发酵工程综合实
验报告
实验题目
蛋白酶的发酵工艺研究
院系名称 生物与食品工程学院
学院：生物与食品工程学院
2015年 7月 31日
学生姓名 杨益坤 学 号 2012214114 专业班级 生物技术12-1班 指导教师 杨 柳
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关键词2
1.引言2
2.材料与方法3
2.1材料3
2.1.1菌种3
2.1.2试剂3
2.1.3培养基4
2.1.4实验仪器4
2.2方法4
2.2.1蛋白酶酶活测定4
2.2.2总可溶性糖测定5
2.2.3枯草芽孢杆菌发酵实验6
2.2.4发酵罐实验6
2.2.5蛋白酶性质实验7
3.结果与分析7
3.1透明圈观察7
3.2标准曲线8
3.2.1酪氨酸标准曲线8
3.2.2葡萄糖标准曲线9
3.3不同装液量摇瓶发酵实验9
3.4小型发酵罐发酵实验11
3.5蛋白酶性质研究12
3.5.1最适pH测定及pH影响酶稳定性的研究12
3.5.2最适温度测定及p温度影响酶稳定性的研究13
3.6小结15
4.致16
5.参考文献17
蛋白酶的发酵工艺研究Study on Protease Fermentation Conditions
摘要：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能够产生大量的蛋白酶，是进行蛋白酶研究的良好材料。本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。
我们控制装液量为唯一变量，测定酶活及总糖变化，最终确定最佳装液量条件为60ml。在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH为5。我们挑选透明圈较大的菌落在小型发酵罐进行发酵，定时取样测定酶活与总糖，绘制发酵曲线，从而了解菌体生长情况。
Abstract:
Bacillus subtilis can produce much protease and can be a good meterial for research about protease.The purposes of this experiment are learning how to measure protease qualitatively and quantificationly,investigating how the nutrition and environment influence the output of protease,and trying to be familiar with small-sized fermentation cylinder.
We controlled fluid volume as the only variable quantity,measured enzyme activity and total sugar quantity,finally confirmed that the best fluid colume condition is 60ml.On this basis,we moved forward a single step to conclude that the best temperature is 40℃ and the best pH is 5.We chose the bacterial colony with bigger transparent circle to ferment in the small-sized fermentation cylinder,measured enzyme actity and total sugar quantity at regular time,then drew the fermentation curve,consequently we could know how was the situation of the growing bacterium.
关键词：
枯草芽孢杆菌,蛋白酶,酶活,总糖,装液量
Keywords:
Bacillus subtilis,protease,enzyme actiivity,total sugar quantity,fluid volume
1.引言
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等【1】。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富【2】。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。
蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物脏、植物茎叶、果实和微生物中【3】。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。此外，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶都是人体消化道中的蛋白酶，在它们的作用下，人体摄入的蛋白质被水解成小分子肽和氨基酸。
目前在焙烤工业中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶和植物蛋白酶。面包生产中应用蛋白酶能改变面筋性能，其作用形式和面包调制时力的作用及还
原剂的化学反应不同。蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵。
随着蛋白酶制剂应用研究的不断深入，人们逐渐发现了蛋白酶在动物营养上的独特作用，蛋白酶也因此受到了越来越多的关注【4】。但目前无论是对蛋白酶的基础研究还是应用研究都还存在很多不足，需要加强以下方面的工作：①筛选和培育产蛋白酶含量高的微生物菌种，并且这些菌所产的蛋白酶必须稳定性好，适合在饲料工业中应用；②研究不同pH值特性的蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）在动物消化道的相互作用；③研制具有多种用途（如既可补充动物源酶不足又可降解抗营养因子）的复合蛋白酶；④根据不同的日粮类型和动物生长阶段，开发专用的蛋白酶产品；⑤加强蛋白酶在生长和成年动物上的应用研究；⑥研究蛋白酶对动物源酶和饲料中其它外源酶的影响【5】。
本次实验目的在于学习蛋白酶的定性定量测定方法，考察营养及环境对酶生产的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用。最终确定最佳装液量条件为60ml。在此基础上，我们进一步确定了最适温度为40℃，最适pH=5。此次试验能够帮助我们了解蛋白酶的性质，确定酶的最适条件，熟悉小型发酵罐的操作工艺流程。
2.材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2.1.2 试剂
（1）生理盐水：称取0.85gNaCl，用蒸馏水定容至100ml，即为0.85%生理盐水, 121℃灭菌20min。
（2）福林试剂(Folin试剂):使用时加2倍蒸馏水稀释,即成已稀释的福林试剂。（3）0.4mol/L碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠42.4g，用蒸馏水定容至1000mL。（4）0.4mol/L三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水定容至1000mL。
（5）pH 7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g，用蒸馏水定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol /L pH 7.2的磷酸
盐缓冲液。
（6）2%酪蛋白溶液: 准确称取干酪素2g, 称准至0.002g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
（7）100μg/mL酪氨酸溶液: 精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g, 逐
步加入6mL 1mol/L盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.21mol/L盐酸定容至100mL, 即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱保存,以免繁殖细菌而变质。（8）蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
（9）标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml 备用。
2.1.3 培养基
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（g/100ml）：牛肉膏0.5，蛋白胨1，氯化钠0.5，pH 7.0-7.2 ，121℃灭菌20min 。
（2）酪蛋白培养基（g/100ml）：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5, 奶粉5，琼脂2， pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min 。
（3）细菌种子培养基1: 牛肉膏蛋白胨培养基。
（4）细菌基本液体发酵培养基（g/100ml）：豆饼粉3.0，玉米粉4.0，麸皮粉2.5，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾 0.03，pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min 。（5）PDA酪蛋白培养基（100ml）：马铃薯汁（20%）100ml，奶粉5g，琼脂粉2g，自然pH，121℃灭菌20min。
2.1.4 实验仪器
试管，烧杯，移液管，锥形瓶，胶头滴管，100ml容量瓶，移液枪，恒温振荡箱，恒温培养箱，培养皿，水浴锅，分光光度计，离心机，离心管，比色皿等。
2.2 方法
2.2.1 蛋白酶酶活测定（福林-酚法）
原理：福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为