中国微循环2002年2月第6卷第1期
?9??论著?文章编号:1007-8568(2002)01-0009-02人胚脑皮层神经干细胞的分离培养及鉴定陆华,蒋云召,苗宗宁,周建宏,唐志放,陆爻忠,卞林,惠国桢
【摘要】目的从人胚脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞,并进行培养、传代、分化观察,采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin )抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果从胚龄10周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论人胚脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。
【关键词】神经干细胞;人胚胎;脑皮层;培养;克隆;鉴定
中图分类号:R331.1+4文献标识码:A
Isolation Culture and Identification of N eural Stem Cells from H um an Embr y onic Cerebral Cortex LU Hua ,J IANG Yun -zhao ,MIAO Zon g -nin g ,et al.De p artment o f Neur osur g er y ,Wuxi Third P eo p le’s H os p ital.Wuxi 214041,China
【Abstract 】
Ob j ective T o isolate ,culture and identif y neural stem cells from embr y onic cerebral cortex.Methods B y usin g serum -free cell culture and sin g le cell clone test ,a cell line that had the abili 2t y to form clones w as isolated from hum an embr y onic cerebral cortex.T he cells from a clone w ere cultured ,p assed and differentiated.Immunof1uorescence test w as used to detect Nestin anti g en of the clone and s p e 2cific anti g en of m ature neural cell after the clone w as differentiated.R esults A hum an neural stem cell line from fresh embr y onic cortex at E90w as established ,the cell could be cloned and p assed continuousl y ,ex p ressin g Nestin anti g en.M ature neural cells after differentiation could ex p ress s p ecific anti g ens of neuron ,astroc y te and oli g odendroc y te.Conclusions Hum an embr y onic cerebral cortex has neural stem cells ,which are multi p otent and have the abilit y to self-renew.
【K e y w ords 】Neural stem cell ;Hum an embr y o ;Cerebral cortex;Culture ;C lone ;Identification 作者单位:214041江苏省无锡市第三人民医院神经外科(陆华,
蒋云召,苗宗宁,周建宏,唐志放,陆爻忠);苏州大学医学院附属第一
医院神经外科(卞林,惠国桢)
第一作者简介:陆华(1969-),男,汉,江苏无锡人。主治医师,硕
士研究生,主要从事颅脑外伤急救及神经修复研究。神经干细胞的发现是神经科学领域的重大突破,
为神经发育和神经组织移植等研究领域开辟了广阔前
景。有关哺乳动物胚胎阶段和成年动物在特定脑区存
在神经干细胞已不断得到证实[1,2,3]。但对人类神经干
细胞的研究尚少。本实验采用无血清培养和单细胞克
隆技术从人胚脑皮层中分离得到具有自我更新和多分
化潜能的神经干细胞,并采用免疫荧光染色予以鉴定。
材料和方法
1
原代细胞的分离和培养:取胚龄10周自然流
产的新鲜人胚胎,无菌条件下分离出胚胎大脑皮层组
织,剥除脑膜及表面血管,在P BS 液中漂洗三次,用细
吸管反复吹打组织碎块至完全散开,离心洗涤后吹打
制成细胞悬液,经100目不锈钢滤网过滤,制成单细胞悬液,加入含B27(1∶50G ibcoBR L )和EG F (S erotec.)20n g /m l 、bFG F (Chem icon )20n g /m l 的DMEM/F12(1∶1)(G ibcoBR L )无血清培养基,台盼蓝染色计数活细胞,调整细胞浓度为1×105m l -1,将原代细胞种植于25平方厘米培养瓶(8m l 细胞悬液/瓶),37℃,5%CO 2条件下静置培养。2传代培养及单细胞克隆、传代:待原代克隆形成后用吸管轻柔吹打进行机械分离,制成单细胞悬液,用含B27和EG F 、bFG F 的无血清培养基将细胞悬液按1×106m l -1浓度传代接种于培养瓶,在37℃,5%CO 2条件下静置培养,计数每代的克隆形成率。根据细胞增殖情况及细胞密度每7～9d 机械分离传代,方法同前。采用有限稀释法,将原代细胞以及2周后的传代细胞制成的单细胞悬液,稀释到40m l -1,于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液,每孔100μl ,选取仅有一个细胞的培养孔作标记,并动态观察。待1个细胞长成单细胞克隆球后再次机械分离成单细胞悬液,所有细胞种
至培养瓶中,待次代克隆长成后连续传代,最后得到来自单个细胞的大量克隆球。
3克隆诱导分化:选取单细胞形成的克隆球,机械分离成单细胞悬液,种植于多个培养皿中,置入多聚赖氨酸包被的玻片,分别用无血清培养基(DMEM/F12/ B27/bFG F/EG F)和含血清培养基(DMEM/F12+5%胎牛血清)培养,观察其生长分化情况,分别于12h、2d、7d、14d行免疫荧光检测。
4间接免疫荧光检测:将贴附有细胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定,用抗Nestin(BD Pharm in g en)、NSE (Antibod y Dia g nostica Inc.)、G FAP(Bio G enx)、CNP(Chem i-con)I g G和FIT C荧光二抗(S i g m a)行免疫荧光染色。
结果
1细胞形态学观察:人胚脑皮层原代细胞成圆形球状,悬浮生长,经台盼蓝染色计数活细胞在60%以上,培养2d后发现活细胞数逐渐下降,7d后细胞数目开始增加,2周后可见数十个至数百个细胞组成的细胞球及细胞团。细胞形态规则,边界清楚,折光性强。有部分细胞增大数倍,具有极强折光性,可见分裂增殖,细胞团中亦可见此类细胞,并可见从细胞团中向外游出。少数细胞贴壁生长,呈小梭状或三角状,尖端有细小突起伸出,若周围有贴壁细胞,则可以伸出较长的细突起互相连接呈网状。原代细胞克隆形成率约0.5%～1%,次代细胞克隆形成率约10%～20%。单细胞克隆试验显示单个细胞在培养7～10d后,部分细胞开始分裂增殖,此后随着细胞数增加生长增殖速度逐渐增快,形成细胞克隆球。经传代后仍成悬浮生长,强折光性,细胞形态不变(图1,见封3)。
