HBV耐药基因突变检测
项目简介：HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。国内外公认的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类药物两类。核苷（酸）类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。
长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。耐药发生的直接后果即为药物疗效的降低和丧失，具体表现为肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至出现肝衰竭。
乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒 P 基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA 批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒 P 基因变异有关。如拉米夫定耐药相关突变位点为D 区M204V/ I、B 区L180M，阿德福韦相关突变位点为D 区N236T、B 区A181V，替比夫定为M204I，L180M，病毒只需要1 个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M +M204I/V)，同时出现Al84G 或S202I 或M250V 突变。随着用药时间推移，各类核苷酸类似物发生耐药的几率是不尽相同的。其中拉米夫定几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4 年内都维持在1.1%。
因此通过检测HBV耐药基因突变点有助于判断治疗的效果、制定个体化抗病毒治疗方案。使用核苷酸药物导致耐药基因突变原理如下图所示。
YMDD变异与拉米夫定抵抗：YMDD是4个氨基酸(酪氨酸一蛋氨酸一天门冬氨酸一天门冬氨酸)的缩写，位于乙肝病毒DNA聚合酶上，是拉米夫定的主要作用位点。如果该位点发生突变，称为YMDD突变。最常见的YMDD变异是M酪氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)取代，分别称为YVDD或YIDD变异。一旦发生变异，拉米夫定对乙肝病毒的抑制作用就大大下降，称为拉米夫定抵抗。
检测方法：采用PCR结合测序技术，检测HBV感染患者血液中HBV耐药基因突变情况。该方法具有以下优点：1.流程简单：分析可靠，结果明确可信；2.高覆盖度：片段检测YMDD突变YVDD,YIDD;3.灵敏准确：野生型背景中检测所有突变；4.高效可靠：最少量反应中完成多个检测；5:。低起始量：血清或血浆，只需20ng 核酸；6.临床认证：3500DX测序仪，SFDA认证。各种抗HBV药物及相对应突变位点如下图所示。
HBV耐药基因突变检测标本采集及出报告时间：病人采集静脉血2ml（用EDTA-K2抗凝）送检验部分子诊断学实验室，7个工作日出报告。
临床意义：⑴在初始治疗前检测，有助于判断是否感染耐药突变株，可以帮助选择初治药物；⑵在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发
生病毒反弹；⑶耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。
HBV耐药检测建议：⑴在使用核苷（类）药物治疗前，先做一次耐药检测，以确定用药种类；⑵在治疗的最初两年，对于轻微肝病患者，推荐每6个月检测一次；⑶两年后建议每3个月检测一次，因为这个时候耐药出现的可能性更高；⑷对病情较重的患者来说，耐药的后果会迅速表现出来，并可能威胁生命，因此建议每3个月检测一次。
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/433506398.html, 利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用 作者：辛宝林于秀坤 来源：《中国实用医药》2016年第09期 【摘要】目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。方法 88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株， 采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度 100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。结论 PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。 【关键词】利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测 DOI：10.14163/https://www.doczj.com/doc/433506398.html,ki.11-5547/r.2016.09.115 利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。近年来结核分枝杆菌基因突变 发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的4.8%，而在我国则更为严重。耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆 菌耐药性快速检测提供可能。本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药 敏试验进行分析，现报告如下。 1 材料与方法 1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。 1. 2 去污染处理将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中，震荡混匀，静置20 min，再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中， 3000 r/min离心1 min，沉淀后去除上清液，将1 ml磷酸缓冲液加入其中，混匀，获得去污染样本。 1. 3 方法
第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
