实验二分光光度技术测蛋白、多糖含量
姓名：侯红芬学号：161202085 专业：细胞生物学
一、实验目的
1、掌握分光光度技术的工作原理；
2、熟悉分光光度计的操作。
3、掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和方法以及硫酸-苯酚法测定多糖含量的原理。
二、实验原理
分光光度技术是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术，分光光度计波长范围包括400-760nm的可见光区和波长范围为200-400nm的紫外光区。而蛋白质含量有多种测定方法，考马斯亮蓝染色法就是其中一种。考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后成青蓝色，考马斯亮蓝G250与蛋白质结合，在0-1000μg/ml范围内，在波长595nm下的吸光度与蛋白质含量呈正比，与标准曲线对比计算后，就可得出蛋白质的含量。
多糖在硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合生成一种橙红色化合物。在10-100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。在490nm波长下有最大吸收峰，故用比色法在此波长下测定。
三、实验仪器和试剂
分光光度计，移液枪，试管及试管架，考马斯亮蓝，标准蛋白样品，未知样品，蒸馏水，硫酸，多糖样品。
四、实验步骤
1、蛋白质含量的测定
（1）标准蛋白溶液：称取100mg标准蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成1mg/ml的溶液。
（2）考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝G250100mg溶于50ml 95％乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
（3）标准曲线的制作。取7支试管并做好记号，第一支试管加入5ml考马斯亮蓝染液和1ml的水，1号试管加入100μl的标准蛋白液和900μl的水，（10%浓度）然后2、3、4、5、6、7号试管依次加入20%、40%、60%、80%、100%浓度的蛋白液。
（4）样品蛋白溶液吸光度值的测定以及含量的计算。
2、多糖含量的测定
（1）配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。使用时配制6%苯酚：取75μl的80%苯酚于烧杯中，加入960μl水。
（2）制作标准曲线:准确称量50mg标准样品于500ml容量瓶中配成0.1mg/ml的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、
0.06、0.08、0.1 mg/ml。1 ml标准液分别加入 6% 苯酚溶液1 ml，
并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。摇匀，30℃放置30 min 后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。
（3）样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测
定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。
五、注意事项
（1）标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。
（2）所作标准曲线仅供短期使用。
（3）比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。
（4）本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。
六、实验结果
表一不同浓度下标准蛋白的吸光度值
表二不同浓度下未知蛋白的吸光度值
根据以上两个表格中的数据得出，未知蛋白的含量为74.1%。
七、讨论
所做标准曲线不是太好，但在标准曲线附近有几个点还算勉强可以，未知蛋白所做的曲线不错。
1.目的 掌握凯氏定氮法测蛋白质的原理、操作、条件、注意事项。 2.原理 蛋白质是含氮有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后在以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算含氮量再乘以换算系数，即为蛋白质含量。 3.试剂 3.1浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制 3.2混合指示液 1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚氯乙醇溶液临用时混合。 也可用2份甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 3.3氢氧化钠溶液（400g/L） 3.4标准滴定溶液 硫酸标准溶液［c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L］或盐酸标准溶液［c（HCl） 0.0500mol/L］ 3.5硼酸溶液（20g/L） 4.仪器 定氮蒸馏装置 5.样品 全蛋（2.47g） 6.操作 6.1样品处理 准确称取2—5g半固体样品，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜放于加有石棉网的电炉上，小火加热，待内容物全部炭化后，泡沫完全消失后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色呈请透明后，再继续加热0.5h，取下放冷，慢慢加入20mL水。 放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。 6.2连接装置 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及少量硫酸，以保持水呈酸性，加入数滴玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，