2诱导分化结果:单细胞克隆后获得的克隆细胞在有血清培养基中培养,12h后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出,其中可见少量球形细胞团向四周发出放射状条索,与周围细胞互相联接。2d后可见大部分细胞贴壁生长,形态不规则,突起不断增粗和伸长,一周后分化成大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞,突起互相交织成网状(图2,见封3)。2周后部分神经细胞开始衰退、死亡。
3间接免疫荧光检测:将原代、传代和单细胞克隆的细胞进行Nestin免疫荧光染色,结果显示大部分细胞呈Nestin抗原阳性。传代3次以上的克隆细胞90%以上均呈强阳性(图3,见封3),同时NSE、G FAP和CNP免疫荧光染色均呈阴性。经含血清培养基培养12h,2d、7d、14d行NSE、G FAP和CNP免疫荧光染色显示均有阳性表达细胞存在,并随着分化时间延长,阳性细胞表达逐渐增多增强(图4,见封3)。Nestin免疫荧光染色在7d时尚可见部分阳性细胞,2周时几乎未找到Nestin阳性细胞。
讨论
神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞,它处于分化的非终末状态,可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞,最终产生中枢神经系统的三种主要细胞,即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞[4]。一般认为神经干细胞主要存在于哺乳动物胎脑的纹状体、小脑半球、脑室区等,成年哺乳动物脑的侧脑室壁和海马等区。我们首次从人胚大脑皮层中分离到具有克隆能力的细胞,而且这种自我更新能力维持了相当时间,即使传代10次以后仍保持了这种克隆能力。
神经干细胞比其他细胞具有更高的密度依赖性,故常规的细胞克隆方法较难进行单细胞克隆。尽管Huls p an[5]单细胞克隆未能成功,但我们采用单细胞克隆方法证明了单个细胞能够分裂成克隆细胞群。由于原代神经干细胞的克隆形成率较低,故需反复进行单细胞克隆才能成功,我们实验结果与Re y nolds[6]等相同。培养2周后的传代细胞进行单细胞克隆较易成功。克隆形成率亦表明次代细胞较原代细胞较容易形成克隆,大部分细胞将死亡和分化,只有部分细胞保持干细胞样属性。
Lendahl等[7]鉴定出一种神经元中间丝蛋白,即巢蛋白(Nestin),其表达始于神经胚形成时,在神经迁移及分化开始后逐渐消失,并随神经细胞的分化完成而停止表达,已作为神经干细胞的主要标志物。本组人胚皮层原代及传代的克隆细胞尤其是传代3次以上90%的细胞Nestin染色呈阳性,但对成熟神经元抗体NSE 和胶质细胞标记物G FAP表达阴性,证明本实验中的克隆细胞为神经干细胞。
多分化潜能是神经干细胞的一个基本属性。为排除混合细胞培养中多种单潜能细胞互相聚集形成假克隆而出现假阳性,本实验采用单细胞克隆形成的克隆细胞来证实神经干细胞具有多分化潜能。免疫荧光染色证明在分化中的细胞中具有NSE、G FAP、CNP表达阳性的细胞。分化一周后也有少数细胞表达Nestin阳性,但随着诱导分化的发展而逐渐减少至完全消失。
神经干细胞的发现为神经发育和中枢神经系统功能重建提供了一条新的思路。本实验成功地进行了人胚脑皮层神经干细胞的分离、培养和鉴定,为进一步深入研究神经干细胞的定向分化诱导及其临床应用奠定基础。
(下转第24页)
HUVEC粘附的影响,先以含100μg/m l OX-LDL的培养液在37℃孵育6h,预处理HUVEC后加入含有1×105个/m lU937细胞悬液200μl,孵育30m in后,计数粘附的细胞数。结果显示,OX-LDL组(n=26)粘附率(%)为20.22±8.29,对照组(n=14)为5.97±4.09。表明OX-LDL能显著增加U937细胞与HUVEC之间的粘附(P<0.01)。
讨论
本研究为观测血清胆固醇浓度对红细胞变形性、白细胞自发活化状、粘附分子表达及粘附性采用了食饵性高胆固醇血症家兔模型。为了观测OX-LDL对VEC功能的影响,采用了体外培养的HUVEC,其目的在于使影响因素单一,条件较好控制。
动物模型的观测结果表明:血清cho浓度升高可引起红细胞变形性降低,循环白细胞SAR升高及粘附分子表达增加、粘附性升高。血清cho升高可引起一系列不良后果:其一,血清cho浓度升高引起红细胞膜脂中cho/p l值升高,使膜微粘度增加,膜变硬,变形性下降,从而引起全血粘度升高,血流阻力增加;其二,血清cho浓度升高可激活血浆中补体,进而激活白细胞,使循环白细胞SAR升高,活化的白细胞产生呼吸爆发,释放大量超氧阴离子(O2 -)自由基及蛋白酶[6],它一方面引起红细胞膜脂质过氧化损伤,使其变形性降低,另一方面可引起血脂氧化,将LDL转变成OX-LDL,同时O2 -还可灭活NO,使血管内皮依赖性舒张功能减退;其三,血清cho浓度升高可引起血小板(Pt)膜组成改变,使Pt反应性增强,对血管壁的粘附性增加,活化的Pt可参与AS形成和引发血栓形成。因此,由于血清中cho浓度升高引起的血细胞结构和功能的变化对组织和器官缺血、缺氧的发生发展起着重要作用。
由于LDL是胆固醇主要携带者,有关LDL与AS 之间的关系国内外已作过大量研究。近年来有关OX-LDL与AS的关系倍受重视,LDL很容易被Cu2+和Fe2+氧化,也可被活化的白细胞和VEC释放的O2 -氧化修饰成OX-LDL。已知OX-LDL对VEC有毒性作用,能抑制NO和PGI2释放,增加ET释放引起血管收缩反应,使血管通透性增加,引起VEC皱缩甚至脱落,增加LDL内皮下渗入。OX-LDL可刺激VEC粘附分子表达,促进单核细胞在内皮粘附,OX-LDL对单核细胞具有趋化性。本研究结果证明了OX-LDL可显著增加HUVEC的ICAM-1的表达,增加U937细胞对HUVEC 的粘附,还可显著增加HUVE L M CP-1蛋白的表达。M CP-1是单核细胞的特异性强趋化蛋白[7]。M CP-1和ICAM-1是介导单核细胞向VEC趋化和粘附、并向内皮下迁移的重要物质,而这些变化正是AS发生中的早期细胞行为。由此可见高胆固醇血症引起的血细胞及VEC结构和功能的改变在AS及一些心脑血管病的发生和发展中起重要作用。
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(收稿2000-09-05修回2001-04-02)
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7Lendahl U,Z imm erm an LB,M cka y RG https://www.doczj.com/doc/493046572.html,S stem cells ex p ress a new class of interm ediate filam ent p rotein[J].Cell.1990,6:585～595
(收稿2001-12-15)
(上接第10页)
神经干细胞的研究及其应用新进展 [关键词] 神经干细胞研究 健康讯: 崔桂萍天津市脑系科中心医院 300060 1992 年， Reynolds 首次成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（ neural stem cell, NSC ），于是“神经干细胞”这一概念被正式引入神经科学研究领域。可以总结为具有分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。不少文献中还提到神经祖细胞和神经前体细胞，目前认为，神经祖细胞是指比 NSC 更有明确发展方向的细胞，而神经前体细胞是指处于发育早期的增殖细胞，可指代 NSC 和神经祖细胞：与 NSC 相比，二者的分裂增殖能力较弱而分化能力较强，是有限增殖细胞，但三者均属 NSC 范畴。 1. NSC 的起源、存在部位及生物学特征中枢神经系统的发育起源于神经沟、神经嵴、神经管；研究发现， NSC 在神经管壁增殖，新生细胞呈放射状纤维迁移至脑的特定位置；主要存在于室管膜区，在成脑生发区以外的区域也广泛分布，即具有高度可塑性的神经前体细胞。现发现 NSC 的生物学特征为：（ 1 ）具有自我更新能力；（ 2 ）具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞；（ 3 ）处于高度未分化状态；（ 4 ）终生具有增殖分化能力，在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中（ 1 ）和（ 2 ）是 NSC 的两个基本特征。 