扬州市结核分枝杆菌利福平耐药基因突变分析 发表时间：2019-05-28T10:05:48.223Z 来源：《医药前沿》2019年9期作者：戴洁1 曾方林1 王金富（通讯作者）1,2 [导读] 目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。 （1扬州市第三人民医院江苏扬州 225025）（2扬州大学人兽共患病学重点实验室江苏扬州 225002）【摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。方法：利用基因芯片检测346例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株利福平耐药基因，分析本地区利福平耐药基因突变特征。结果：346例结核分枝杆菌中利福平耐药基因发生突变的例数为58例（16.7%）。利福平rpoB基因耐药位点分布如下：531位点为58.6%，526位点为31.1%，511位点为6.9%，516位点为3.4%。结论：本地区MTB对利福 平耐药rpoB基因耐药位点以531位点最多，526位点次之。 【关键词】结核分枝杆菌；基因突变；利福平【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）09-0223-02 利福平（RFP)是从利福霉素B得到的一种半合成抗生素，能抑制细菌DNA转录合成RNA，达到杀菌作用。绝大多数的RFP耐药相关基因是rpoB（RNA聚合酶 β亚基），rpoB基因的突变会引起RFP与细菌RNA聚合酶的亲和力降低，导致细菌对RFP耐药[1]。rpoB基因的突变主要是密码子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亚单位的81-by）热点区域。514位和533位密码子突变是引起低水平耐药的常见突变位点。D516V，H526Y, H526D,S531L，这4个位点的突变是引起高水平耐药的常见突变[2]。某些密码子突变引起的rpoB基因突变并不会导致细菌对RFP耐药。本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌RFP耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 收集我院2017年经传统固体培养，并经鉴定为结核分枝杆菌的菌株共346例。 1.2 仪器与试剂 仪器：基因芯片仪器、试剂由北京博奥生物有限公司提供；固体培养和药敏试剂由珠海贝索生物有限公司提供。基因芯片检测RFP rpoB基因6个位点，共13种突变型：511位CTG→CCG，513位CAA→CCA、CAA→AAA，516位GAC→GTC、GAC→TAC、GAC→GGC，526位CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CTC、CAC→CGC，531位TCG→TTG、TCG→TGG，533位CTG→CCG。 1.3 方法 1.3.1痰液化处理将痰标本用4%的氢氧化钠（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接种固体培养基和核酸提取。 1.3.2传统培养及鉴定培养严格按《结核病实验室检测操作规程》的要求进行，采用PNB和TCH进行鉴定，并定期用H37RV进行质控。 1.3.3核酸提取煮沸法提取核酸。 1.3.4基因芯片核酸进行PCR扩增，产物用杂交缓冲液处理后进行杂交，再用芯片洗干仪进行洗涤和甩干，最后用芯片判别系统进行扫描和结果判读，并详细记录芯片信息判读结果。 2.结果 346例结核分枝杆菌中耐利福平例数为58例（16.7%）。 58例利福平耐药标本中，RFP耐药相关基因rpoB基因的531（TCG→TTG）突变位点为34例（58.6%），526（CAC→TAC）突变位点为12例（20.7%），526（CAC→CGC）突变位点为5例（8.6%），526（CAC→GAC）突变位点为1例（1.7%），516（GAC→GTC）突变位点为1例（1.7%），516（GAC→TAC）突变位点为1例（1.7%），511（CTG→CCG）突变位点为4例（7.0%）。 3.讨论 MTB耐药性的增加，导致耐药结核病感染率逐年上升，加大了结核病防治的难度。许多研究表明，耐药基因突变导致是导致MTB耐药的主要原因，通过检测相关耐药基因是否发生突变，从而可推断该MTB是否发生耐药。基因芯片技术是近些年比较流行的一种基因检测的分子技术，其通过PCR技术对待测菌的基因片段进行扩增，将扩增片段与芯片杂交，即可得到基因突变位点和突变类型。该法具有快速、高通量、灵敏等特点[3]，近来在MTB耐药检测中应用广泛，我们前期的研究[4]也验证了基因芯片在MTB异烟肼耐药检测中具有较好的应用效能。 RFP主要作用于结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶的β亚单位，干扰转录的开始及RNA延伸，发挥抑菌和杀菌作用。绝大多数MTB 对RFP产生耐药是由于rpoB基因507-533位发生了突变。rpoB基因507-533位区域称为利福平耐药决定区（RRDR），约85%的耐药菌株出现531位Ser位点、526位His和516位Asp的变异。本次实验采用博奥公司生产的结核分枝杆菌耐药试剂盒检测rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533位密码子，结果显示扬州地区531、526突变位点为优势突变位点，其中531位占58.6%，526位占31.0%，最常见突变位点为531（TCG→TTG）突变位点（58.6%）和526（CAC→TAC）突变位点（20.7%），与相关文献结果相似[5,6]。 另外据相关报道最近在RFP 耐药菌株中发现了两个新的rpo B突变（Ser531Gly和 Asp516Thr），以及一个不属于rpo B基因的突变位点（Ile572Phe）[7]。然而博奥结核分枝杆菌耐药检测试剂无法包含上述所有突变基因和突变形式，在检测的结果中，有可能出RFP实际上耐药而结果敏感的情况，因此该方法检测的RFP敏感只能作为参考，并不能明确诊断，是该方法的缺点。 【参考文献】 [1] Cohen K, van Cutsem G, Boulle A, et al. Effect of rifampicin-based antitubercular therapy on nevirapine plasma concentrations in South African adults with HIV-associated tuberculosis [J].Antimicrob Chemother,2008,61(2):389-393. [2] Madania A,Habous M,Zarzour H,et al.Characterization of mutadons causing rifampicin and isoniazid resistance of Mycobacterium tubercul-osis in Syria[J].Pol J microbiol, 2012,61(1):23-32. [3] MOSTREM P,GORDON M,SOLA C,et al.Methods used in the molecular epidemiology of tuberculosis[J].Clinical Microbiology Infection,2002,8(11):694-704.