27 第13卷 第8期 2011 年 8 月 辽宁中医药大学学报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 13 No. 8 Aug .，2011 复方雄蚕蛾胶囊中总多糖和蛋白质含量测定 耿耘，马超英，李子阳，杨超，罗丽勤 （西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031） 收稿日期：2011-05-18 基金项目：四川省科技厅支撑计划资助项目（2008SZ0141）；四川省中医药管理局科技专项资助项目（2008-31）作者简介：耿耘（1959-）,女，河北石家庄人，教授，硕士，研究方向：中药药理学。 复方雄蚕蛾胶囊是由雄蚕蛾、枸杞子等3味药食两用中药组成的保健食品，临床应用证明其具有补肾壮阳、改善免疫及抗疲劳等功效，主要用于中老年人阳气亏虚、阴精不足或抗病能力下降、易疲劳等症者。为了有效地控制其质量，我们根据该保健食品中药物组成中的有效成分，采用检测该胶囊中多糖和蛋白质的含量来保证质量。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。现报道如下。 1 材 料 UV-265型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；微量定氮蒸馏仪一套（深圳三利仪器）；复方雄蚕蛾胶囊（由西南交通大学中药研究所提供，规格0.5g/粒，批号080915）；D-无水葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所，批号110833200503）。 2 方法与结果2.1 多糖含量测定 2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25mg，置250mL 量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻 度，摇匀，配制成每毫升中含无水葡萄糖0.1mg 的对照品溶液。 2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置具塞试管中，加水至2.0mL，各精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，摇匀，放置10min，置40℃水浴中保温15min，取出后迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白。照紫外分光光度法，在490nm 波长处测定吸收度，以吸收度A 为纵坐标，对照品溶液质量浓度C(g ·L -1)为横坐标，得回归方程:Y=0.0141X+0.1642，r =0.9984，结果表明，无水葡萄糖在0.02~0.1g ·L -1范围内，其质量浓度与吸收度线性关系良好。2.1.3 供试品溶液的制备 取6颗胶囊，将其内容物置于三角瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀超声待糖全溶后，将杂质过滤，滤液置旋转蒸发仪中蒸发，蒸发完全后用无水乙醇溶解超声溶解充分，滤掉杂质，然后将滤液置旋转蒸发仪中蒸发，再用蒸馏水溶解，溶液移至250mL 摘 要：目的：建立复方雄蚕蛾胶囊质量控制的定性定量方法。方法：总多糖含量测定采用苯酚-硫酸显色 法[1]，在490nm 波长处测定吸收度，在0.02~0.1g·L -1范围内，其质量浓度与吸光度线性关系良好（r =0.9984）；蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[2]。结果：复方雄蚕蛾胶囊中总多糖的平均含量为5.9%，蛋白质平均含量为51.3%。结论：该方法操作简便、快速、灵敏度高和重复性好，可以作为复方雄蚕蛾胶囊的质量控制的定性定量方法。 关键词：复方雄蚕蛾胶囊；总多糖；蛋白质；含量测定 中图分类号：R-322 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 08- 0027- 02Determination of Total Polysaccharides Content and Protein Content in Bombycidae Hung Capsule GENG Yun，MA Chao-ying，LI Zi-yang，YANG Chao，LUO Li-qin （College of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China） Abstract： Objective ：To study the quality standard of bombycidae hung capsule. Method ：The contents of Total Polysaccharides were determined by phenol-sulfuric method [1] ,the detection wavelength was 490nm,from 0.02~0.1g ·L -1，The Linear Relationship was good between Concentrations and Absorbency of Total Polysaccharides（r =0.9984）；The content of Protein were determined by Micro - Kjeldahl method [2]. Result :The average contents of Total Polysaccharides was determined 5.9%，the average content of Proteinin was determined 51.3%，from Bombycidae hung Capsule. Conclusion ：The above method for the quantification was proved to have the advantages of simple operation, rapidity, high sensitivity and fine repetition, and it should be helpful for monitoring the quality control methods of Bombycidae hung Capsule. Key words：bombycidae hung capsule；total polysaccharides；protein；determination
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