2. NSC 的基础研究进展 NSC 的增殖和分化调控是目前 NSC 研究的核心问题，最近的研究资料显示， NSC 的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。神经递质神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递，还参与 NSC 的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨酸（ G1u ）、 5- 羟色胺（ 5-HT ）、 GABA 、甘氨酸（ G1y ）、乙酰胆碱（ Ach ）一氧化氮（ NO ）、肾上腺素与性激素等。 G1u ：在脑的发育过程中有高含量的 G1u 表达， Haydar 等发现， G1u 可以通过大鼠胚胎皮质 AMPA/KAR 的激活调节室周区前体细胞的增殖，但 GLU 对室管膜区（ SZ ）和室管膜下区（ SVZ ）体内细胞的影响是不同的，它可增加 SZ 细胞的增殖，减少 SVZ 细胞的增殖； GLU 还可促进神经元生长和分化。 5-HT ：许多研究表明， 5-HT 在皮质发育、突触形成中起重要作用，抑制 5-HT 合成或选择性损伤 5-HT 神经元则引起齿状回及脑室下区神经元增殖活性下降， 5-HT 可促进胶质细胞分化和髓鞘形成。 GABA ： GABA 是成体脑发育过程中主要
肠神经干细胞研究进展 神经干细胞主要有两类：中枢神经干细胞和外周神经嵴干细胞。中枢起源的神经干细胞研究颇多，而外周起源的神经干细胞研究还刚刚起步。两者具有很多相似性。目前研究表明，在肠道内有神经嵴来源的神经干细胞池[1]。本文就肠起源的神经干细胞—肠神经干细胞（(Enteric neural stem cells，ENSCs)），对其生物学特性，迁移分化调控因素，应用前景等做一概述。 一．肠神经干细胞与肠神经系统 具有多向分化潜能的干细胞可以从出生以后的人类及啮齿类动物的大脑、胰腺、肝脏、骨髓等获取，进行体外培养并研究其相关性状。有报道，从肠管也可以获取干细胞[2] 。这种细胞在个体中一生都存在，且可以分化为神经元、神经胶质细胞以及其他细胞，具备自我更新和多向分化潜能等干细胞特性，这种细胞即为“肠神经干细胞”(Enteric neural stem cells，ENSCs)。 肠神经干细胞起源于神经嵴。在个体发育过程中，其通过迷走神经嵴在胚胎早期迁移进入肠道，从头端至尾端向成熟分化，发育形成肠神经系统[3]。国内外研究者对其不同的命名，但通过分离培养以及生物学性状的研究证实为同一种细胞。Morrison[4]等将其称为肠神经嵴细胞（Enteric neural crest cells ，ENCC）或肠神经嵴干细胞（Enteric neural crest stem cells，ENCSC），在胚胎发育时期或成年组织中，从消化道中分离出神经嵴干细胞,进行体外培养，并进行了一系列鉴定，证明其具备干细胞特性，且主要分化为神经元和神经胶质细胞。Natarajan[5]等在研究中则将其称为“肠神经系统源性的多能祖细胞”(Enteric nervous system derived multipotential progenitor cells,ENSPCs)，从小鼠胚胎或出生后的肠管中制取单细胞，行体外培养后可以获取。国外学者Y oung[6]和Suarez-Rodriguez [2]等在研究中则称其为“肠神经干细胞”（Enteric neural stem cells，ENSCs）。 肠神经干细胞和肠神经系统的发育密切相关。脊椎动物的肠神经系统是外周神经系统中最复杂的部分。它是由大量的、不同种类的神经元和神经胶质细胞构成的。相互连接的神经节，围绕肠壁、外肌层、以及内部的粘膜下层的辐射轴，排列成两个同心圆状。如同外周神经系统的绝大多数细胞一样，肠神经系统完全起源于神经嵴。大多数肠神经系统的祖细胞产生于1-7 体节听泡后方的后脑迷走神经嵴。从神经管脱离不久，迷走神经嵴亚群向腹外侧移动，聚集在中间后肢区，移向主动脉背侧颈丛腹外侧，在局部信号的影响下，迷走神经嵴细胞会诱导表达RET酪氨酸激酶受体。在孕9.5 天至10 天这些RET+迷走神经嵴侵入前肠肌层，称为“肠神经嵴细胞”,即肠神经干细胞，接下来的 4 天，则会向尾侧迁移以定位于整个肠段。发育过程中，如果肠神经干细胞迁移、定位失败，就会导致肠神经节的缺失，形成神经节细胞缺失症。这种情况发生在结肠部位，会形成先天性巨结肠症，即神经节细胞缺失，导致分泌调节障碍和严重的肠道阻塞[6]。 肠神经干细胞与肠神经系统的发育密切相关。肠神经干细胞的出现为研究肠神经系统的发育提供了一个较为理想的模型，可以来研究肠神经形成过程中的分化、调节的影响因素，为阐明神经发育提供有力的证据由此可解释肠神经系统发育和修复的一些机制，此外，肠管作为器官，易于进行活检，且肠神经分布丰富，其与中枢神经系统具有许多共性。据此，可以就有可能采用肠神经干细胞对一些中枢或外周神经缺失性疾病行细胞移植替代治疗了。二．肠神经干细胞的生物学特性 作为干细胞，其特性简要概况即：①可自我复制更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备②处于较原始的未分状态，无相应的成熟细胞的特异性标志③具有多向分化的潜能，即演变成不同类型成熟细胞的能力。要识别肠神经干细胞，可以从三个方面
神经干细胞的应用前景及研究进展 生科1301班李桐 1330170031 神经干细胞( neuralstem cells, NSCs)是重要的干细胞类型之一，是神经系统发育过程中保留下来的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经细胞。具有很多的特性，如自我更新、多潜能分化、迁移和播散、低免疫原性、良好的组织相容性、可长期存活等。目前神经干细胞的分离与体外培养已取得可喜的进展，有关神经干细胞的研究已经成为国内外神经科学领域的热点。 一、神经干细胞的生物学特性 19世纪80年代提出了神经干细胞的概念，它是指一类多潜能的干细胞，能够长期自我更新与复制，并具有分化形成神经元、星形胶质细胞的能力。神经干细胞的主要特征：未分化、缺乏分化标记、能自我更新并具有多种分化潜能。它并不是指特定的单一类型的细胞，而是具有相类似性质的细胞群。Gage将神经干细胞的特性进一步描绘为以下三点，可生成神经组织或来源于神经系统，具有自我更新能力，可通过不对称法、分裂产生新细胞。神经干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞只有有限的自我更新能力，并自主分化产生神经元细胞和成胶质细胞。神经干细胞是具有自我更新和具有多种潜能的母系神经细胞，它能分化成各种神经组织细胞表型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.并能自我更新产生新的神经干细胞，在神经发育和神经损伤中发挥作用。神经干细胞移植、迁移及分化与局部环境密切相关，这种特性为移植及移植后的结构重建和功能恢复提供了依据，为移植治疗不同疾病提供了局可能。 二、神经干细胞的应用前景 1.细胞移植以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。神经干细胞的存在、分离和培养成功，尤其是神经干细胞系的建立可以无限地提供神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论，为损伤后进行替代治疗提供了充足的材料。研究表明，干细胞不仅有很强的增殖能力，而且尚有潜在的迁移能力，这一点为治疗脑内因代谢障碍而引起的广泛细胞受损提供了理论依据，借助于它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的附加损伤。另外，神经干细胞移植也为研究神经系统发育及可塑性的实验研究提供了观察手段，前文提及细胞因子参与调控神经元增殖和分化，通过移植的手段对这些因素的具体作用形式和机制进行探索，为进一步临床应用提供了理论基础。 2.基因治疗目前诱导干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的干细胞是这一领域的又一重大进展；另外已经发现许多细胞因子可以调节发育期甚至成熟神经系统的可塑性和结构的完整性，将编码这些递质或因子的基因导入干细胞，移植后可以在局部表达，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。 3.自体干细胞分化诱导移植免疫至今为止仍是器官或组织移植的首要问题。前文提到已经证明成年动物或人脑内、脊髓内存在着具有多向分化潜能的干细胞，那么使人们很容易想到通过自体干细胞诱导来完成损伤的修复。中枢神经系统损伤后，首先反应的是胶质细胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成胶质瘢。其实在这个过程中也有干细胞的参与，可不幸的是大多数干细胞增殖后分化为胶