此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且 由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化 程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象， 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过
从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。 在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/临床病例结合的解读。1、读懂原始数据 将测序的原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人类基因组参考序列上，Picard 去除重复序列，使用GATK检测SNV与Indel变异，使用ANNOVAR进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。
Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离） ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区 AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样） 经注释后的vcf文件还会包含如下信息： CLINSIG：该变异在ClinVar数据库中的临床意义（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：该变异所引起的疾病名称 CLINACC：该变异的登记号和版本号（VariantAccession and Versions）
基因突变检测多少钱检测方法是什么 一代测序法（Sanger法）： 科学家Sanger，于1977年建立，他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用 三十多年，现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的， 现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪，是经过国际和国家认证的仪器，可重复性达到100%，是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小，适合少量样本，可进行个性化位点检测，成本极高，比芯片 或高通量检测高100倍。 Taqman法： 准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。 质谱法： 准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会 出现少量假阳性和假阴性。 二代基因检测芯片法： 适合于超多位点，大量样品检测和科研参考，每个样本做几百个位点和做几千个位点 的检测成本，相差无几，最大优点是成本低廉，一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%，缺点是出来的大量数据，可信度不高。 我们都知道“是药三分毒”，癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤，甚至化疗 整个过程费钱费力却“不讨好”，所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测，会让靶 向药物治疗事倍功半。 肺癌的靶向药基因检测，现在很多公司都可以做，医院基本上也是外送公司做，看你 检测几个几个基因，一般不会超过7200，一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1，C-MET，中源协和基因检测。 一般的，基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检 测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、 遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检 测技术做出诊断。
分类号：R 378.91+1 密级：一般 U D C ：616-093 编号：2010212554 广州医学院 硕士学位论文 结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与分析 研究生：杨辉 导师：吴爱武教授 陈心春教授 申请学位级别：医学硕士年级：二零一零级 学科专业：临床检验诊断学研究方向：感染与免疫 论文提交日期：2013年5月论文答辩日期：2013年6月 学位类型：医学科学学位学位授予单位：广州医学院 答辩委员会主席： 评议人： 二0一三年三月
广州医学院 硕士研究生学位论文 结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与 分析 Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis 专业名称: 临床检验诊断学 研究生: 杨辉 导师: 吴爱武教授 陈心春教授 二0一三年三月·广州
目录 中文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1 英文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4 英文缩略词~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 7 前言~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~8 第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB 基因的检测与分析~~~~~~~~~~~~ 11 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 11 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~16 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~18 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~20 第二部分异烟肼耐药结核分枝杆菌相关耐药基因的检测与分析~~~~~~~~~~~21 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 21 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~27 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~30 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~31 第三部分HRMA技术检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药~~~~~~~~~~~~ 32 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 32 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~36 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~42 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~44 全文总结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 45 参考文献~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 46 综述~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~51 附录~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~59 攻读学位期间取得研究成果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 61 致谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~63 学位原创性声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 学术论文知识产权声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 关于学术论文使用授权的说明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64
2、试剂和耗材） GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195） d NTP Mix （Promega,P 151B） PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司） Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、 仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国） 1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取 取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无
