆、傻瓜克隆等时髦词汇。过去开发的喷雾全套设备是机械式，成本高达数万元，且容易锈蚀和损坏，一段时间后就没人再使用，而自从引进以色列微喷（头）技术后，微喷雾问题顺利以低成本形式解决，于是植物克隆技术（植物快繁技术）得以在全国迅速推广普及。 植物快繁技术（植物克隆技术）的推广的另一障碍就是自动控制仪的问题，进口的温湿控制设备好用但价格高，所谓的农业智能化计算机系统除了价格更高之外还总是不能成熟，使用起来问题百出，经常造成育苗的失败，笔者使用两年后才不得已开发了国产育苗仪，其低廉
的价格和丰富实用的功能很快被全国同行赏识。 植物克隆技术（植物非试管高效快繁技术）现在的投入只需2000余元，大力推广植物克隆技术、植物快繁技术利国利民。 植物非试管高效快繁技术的起源、应用和进展 植物傻瓜克隆技术是20年前从国外引进，又经过我国众多农业专家花费二十余年时间，逐步完善并成熟运用于规模生产一个系统配套，用于多种经济植物大规模无性快繁产业化生产的实用技术，又称非试管快繁技术、喷雾快繁技术等。此技术是一项崭新经济植物苗木快繁技术体系，它将植物组织培养快繁苗从试管培养基中解放到田间大地，是一场无性繁殖快速育苗的革命！是现代农业生物技术研究的一大创举！ 该技术育苗生产成本低，适用于国内外苗木交易市场和经济植物种苗繁殖工程。绿色快繁产业是一个永久性高效益产业，它可以带动制药产业、林纸产业、林草产业、园林绿化等其它产业，进而促进农业产业化、林业产业化、制药产业化和农业现代化的快速发展。还有利于生态城市、园林城市、森林公园、自然保护区的建设、生态环境改善、城市生态系统的改变、无性系造林、天然林保护工程、城市绿化工程以及与人们生活息息相关的如粮食作物、花卉、蔬菜、无公害蔬菜、野生蔬菜、濒危野生植物、果树、山野菜、药用植物、珍稀植物等高效经济植物以及新经济资源的开发利用。 植物快繁技术是古今中外人们十分关注的问题。从传统的扦插繁
植物组织培养：离体条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。外植体：由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。植物细胞的全能性：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。脱分化：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。 第二章设备与培养条件 实验室组成：化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室。1化学实验室：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器. 2 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。3无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。4培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。5细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜等。6其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。 第三章培养基及其制备 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。常用的培养基及特点如下：(1)MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。(2)B5培养基其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。(3)White培养基其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。（4）N6培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。(5)KM —8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。1无机营养--①大量元素，指浓度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。(2)P 是磷脂的主要成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但(4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S 是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。②微量元素，作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节③缺素症④稀土元素，对试管苗的生长分化生根愈伤组织诱导生长体细胞胚的发生以及提高次生代谢物的产量有促进作用2有机营养成分①碳源，对细胞增殖起作用也影响细胞分化②维生素类，对生长分化等有很好促进作用③肌醇，糖类的转化中其重要作用，是细胞壁的构建材料④氨基酸，可直接被细胞吸收⑤天然复合物，对细胞的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显3培养材料的支持物4活性炭吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质，抑制外植体褐变防止玻璃苗的产生促进培养物生长和分化促进生根5抗生素防止外植体内生菌造成的污染6抗氧化物，作用抑制外植体的褐变7硝酸银促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，使原再生困难的物种分化再生植株母液的配置与保存：①大量元素母液，即含N.P.K.Ca.Mg.S等六种盐类的混合溶液，一般配成浓度10倍或20倍母液。