第24卷第1期菏泽医学专科学校学报VOL.24NO.1 2012年JOURNAL OF HEZE MEDICAL COLLEGE2012 doi:10.3969/j.issn.1008-4118.2012.01.01 躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗 坐骨神经损伤的实验研究 杨洁 (菏泽医学专科学校,山东菏泽274000) 摘要:目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10.5d Wistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞，将体外培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上，观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经，术后进行电生理、组织学检测，观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增；将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察，可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面，存活良好，表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性；桥接手术后，电生理检测结果显示，含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组(均P<0.01)；甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显，再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组（均P<0.01）。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性，其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞，以此桥接缺损的周围神经，可促进其再生和修复。 关键词：躯干神经嵴干细胞；组织工程；壳聚糖纤维；神经再生 中图分类号：R616;R651.2文献标识码：A文章编号：1008-4118（2012）01-0001-05 An Empirical Study on Repairing the Injury of Sciatic Nerve with the Trunk Neural Creat Stem Cell and Chitosan Fiber to Compound the Slilica Gel-tube Yang jie (heze Medical College,heze,shandong,274000) Absrract:Objective We isolate and culture the trunk neural crest stem cell using tissue culture of neural tube in the E10.5 Wistar rat embryo in defined medium,then explore its’biological properties.Methods The trunk neural crest stem cells using tis?sure culture of neural tube in vitro were cultured on the chitosan https://www.doczj.com/doc/493046572.html,ed immunofluoresecence to indentify the trunk neural crest cells.Observed the histocompatibility of them,the trunk neural stem cells were cultured with the chitosan-slilca sebific duct scaffold, the growth of cells was observed by scanning electron microscope.10mm sciatic nerve defects were bridged with chitosan-slilca sebif?ic duct scaffold cultured with trunk neural stem cells,sebific gel tubes without trunk neural stem cells served as controls.After grafting, the regenerated nerves were evaluated by electrophysiological examination,histological staining,retrograde tracing and electron mi?croscope observe.Results Using tissure culture of neural tube,we can isolate and culture the trunk neural crest stem cells.The trunk neural crest stem can grow adhered on the chitosan fiber after inoculation.Scanning elector microscope,the trunk neural crest stem cell were spindle.proliferated and migrated along fiber.There is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neu?ral crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell..At8weeks after surgery,weak action potentials were found in the experiment group only.At14weeks after surgery,the conduction velocity and wave amplitude of experiment group was better than the control group,and the difference was evident（P<0.01）.Conclusion There is good histocompatibibity between the chitosan fiber and the trunk neural crest stem cells,the trunk neural crest stem cell can differentiate into Schwann cell.They con?tributed to the promotion of axonal regeneration. Key words:Neural crest；Stem cell;tissue engineering;chitosan;nerve regeneration 周围神经的损伤，再生和功能重建一直是外科领域中的难题之一。多年来临床常规的治疗方法是自体神经移植,但自体神经移植不仅会给供区带来新的创伤，而且常采用的供体—皮神经较细小，不能满足临床需要。绝大多数的周围神经是混合神经，它们含有多种纤维成分，所以当神经损伤后导致损伤近端及远端神经的对位关系紊乱从而影响神经的再生和功能修复[1]。虽然现在的显微外科技术十分 基金项目：菏泽医学专科学校基金研究课题（编号：H11K01）。1