利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用 摘要目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。方法88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。结论PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。 关键词利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测 利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的 4.8%，而在我国则更为严重。耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药敏试验进行分析，现报告如下。 1 材料与方法 1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。 1. 2 去污染处理将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中，震荡混匀，静置20 min，再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中，3000 r/min离心1 min，沉淀后去除上清液，将1 ml磷酸缓冲液加入其中，混匀，获得去污染样本。 1. 3 方法 1. 3. 1 比例法药敏试验取适量去污染样本在酸性固体罗氏培养基上接种，在37℃温度下培养7 d，菌群鉴定采用齐-尼氏染色法，共得结核分枝杆菌分离株64株。制备10-2 g/L和10-4 g/L菌悬液，各取0.01 ml采用划线法接种在含药培养基及对照培养基表面，37℃温度下培养4周，≤1%为敏感。
分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究 进展 摘要: 近年对结核杆菌耐药机制的研究表明，rpoB基因是利福平耐药相关基因，耐药株通常发生特定位点基因突变，因此可以通过鉴定突变有无而评估其利福平耐药性，本文对这方面研究做一简要综述。 结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，估计目前全世界每年有800万新病例发生，290万人死于结核病，是当今单一致病菌致死的最主要死因。近十几年来结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，产生原因之一是耐药菌株的产生和播散。1990年我国结核病流行调查结果表明，我国临床分离株耐药率达39.9％，初始耐药率31.7％，复治继发耐药率47.8％。利福平是一种主要的抗结核药物，对利福平耐药常常导致化疗失败，且被认为是多耐药菌株的标志之一。因此早期迅速对结核患者利福平耐药性进行鉴定十分重要。现将有关研究进展做进一简要综述。 传统方法依靠直接或间接含药培养进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，并且可以了解其对利福平耐药程度。但各实验室间所用培养基不同，检测方法不同，结果判定标准不一，导致结果报告差异，并且由于结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌，使得耐药培养耗时长，通常需8～12周，不能满足现代短程化疗需要。 近年发展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培养及药敏测定可以大大缩短结果回报时间，但此法建立在培养方法基础上仍需数天出结果，加之仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床广泛应用。 1 利福平耐药基因的研究 关于结核杆菌利福平耐药机制一直存在三种假设，膜通透性改变、耐药质粒介导及染色体组基因突变（耐药性有关基因），其中已证实耐药基因突变与利福平耐药有密切关系。 对于细菌利福平耐药基因研究首先在大肠杆菌取得重要突破。首先发现利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变并且只发生在β亚单位上，并推知产生这种β亚单位突变的基因位点相接，进一步对基因研究获得了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚单位基因（rpoB）序列，并发现耐利福平的大肠杆菌有rpoB基因突变。由于编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈高度序列保守性，根据对大肠杆菌利福平耐药基因的研究资料，Telenti[1]首先对结核分支杆菌利福平耐药基因突变进行了全面研究，发现在与大肠杆菌rpoB基因突变高发区（Ⅰ区）相应位点（511～533aa）的长69bp片段内，64/66耐药株有突变发生，而未见于56株利福平敏感结核菌株。此后许多研究都证实这一结果，并发现发生于此区城内新的突变位点[2～5]。而Miller[6]做了这样一项研究，他应用致点突变技术造成编码rpoB基因531号氨基酸（参考大肠杆菌基因位点）碱基突变并将其导入利福平敏感的耻垢分支杆菌株LRZZZ中，使之发生了表型改变，即由原来的利福平敏感株转为利福平耐药，也证实rpoB基因突变是导致利福平耐药的唯一原因。Williams[4]对一患者感染的结核杆菌株发生利福平耐药表型转换前后做了rpoB基因序列分析研究，证实表型发生改变后其耐药基因发生了改变。但ropB基因突变致利福平耐药详细机制目前还未十分明了。
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂 技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 本指导原则所述肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。 本指导原则所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、
拷贝数异常及核糖核酸（RNA）表达异常等广义的基因突变。 本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、Luminex平台或核酸检测芯片等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性选择适合的方法或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化治疗指导的其他方法学。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化治疗方案的相关性，说明理论依据。 提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。 （二）产品说明书 说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书
肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、
广州医学院 硕士研究生学位论文 结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与 分析 Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis 专业名称: 临床检验诊断学 研究生: 杨辉 导师: 吴爱武教授 陈心春教授 二0一三年三月·广州
目录 中文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1 英文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4 英文缩略词~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 7 前言~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~8 第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB 基因的检测与分析~~~~~~~~~~~~ 11 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 11 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~16 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~18 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~20 第二部分异烟肼耐药结核分枝杆菌相关耐药基因的检测与分析~~~~~~~~~~~21 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 21 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~27 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~30 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~31 第三部分HRMA技术检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药~~~~~~~~~~~~ 32 1.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 32 2.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~36 3.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~42 4.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~44 全文总结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 45 参考文献~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 46 综述~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~51 附录~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~59 攻读学位期间取得研究成果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 61 致谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~63 学位原创性声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 学术论文知识产权声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 关于学术论文使用授权的说明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64