蛋白质测定实验报告标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较 1．蛋白质的常规检测方法 1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 1.2 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是3 分子的脲经180℃左右加热,放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合）,称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速,干扰物质少,不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ②三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 1.3 Folin-酚试剂法 原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同,利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。 同时也由于Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,由此可测定蛋白质的含量。 测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高,对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时,要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐,且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、 糖类、甘油、还原剂(二硫代苏糖醇、巯基乙醇)、EDTA和脲素均会干扰反应。
实验四蛋白质功能性质的测定 （一）实验目的： 以蛋清蛋白、卵黄蛋白、大豆分离蛋白和明胶为原料，了解蛋白质的功能性质及其影响因素。 （二）实验原理： 蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质，即食品加工、贮藏、销售过程中发生作用的那些物理化学性质，这些性质对食品的质量及风味起着重要的作用。蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系，是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。 蛋白质的功能性质可分为水化性质、表面性质、蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型。主要包括吸水性、溶解性、保水性、分散性、粘度和粘着性、乳化性、起泡性、凝胶作用等。蛋白质的功能性质及其变化规律非常复杂，受多种因素的相互影响，比如，蛋白质种类、蛋白浓度、温度、溶剂、pH、离子强度等。 （二）实验材料和试剂： 蛋清蛋白； 2%蛋清蛋白溶液：取2g蛋清加98g蒸馏水稀释，过滤取清液； 5%蛋清蛋白溶液：取5g蛋清加98g蒸馏水稀释，过滤取清液； 卵黄蛋白：鸡蛋除蛋清后剩下的蛋黄捣碎。 大豆分离蛋白粉； 1M盐酸；1M氢氧化钠；饱和氯化钠溶液；饱和硫酸铵溶液；酒石酸；硫酸铵；氯化钠；氯化钙饱和溶液；水溶性曙红Y；明胶。 （三）仪器设备： 100ml/50ml烧杯、普通玻璃试管、刻度试管、50ml塑料离心管、pH试纸、恒温水浴锅、天平等。 （四）实验步骤： 1. 蛋白质的水溶性 ⑴在50mL的小烧杯中加入0.5mL蛋清蛋白并加入5mL水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。 取上述蛋白质的氯化钠溶液3mL，加入3mL饱和的硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。 ⑵在四个试管中各加入0.15g大豆分离蛋白粉，分别加入5mL水，5mL饱和食盐水，5mL 1mol?mL-1的氢氧化钠溶液，5mL 1mol?mL-1的盐酸溶液，摇匀，在温水浴中温热片刻，观察大豆蛋白在不同溶液中的溶解度。 在第1、2支试管中加入饱和硫酸铵溶液3mL，析出大豆球蛋白沉淀。第3、4支试管中分别用1mol?mL-1盐酸及1mol?mL-1氢氧化钠中和至pH4~4.5 （用pH试纸测定），观察沉淀的生成，解释大豆蛋白的溶解性及pH对大豆蛋白溶解性的影响。 2. 蛋白质的乳化性 取2.5g卵黄蛋白加入250ml三角锥形瓶中，加入47.5mL水，0.25g氯化钠，混合均匀后，一边摇匀一边加入植物油10mL，加完后，手握锥形瓶，较强烈的振荡5min使其分散成均匀的乳状液，静置10min，待泡沫大部分消除后，观察乳化效果，油相和水相是否出现分层？从乳化层中取出10mL于玻璃试管中，加入少量水溶性曙红Y溶液数滴，将染色均匀，取一
蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤： ①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸
一、硫酸苯酚法测多糖含量 1、试剂配制 ①浓硫酸：分析纯，95.5% ②80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） ③5%苯酚：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取 该馏分(100%苯酚)5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中， 冰箱中冷藏储存备用。 ④标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。准确称取20m g经105℃干 燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。 2、制作标准曲线 准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入6%（5%，9%）苯 酚0.5ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同 样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 0 标准葡萄糖溶液（mL）0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 6%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3 注意事项 （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 .掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； .掌握双缩脲试剂的配制； .熟悉血清总蛋白的临床意义； .了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 .两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 .蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： .实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