神经干细胞研究进展 一、引言 神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群[1]。狭义的神经干细胞是指成体神经干细胞，指的是分布于胚胎及成人中枢及周围神经系统的干细胞。简单的说，就是在成年哺乳动物的大脑中分离出来的具有分化潜能和自我更新能力的母细胞，它可以分化各类神经细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。我们所讲的神经干细胞指的就是成体中存在于脑中的中枢神经干细胞，其实在外周也有一些“神经干细胞”称为“神经嵴干细胞”，可以分化成外周神经细胞、神经内分泌细胞和施旺细胞，还可横向分化成色素细胞和平滑肌细胞[2]。 神经干细胞具有以下特征：（1）有增殖能力；（2）由于自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个自细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可以分化为多种神经细胞；（3）具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化为不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征[3]。 需要注意的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。神经干细胞的治疗机理是：（1）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（2）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（3）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路[4]。 二、研究现状
神经干细胞研究介绍 陈晓萍 程君奇 (浙江大学生命科学学院浙江省细胞与基因工程重点实验室浙江杭州310029) 摘要 神经干细胞研究是近年脑科学研究的热点,本文综述了神经干细胞的分离培养方法、脑内迁移路线、发育分化的影响因素以及可能的应用前景。 关键词 神经干细胞 分离 迁移 发育 分化 脑的结构与机能一直是生命科学的研究难题,它以极其错综复杂而又高度易变为特征,至今仍保持着极大的神秘性。近年来科学家对神经干细胞的研究是脑科学领域的重要成果之一,它突破了以往一直认为的成年动物神经细胞不能分裂再生的观念,为神经细胞的发育分化过程,也为神经系统疾病的治疗开辟了一条全新的途径。 1 神经干细胞的分离培养 神经干细胞(N eural stem cells,N SCS)是指具有如下特征的细胞:1)能形成神经组织;2)具有自我繁殖和自我更新能力;3)细胞分裂后能发生分化[1]。 胚胎时期是神经系统快速增长发育的阶段,在这时期脑内的许多部位都存在神经干细胞,这包括大脑皮质、纹状体、小脑等区域。成年后,脑细胞一般不再分裂增殖。以往曾一度认为成年动物神经细胞完全失去了这种能力,但近年科学家在高等哺乳动物(包括人)的脑室管膜下层等区域发现了仍具有增殖分化能力的神经干细胞。另外,在啮齿类动物主管学习记忆的海马区,也发现了神经干细胞的存在[2]。 成年动物脑内的神经干细胞仅仅是保存了能进行分裂增殖的潜能,通常情况下得不到足够的正面刺激信号,因而并不分裂增殖,而是处于静止状态。 从脑组织分离培养神经干细胞需要特殊的条件,目前多采用生长因子刺激和细胞克隆技术。具体有3种方法[3]:1)用无血清培养液将脑细胞分离,再加入具有丝裂原作用的生长因子如表皮生长因子或碱性成纤维生长因子,待原代克隆形成后挑选单个克隆机械分离继续进行亚克隆培养,也可采用单细胞克隆分离;2)用反转录病毒向脑细胞内导入原癌基因,如V2m yc和SV40大T抗原等,部分细胞可因此获得持续分裂的能力;3)从脑组织以外的部位,如胚胎干细胞,经过适当化学因子的诱导,使其定向分化为神经干细胞。 外加化学因子对于维持神经干细胞的分裂增殖能力是必须的。培养液中如撤去外加的化学因子,改用普通培养,神经细胞会很快发生分化,失去分裂增殖能力。 2 神经细胞的发育及脑内迁移路径 神经系统的发育源于胚胎早期的神经管和神经嵴[4],其中的中央管经发育形成脑室系统和脊髓中央管,管腔内表面覆盖的上皮细胞具有活跃的增殖和分化能力,是神经细胞发生的来源。成年后这个区域称为室管膜 室管膜下区。 内径1～2mm的完全闭合的呼吸管。据B landfo rd报道,这种呼吸管中衬有外套膜组织。上述蜗牛的夏眠能从1月持续至6月。同时具有裂口、裂沟和缝合线管的结构有利于气体的循环。在足部和外套膜肌肉运动下,可促使气体交流和循环,贝类学家F ischer曾对冬眠期间的盖罩大蜗牛进行了研究,业已证明其足部和外套膜从未停止过运动。 8)喇叭状口和壳壁上的穿孔 A lycaeinae的种类,其成体的壳口呈喇叭状,其后逐渐缩小成一口颈。在口颈近缝合线的壳壁上有穿孔。A ly caeus属的种类,如A2 ly caeus m ajor壳壁上的孔由内向外通入一覆盖在缝合线上的管。管的截面略呈三角形。此管在缝合线上,略弯曲,呈带状,长约6～7mm,管的末端是盲端,但常破碎,即使不破碎,该管仍可进行气体交换。据分析这个带状结构比通常的贝壳更具通透性。因种类不同,喇叭口的长度有差异,缝合线管内开口到口缘距离也有所不同。喇叭状的壳口可能是为了蜗牛在夏眠期间有一个较大的气室,这与无厣贝类具有的盖膜腔情况相似。由此可以推断A ly caeus和Pup ininae的一些种类缝合线管在内部的开口可能与肺呼吸孔靠得很近。 其他的一些陆生螺类,如R um ina d ecollata和C lausilia的一些种类,在夏眠期间往往胚螺层失去,然而可能也有利于呼吸。破损的一端由内脏分泌的膜封住,这比休眠时螺壳倒下,靠外套膜边缘呼吸更利于气体交换。 (BF) — 8 1 —生 物 学 通 报 2003年第38卷第2期
成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定(一) 【摘要】目的：利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法：将新生1，5d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果：成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论：成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型. 【关键词】肠神经嵴干细胞小鼠细胞培养技术细胞分化Hirschsprung 病 0引言 应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的〔1〕.肠神经嵴干细胞（gutneuralcreststemcells,GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性〔2〕，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注,本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应