②微量元素母液，含有除Fe以外的B.Mn.Cu.Zn,Mo.CL等盐类的混合溶液，因含量低，一般配成100倍或200倍母液。③铁盐母液④有机物母液⑤植物生长调节物质母液1生长素类，作用促进细胞伸长和分裂，促进生根抑制器官脱落，性别控制，延长休眠，顶端优势，单性结实等作用2细胞分裂素类作用，促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。3赤霉素作用，加速细胞的伸长生长，促进细胞分裂。脱落酸具有抑制细胞分裂和伸长促进脱落和衰老促进休眠和提高抗逆等能力4多胺作用，调控部分植物外植体不定根不定芽画押体细胞胚发生发育以及延缓原生质体衰老促进原生质体分裂及细胞克隆形成方面具有明显的效果5多效唑作用，控长矮化，促进分枝，分嶪促进生根成花坐果，延缓衰老，提高叶绿素含量，增强植物抗逆性等培养基的配置准备工作1实验用具的准备2试剂药品的准备3 Vo=V1/t 或Vo=(C1*V1)/Co Vo=吸取母液体积（mL）V1=配置培养基体积（mL）Co=母液浓度（mg/L）C1=配置培养基的浓度（mg/L）T=母液扩大倍数①取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯内，加蒸馏水至培养基最终体积的3/4在恒温水浴中加热使之溶解，加热过程应不断搅拌，防治结块。②根据计算所需量一次加入大量元素微量元素铁盐有机物生长调节物质母液及其他特殊附加物，搅拌均匀。③加水定容至规定体积，搅拌均匀。④调整培养基的PH值。⑤分装⑥封口 第四章植物材料 植物材料幼年期特点：植物生长快，呼吸强，核酸代谢和蛋白质合成快。成年期：代谢和生理活动慢，光合速率和呼吸速率下降。外植体的选择：1植物的种质选择2外植体的增值能力3外植体的大小4外植体的年龄和着生部位5取外植体的季节和时间6木本材料的特殊性灭菌的常用化学药品:1乙醇2升汞3次氯酸钠4漂白剂5过氧化氢6其他用于外植体体表灭菌的化学药品①茎尖茎段以及叶片等材料的灭菌流水冲洗，70％乙醇浸泡，冲洗，取0.1％升汞。最后用无菌水洗涤干净，备用。②果实和种子的灭菌冲洗20min 再用70％乙醇灭菌30s，用无菌水洗涤3次，取出果实内种子进行培养。如暴露了，用10％次氯酸钙溶液浸泡30min。
第三章植物离体快速无性繁殖技术和脱毒培养技术 第一节、植物离体快速繁殖技术 一、植物离体快速无性繁殖的概念及其意义 1 概念 离体无性繁殖：指利用组织培养的方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致的个体的方法，又称“离体繁殖，快速无性繁殖、微型繁殖”。 试管苗：由离体无性繁殖获得的植株称试管苗。 无性系：指有同一个体通过无性繁殖产生的一个群体，它们的遗传背景基本一致。 2 应用 （1）用来加速难繁殖和繁殖速度慢的植物的繁殖。 （2）无病毒苗木的繁殖。 （3）用于某些杂合园艺植物的繁殖。 （4）用于需要加速繁殖的特殊基因型。 二、植物离体快速无性繁殖的特点 1 优点 （1）首先体现在一个“快”字上。 （2）可人为控制条件，不受大自然的干扰 （3）快速培养脱毒苗。 2局限性 （1）一些植物快速无性繁殖技术的某些环节还没有突破。 （2）要对其成本、技术等进行估算。 （3）随继代次数增多，培养材料的分化能力下降。 三、离体无性繁殖中器官的发生形式 1 不定芽型 ２器官型 ３器官发生型 ４类胚体发生型 ５原球茎型 四、离体无性繁殖的程序 ?无菌母株的制备 ?茎芽的增殖 ?诱导生根 ?炼苗 ?再生植株的鉴定 五、植物组织培养中应注意的问题 １褐变 （１）褐变
褐变：指在组织培养过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。 （２）克服褐变的方法 选择适宜的外植体（幼嫩材料、春季取材） 改善营养条件（连续培养） 在培养基中加入一些附加物 ２污染 （１）特点： 细菌污染的特点 在培养材料附近出现黏液状菌斑，一般接种1-2天一5可发现。特别应注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌，外被荚膜，耐高温，一般灭菌剂难以杀死，可随培养材料、用具传播，可出现在培养基表面，也可呈滴形云雾状存在于培养基内，发现及时淘汰，并对用过的器具严格高温灭菌。 真菌污染的特点 培养基上长霉，一般接种3-5天就可先，霉的颜色有黑、白、黄等，真菌污染的特点是污染部分有不同颜色的霉菌，接种3天，有时多达10天才能表现。 （２）克服方法： ?外植体灭菌不彻底 ?培养基及各种器具清洁灭菌不彻底 ?人为因素 ?超净工作区被污染 ?环境不清洁 ３玻璃化 （１）玻璃化 玻璃化：是试管苗的一种生理失调症状，当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的茎、叶往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。 （２）克服方法 ?增加固体琼脂浓度，使细胞吸水受到阻碍。 ?提高培养基中的Ｃ、Ｎ比。 ?控制温度，增加自然光照。 ?附加一些物质 第二节、植物的脱毒技术 一、病毒的特性及其侵染 １病毒的特性 ２植物病毒的侵染途径 ３病毒在植物体内分布不均匀的原因 （１）分生组织中无微管系统，病毒不易移动。 （２）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很强，有竞争状态，抑制了病毒的复制。（３）在分生组织中存在高水平的内源激素，可以抑制病毒的增殖。 二、脱毒的方法 １物理方法