用建立理论基础. 1材料和方法 1.1材料新生1，5d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供.①DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子 巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）.②促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100mL/L 肽牛血清.③其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）.一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin 多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠ctin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）.二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉). 1.2方法 1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入 ，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30min，10min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800r/min离心5min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以6×108个/L接种到25mL培养瓶中，添加培养基至4mL.在37℃,50mL/LCO2,饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养.原代孵育24h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3d后进行传代，以6×108个/L接种到25mL培养
神经干细胞及其应用研究新进展 摘要：长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。现在，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)不仅存在于所有哺乳动物胚胎发育期的脑内，而且在其成年之后也有，这已为神经科学界所普遍接受。神经干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能，使神经系统损伤后的细胞替代治疗成为可能本文综述了神经干细胞的分布、生物学特性、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用，并对神经干细胞临床应用前景做出了展望。 关键词：神经干细胞细胞疗法多向分化潜能转分化性 1、神经干细胞的分布 大量研究表明成年哺乳动物的脑室下区、海马、纹状体、大脑皮质等区域均有NSCs存在，其中侧脑室壁的脑室下层(sub ventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(sub granular zone，SGZ)是神经干细胞的两个主要脑区。另外，研究者们还在成年哺乳动物脑内的其他部位发现了神经干细胞的存在，例如在黑质内发现了新生的多巴胺能神经元。 2、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用 2.1细胞替代治疗中外源性NSCs的使用 NSCs可以用来代替因为损伤或神经系统退行性病变而缺失的组织。理想的是重建组织适宜的结构并整合人周围组织；重要的是在这种治疗方案中，几种细胞类型需替代。在移植入成年啮齿动物脑内前，首先需从人胚胎干细胞或胎儿脑内分离出NSCs，并在体外诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。值得注意的是NSCs整合入室管下区的微环境，促成嗅球的神经发生。在海马，移植的神经祖细胞分化为特定区域的神经细胞亚型，并功能性整合入周围的环路。NSCs移植入疾病或损伤的啮齿动物模型中取得了预期的效果。移植入的存活的NSCs首先迁移到病变部位并分化。成年鼠的NSCs移植入多发性硬化大鼠模型后可观察到少突胶质细胞祖细胞、宿主和移植来源的成熟细胞数量增加，病情明显好转。在大鼠脑梗死模型中，移植的NSCs迁移到损伤部位并大部分分化为神经元。在脑出血模型中，由静脉移植的NSCs在损伤部位分化成神经元和星形胶质细胞，并引起了功能的恢复。将富有多巴胺神经元的胚胎腹侧中脑移植入去神经的帕金森鼠中，结果移植物中的多巴胺神经元修复了损害引起的功能缺损。神经干细胞植入大鼠亨廷顿病模型脑内能保护维持运动习惯的能力，受损的运动习性也可重新恢复，表明植入的细胞在体内形成了功能性连接。Mcdona等给胸髓损伤大鼠分别注入单纯培养基、成年小鼠皮层神经元和胚胎干细胞，2周后发现植入干细胞者后肢恢复部分负重与协调能力，明显优于前二者。田增明等报道了人胚胎神经干细胞治疗21例小脑萎缩患者，发现移植后临床症状有改善。 2.2脑损伤激发内源性NSCs 近年研究表明多种神经系统损伤均可激发内源性神经细胞再生。追踪巢蛋白阳性的神经祖细胞定殖在成年脊髓损伤区，可以观察到这种祖细胞扩增并在损伤区分化为神经元；在脊髓挤压伤、局灶性脑缺血中，在有正常神经发生的大脑皮质和海马可观察到NSCs的增生，并可以被外源性神经营养因子所加强。但在病理状态下这种内源性干细胞的修复反应很显然是不够的，大量实验已证实哺乳动
胚胎发育的第3周，三胚层胚盘已形成。此时，发育中的脊索和邻近的间充质诱导其表面的外胚层形成神经板，神经板在发育中，其柱状细胞变为上窄下宽的楔形，使神经板的外侧缘隆起，神经板的中轴处形成凹陷称神经沟，降起处称神经褶。神经褶的顶端与周围外胚层交界处称神经嵴。在胚胎第4周，两侧神经褶在背侧中线汇合形成神经管的过程中，位于神经嵴处的神经外胚层细胞，未进入神经管壁，而是离开神经褶和外胚层进入中胚层，这部分神经嵴细胞是特殊的多潜能干细胞。它们位于神经管和表面外胚层之间，形成沿胚胎头尾走向的细胞带，以后分为两条细胞索，列于神经管背外侧。这种上皮-间充质的转化是胚胎发生的关键因素。 胚胎第4周，神经嵴细胞发生广泛的迁移，衍化成机体不同的细胞并形成许多重要组织成分。神经嵴细胞的分化对于头颈部的正常发育尤为重要。它们分化成的组织及细胞有： 1.神经系统组织：Schwann细胞、面神经的膝状节、舌咽神经的上节和迷走神经颈节、与Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ各脑神经相联系的植物性神经节如睫状神经节、筛神经节、蝶腭神经节和颌下神经节、神经节内 神经元周围的卫星细胞、脑膜。 2.内分泌组织：甲状腺的滤泡旁降钙素细胞、颈动脉体的化学感 受器细胞和颈动脉窦的压力感受器细胞。
3.结缔组织：头面部的大部分结缔组织都来自于神经嵴细胞，由于它们起源于外胚层的神经嵴细胞，所以这些结缔组织又称外胚间叶组织或外间充质。它们包括面部所有的骨、颅骨、鳃弓软骨、牙本质、牙骨质、牙髓、牙周膜、血管周细胞、血管平滑肌。横纹肌、腺体及皮肤脂肪组织的周围组织也来自神经嵴细胞。此外，还包括眼角膜、巩膜和睫状肌，以及甲状腺、甲状旁腺、泪腺和涎腺的结缔组织。 4.皮肤组织：皮肤及黏膜的黑色素细胞、真皮及其平滑肌。 神经嵴细胞迁移丌始的标志是细胞间黏附分子N-钙黏蛋白结合部位转化为H-钙黏蛋白结合部位。迁移的细胞还有L1黏附分子的高 表达。 神经嵴细胞的迁移和分化主要受多种信号分子和基因的调控，信号分子主要有维甲酸、成纤维细胞生长因子（FGF）、内皮素和Wnt 家族；调节基因主要有HOX基因、Msx基因、Otx基因、Pax基因 和AP-2基因。
神经干细胞综述 长期以来 ,人们一直认为 ,成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力 ,一旦受损乃至死亡 ,不能再生 ,这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤的治疗受到了很大的限制。虽然传统的药物及手术取得了一定的进展 ,但是仍不能达到满意的效果。近年来 ,生物医学技术迅猛发展 ,神经生物学的重要进展之一是发现神经干细胞的存在 ,特别是成体脑内神经干细胞的分离和鉴定具有划时代意义。本文对神经干细胞的特点、分布、分化机制及应用等研究进展做一综述。 1 神经干细胞的特点 神经干细胞的特点如下:①神经干细胞可以分化。②通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在 , 同时 ,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞。干细胞可连续分裂几代 ,也可在较长时间内处于静止状态。③神经干细胞通过两种方式生长 ,一种是对称分裂 ,形成两个相同的神经干细胞 ;另一种是非对称分裂 , 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配 ,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化 细胞 ,另一个子细胞则保持亲代的特征 ,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 2 神经干细胞与其它类型干细胞的关系 按分化潜能的大小 ,干细胞基本上可分为 3种类型 :第一类是全能干细胞 ,它具有形成完整个体的分化潜能 ,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 ,可以无限增殖并分化成全身 2 0 0多种细胞组织的潜能 ,进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体 ;第二类是多能干细胞 ,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能 ,但却失去了发育成完整个体的能力 ,发育潜能受到一定的限制 ;第三类是单能干细胞 ,如神经 干细胞等 ,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。然而横向分化的发现 ,使这个观点受到了挑战 ,神经干细胞可以分化成造血细胞。总之 ,生命体通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程及组织工程等各种生物技术的快速发展 ,按照一定的目的 ,在体外人工分离、培养干细胞 ,利用干细胞构建各种细胞、组织及器官作为移植来源 ,将成为干细胞应用的主要方向。 3 神经干细胞的分布 神经管形成以前 ,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白 (nestin),是细胞的骨架蛋白。构成小鼠神经板的细胞 ,具有高效形成神经球的能力。但目前尚不能肯定神经板与神经干细胞是否具有相同的诱导机制。神经管形成后 ,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。关于成脑神经干细胞的分布 ,研究显示成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 ,这些研究表明 ,神经干细胞广泛存在于神经系统。在中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经球并产生神经元。脊髓损伤时 ,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制 ,而神经胶质细胞明显增多 ,其机制可能与生成神经元的微环境有关。
长期以来,人们一直认为,成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力,一旦受损乃至死亡,不能再生,这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤的治疗受到了很大的限制。虽然传统的药物及手术取得了一定的进展,但是仍不能达到满意的效果。近年来,生物医学技术迅猛发展,神经生物学的重要进展之一是发现神经干细胞的存在,特别是成体脑内神经干细胞的分离和鉴定具有划时代意义。本文对神经干细胞的特点、分布、分化机制及应用等研究进展做一综述。 1神经干细胞的特点 神经干细胞的特点如下:①神经干细胞可以分化。②通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在,同时,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞。干细胞可连续分裂几代,也可在较长时间内处于静止状态。③神经干细胞通过两种方式生长,一种是对称分裂,形成两个相同的神经干细胞;另一种是非对称分裂,由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞,另一个子细胞则保持亲代的特征,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 2神经干细胞与其它类型干细胞的关系 按分化潜能的大小,干细胞基本上可分为3种类型:第一类是全能干细胞,它具有形成完整个体的分化潜能,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力,可以无限增殖并分化成全身200多种细胞组织的潜能,进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体;第二类是多能干细胞,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制;第三类是单能干细胞,如神经干细胞等,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。然而横向分化的发现,使这个观点受到了挑战,神经干细胞可以分化成造血细胞。总之,生命体通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程及组织工程等各种生物技术的快速发展,按照一定的目的,在体外人工分离、培养干细胞,利用干细胞构建各种细胞、组织及器官作为移植来源,将成为干细胞应用的主要方向。 3神经干细胞的分布 神经管形成以前,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白(nestin),是细胞的骨架蛋白。构成小鼠神经板的细胞,具有高效形成神经球的能力。但目前尚不能肯定神经板与神经干细胞是否具有相同的诱导机制。神经管形成后,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。关于成脑神经干细胞的分布,研究显示成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞,这些研究表明,神经干细胞广泛存在于神经系统。在中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经球并产生神经元。脊髓损伤时,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制,而神经胶质细胞明显增多,其机制可能与生成神经元的微环境有关。 4神经干细胞的分化机制 神经干细胞定向诱导分化调控是目前神经干细胞研究的重大课题,脑内主要组织细胞包括神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等。大脑的功能主要依赖于神经元并通过神经信息的传递方式来实现。脑内神经元种类繁多且功能极为复杂,如胆碱能神经元、儿茶酚胺能神经元、5-羟色胺能神经元及肽能神经元等。不同功能的神经元分布在脑内不同的部位,通过合成及释放相应的神经递质发挥各自独特的功能。虽然神经干细胞应用中还存在较多未解决的问题,但由于其广阔的应用前景,仍成为世界上神经科学界研究的热点之一。 神经干细胞的分化受基因调控。基因表达的时空方式受到其自身固有的分子程序的调控和周围环境的影响。胚胎干细胞向神经干细胞的分化需要基因调控,特别是不同发育分化阶段决定神经干细胞向所需功能神经细胞定向分化的主要调控基因。目前,虽然基因组测序已
神经干细胞的研究进展 摘要：本文主要论述神经干细胞的两个应用方面，诱导神经干细胞分化与神经再生。诱导神经干细胞的分化有两种办法，分别为直接诱导法和间接诱导法。与iPSCs相比较，iNSCs拥有更大的优势。神经再生主要从细胞微环境方面论述，包括周围细胞，细胞因子，细胞外基质及微血管因素。 关键词：神经干细胞；诱导分化；细胞再生；微环境 1.引言 神经干细胞(neural stem cell)是指存在于神经系统中，能够分化形成多种脑细胞，并能够自动更新，提供大脑组织细胞的细胞群[1]。其具体能分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。大量研究表明，许多疾病如帕金森病，亨廷顿舞蹈症，脊髓损伤及认知功能[2]等均与神经干细胞相关，能被其治愈或者是由于神经元病变所引起的。 2006年Yamanaka利用小鼠成纤维细胞成功获得iPSCs[3]，这一研究使干细胞的研究发展进入了全新的局面，随之而来的多项研究成功建立了利用iPSCs治疗相关疾病的细胞模型及动物模型，但仍存在一定的问题需要解决。 治疗这些疾病利用了神经再生，这在成年哺乳动物的两个脑区终生存在, 分别是海马齿状回的颗粒细胞层(subgranular zone,SGZ)和侧脑室的视管膜下区(subventricular zone,SVZ),主要包括神经干细胞的增殖、迁移、分化及新生神经元整合至神经环路四个阶段。这阐明影响神经干细胞增殖分化的因素对于深入认识神经再生的相关机制至关重要。 神经干细胞的增殖分化等行为高度依赖于其生长环境, 即神经干细胞微环境(niche)。神经干细胞niche的组成在两个神经再生的脑区有一些差异, SVZ 区niche 的细胞主要包括室管膜细胞、星形胶质细胞、短暂增殖细胞和神经母细胞。SGZ区niche 细胞主要包括星形胶质细胞、增殖细胞和神经元。神经干细胞niche 对神经干细胞增殖分化的调控主要包括: 与神经干细胞相邻的周围细胞的调控、细胞因子调控、细胞外基质调控及微血管调控。
中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY 第27卷第6期2018年12月 V ol .27.No .6December .2018 〔收稿日期〕2018-10-10 〔修回日期〕2018-12-03 〔基金项目〕 重庆市基础与前沿研究计划项目（CSTC2014j -cyjA10077） 〔作者简介〕牟长河，男（1977年），汉族，主治医师 *通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：Haolei1102@https://www.doczj.com/doc/493046572.html, 神经干细胞在神经系统疾病中的研究应用进展 牟长河1 ，郝磊 2* （1中国人民解放军陆军第958医院神经内科，重庆 400020；2中国科学院大学附属重庆仁济医院神经内科， 重庆400062） 〔摘要〕随着神经干细胞理论的提出，为神经系统疾病的治疗带来了很大的希望。神经干细胞（NSCs ）是指自我更新、且具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多向分化潜能的细胞。当中枢神经系统受到损伤或退行性变时，内源性神经干细胞开始启动神经修复，但受到数量及微环境的影响，作用非常有限。近年，人们采用各种体外培养方法，可以获得一定数量的外源性神经干细胞，在神经干细胞移植治疗各种神经系统疾病，包括缺血性脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤等方面做了很多动物及临床前研究。本文综述神经干细胞移植在神经系统疾病治疗中的应用。 〔关键词〕神经干细胞；缺血性脑卒中；帕金森病；阿尔茨海默病；脊髓损伤 〔中图分类号〕R329.29 〔文献标识码〕A DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2018. 06. 013 The progress in application of neural stem cells in neurological diseases Mu changhe 1, Hao lei 2* (1Department of neurology, No.958 hospital of the Chinese People’s Liberation Army, Chongqing 400020; 2Department of neurology, Renji hospital of Chongqing, the University of Chinese Academy of Sciences, Chongqing, 400062) 〔Abstract 〕The theory of neural stem cells has brought great hope for the treatment of neurological diseases. Neural stem cells (NSCs) refer to multipotential cells that are capable of self-renew and differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. When the central nervous system is damaged or degenerative, endogenous neural stem cells begin to initiate repair. But their effect is very limited due to their quantity and the microenvironment. In recent years, various in vitro culture methods have been used to obtain a certain quantity of exogenous neural stem cells. There are many animal and preclinical studies on neural stem cell transplantation for the treatment of various neurological diseases including ischemic stroke, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and spinal cord injury. Here the application of neural stem cell transplantation in the treatment of neurological diseases was reviewed. 〔Keywords 〕Neural stem cells; ischemic stroke; Parkinson’s disease; Alzheimer ’s disease; spinal cord injury 干细胞（Stem Cells ，SCs ）是指具有无限自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞。当中枢神经系统受到损伤或退行性变时，受到数量及微环境的影响，内源性干细胞的修复作用非常有限，几乎不能进行有效的神经元和胶质细胞的修复，此时干细胞移植治疗具有非常广阔的前景，为脑梗死、帕金森、阿尔茨海默病、脊髓损伤等神经系统疾病的细胞移植治疗带来了新的希望。 1 神经干细胞特性及来源 神经干细胞（NSCs ）是指自我更新、且具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多向分化潜能的细胞。其在神经系统中主要作为一种储备细胞，即当神经系统受到损伤时，如急性缺血性脑梗死、神经退行性疾病等，这些干细胞便开始增殖、迁移及分化为相应的组织细胞，以便实现结构和功能的代偿。NSCs 不表达成熟细胞抗原，具有低免疫原性，因此在移植后相对较少发生异体排斥反应，有利于其存活。NSCs 来源于神经组织，从哺乳动物胚胎期的大部分脑区、成年期的脑室下区、海马齿状回的颗粒下层、纹状体、嗅球、皮质、脊髓等部位均可成功分离出NSCs ，并可以采用添加bFGF 和EGF 因子的无血清培养基进行体外培养扩增[1-8]。受到供体组织来源及伦理学限制，直接从神经组织分离培养NSCs 是不切实际的。近期研究发现，NSCs 尚可