.实验步骤 四、结果与讨论： .实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml 的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S U 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=L。 .结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 ②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的结果，是因为前面操作严谨。 管号
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：
1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量
饲料中粗蛋白的测定 一、实验目的 通过饲料样品中粗蛋白的测定，掌握饲料粗蛋白质含量的测定方法。 二、适用范围 本方法适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。 三、实验原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。 四、试剂 （1）硫酸：化学纯，含量为98%，无氮。 （2）混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水；6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。 （3）氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（m/V）。 （4）硼酸：化学纯，2%水溶液（m/V）。 （5）混合指标剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月。 （6）盐酸标准溶液：基准无水碳酸钠法标定； ①0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。 ②0.02mol/L盐酸标准溶液： 1.67mL盐酸注入1000ml蒸馏水中。 （7）蔗糖：分析纯。 （8）硫酸铵：分析纯，干燥。 （9）硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。 五、仪器设备
（1）实验室用样品粉碎机或研钵。 （2）分样筛：孔径0.45mm（40目）。 （3）分析天平：感量0.0001g。 （4）消煮炉或电炉。 （5）滴定管：酸式，10、25mL。 （6）凯氏烧瓶：250mL。 （7）凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸汽蒸馏式。 （8）锥形瓶：150、250mL。 （9）容量瓶：100mL。 （10）消煮管：250mL。 （11）定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。六、分析步骤 试样的选取和制备: 选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。 （1）仲裁法 ①试样的消煮 称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。 ②氨的蒸馏 A. 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入60～100ml蒸馏水，摇匀，冷却。 将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1～2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流
蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋
白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外
《分子生物学实验》 实验报告 实验名称：生物样本中蛋白质的提取及测定 姓名：杰 学号：3140104666 组别： 同组同学：唐曦
带教教师：伟俞萍 实验日期：2015年9月15日 目录 1.原理： (3) 1.1生物样本中蛋白质的提取 (3) 1.2生物样本中蛋白质的测定 (3) 1.2.1 Lowry法 (3) 1.2.2 考马斯亮蓝法 (4) 1.2.3 紫外吸收法 (4) 2.操作步骤 (4) 2.1生物样本中蛋白质的提取 (4) 2.2生物样本中蛋白质的测定 (5) 2.2.1 Lowry法 (5) 2.2.2 考马斯亮蓝法 (5) 2.2.3紫外吸收法 (5) 3、实验结果 (6) 3.1 原始数据 (6) 3.1.1 Lowry法 (6) 3.1.2 考马斯亮蓝法 (7) 3.1.3 紫外吸收法 (7)
3.2 数据处理 (8) 3.2.1 Lowry法 (8) 3.2.2 考马斯亮蓝法 (9) 3.2.3 紫外吸收法 (10) 4.讨论： (11) 1.原理： 1.1生物样本中蛋白质的提取 离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代谢。因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代谢的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。因此，利用离体组织作代谢研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。 1.2生物样本中蛋白质的测定 1.2.1 Lowry法 1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色
第九章多糖的测定 第一节淀粉的测定 ●一、测定淀粉含量对于决定用途具有重要意义： ●1、淀粉是供给人体热量的主要来源。 ●2、淀粉在食品中的作用是作为增稠剂、胶体生成剂、保潮剂、乳化剂、粘合剂等。 ●二、淀粉的测定方法： ●（一）淀粉的物理检验法：淀粉因其品种不同，淀粉的大小和形状也不同。用显微 镜分析法可鉴别不同品种的淀粉。 ●（二）淀粉含量的测定方法： ●1、酶水解法： ●（1）概念：淀粉用麦芽淀粉酶水解成二糖，再用酸将二糖水解为单糖，然后测定由 水解所得到的单糖。（还原糖） ●（2）常用于液化的淀粉酶是麦芽淀粉酶。它是?—淀粉酶和?—淀粉酶的混合物。 ●（3）酸直接水解法：淀粉的测定方法也可采用酸直接水解法，但酸水解法不仅是淀 粉水解，而且也能分解半纤维素，结果产生了具有还原力的木糖、阿拉伯糖等单糖，使淀粉测定所得的结果较实际含量偏高。 ●（4）酶水解法的优点：在一定条件下，用?—淀粉酶处理样品，则能使淀粉与半纤 维素等某些多糖分开来。因为?—淀粉酶具有严格的选择性，它只使淀粉液化变成低分子糊精和可溶性糖分，而对半纤维素不起作用。在用?—淀粉酶液化淀粉除去半纤维素等不溶性残留物后，再用酸水解使生成葡萄糖，所得结果比较准确。这种酶水解作用，叫作选择性水解。 ●（5）酶水解法测定淀粉的具体步骤： ●a:样品的处理：将磨碎样品置漏斗中，用乙醚50ml分数次洗涤，除去脂肪，再用10% 乙醇洗去可溶性糖分，先5次。 ●b:酶水解：将滤纸上残留物用水移至烧杯内，水浴加热直到淀粉糊化。冷却至60℃， 加麦芽汁20ml在60℃保温1小时，再重复加热冷却，保温冷却过滤，将滤液定容250ml。 ●c:酸水解，吸取滤液加入1：4硫酸，放在120—130℃油浴中保持沸腾5—6min用 40%NaOH 滴定至碱性。 ●d:用非林氏试剂测定葡萄糖含量，同时做空白试验。 ●e:计算：淀粉=[（A-B）*0.9*100]/[W*(50/250)*(V/100)*100] A:样品中淀粉相当于还原糖重量（mg) B:空白相当于还原糖的重量0.9：还原糖换算为淀粉因数 V/100：样液酸解后稀释100ml取Vml W：样品重量（g） 第二节纤维的测定 ●植物性食品内含有粗纤维，它集中存在于谷类的麸、糠、果蔬的表皮及其纤维样组 织之中。从现代营养学的观点来看，我们膳食中每天需要摄入一定数量的纤维（称为膳食纤维），它可防止包括阑尾炎、心脏病和结肠癌等多种疾病，所以，深入了解膳食纤维的特性及其分析方法更具有迫切的现实意义。此外，粗纤维的含量是果蔬制品的一项质量指标，借此可以鉴定果蔬的鲜嫩度。例如：青豌豆按其鲜嫩程度分为三级，其粗纤维含量分别为：一级1.8%左右，二级2.2%左右，三级2.5%左右。 ●一、概念： ●粗纤维：指动物饲料中那些对稀酸、稀碱难溶的，家畜（特别是反刍动物）不容易
粗蛋白测定方法一凯式定氮法 粗蛋白crude protein ；crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量 的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物(氮化物)。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出)，再用凯氏法测 出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量 都有一定比例关系，其中含碳50?55%、氢6?8%、氧20?23%、氮15?17% 和硫?％。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15?17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。 由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C )，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢 复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂
实验一蛋白质含量的测定 姓名：mangogola 一．实验原理 生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。 紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。 Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高，但较费时。 对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。 二．实验过程（Lowry法） 1.溶液配制 A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确） B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。 C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。 D液：Folin试剂 标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液 2.标准曲线测定 按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋
实验二凯氏定氮法测蛋奶定牛白质的含中量 精品文档 实验二凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的含量 一、实验目的与要求 1. 掌握半微量凯氏定氮法的原理。 2. 熟悉利用半微量凯氏定氮法测定干酵母片中蛋白质含量的操作方法。 二、实验原理 蛋白质是含一定量氮的有机化合物，蛋白质样品在凯氏烧瓶中经过浓HSO消化后，有机物炭化生成碳，碳将硫酸还原为SO，本身则变成CO，2422SO使N还原为NH，本身则氧化为SO而消化过程中生成H，又加速了NH332232O和SO溢出，而NH则与HSO结合成H的形成。在反应过程中，生成的432223）SO存在溶液中，加入NaOH并蒸馏，使NH溢出，用HPO吸收NH（334423后，以标准酸溶
液滴定，根据标准酸溶液消耗的量计算样品中的含氮量，从而可以折算出蛋白质含量。 三、实验材料、试剂与仪器 1. 材料与试剂 SO、KSO、CuSO·5HO、NaOH、HCl、HPO、甲基红、乙醇、H浓44244232溴甲酚绿、牛奶、定量滤纸等。 40 %NaOH 溶液：40 g NaOH 溶于100 mL水中； 0.05 mol/LHCl标准液：4.2 mL HCl 溶于1000 mL 水中，碳酸钠法标定盐酸； 2 % HBO溶液：HBO 2 mL 溶于100 mL 水中；3333SO 150 g ，CuSO·5HO 10 g 仔细混匀研磨。K加速剂：2442甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：甲基红溶于乙醇配成0.1 % 乙醇溶液，溴甲酚绿溶于乙醇配成0.5 % 乙醇溶液，两种溶液等体积混合，阴凉处保存（保存期三个月以内）。 2. 仪器 消化管、小漏斗、研钵、玻璃珠、酸式滴定管、锥形瓶、天平、凯氏定氮仪等。 四、实验方法与步骤 1. 样品消化 1）牛奶5 mL置于消化管内，加入加速剂5 g，并沿烧瓶壁缓缓加入20 mL浓硫酸，加入玻璃珠2~3粒，摇动烧瓶使全部样品浸没于硫酸。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除． 精品文档 2）消化管放在消化炉支架上，套上毒气罩，压下毒气罩锁住二面拉钩。 3）把支架连同装有试样的消化管一起移至电热炉上保持消化管在电炉中心，设定温度在420 ℃保持消化管中液体连续沸腾，沸酸在瓶颈部下冷凝回流。待溶液消煮至无微小碳粒、呈蓝绿色时继续消煮5 min左右。 4）消化结束，将支架连同消化管一同移回消化管托底上，冷却至室温。注意，在冷却过程中，毒气罩必须保持吸气状态（切忌放入冷水中冷却）放置，防止废气溢出。 2. 样品蒸馏 1）打开自来水给水龙头，使自来水经过给水口进入冷凝管。注意水流量以保证冷凝管起到冷却作用为止。 2）开总电源开关，待红色指示灯亮起，按一下汽按钮待蒸汽导出管放出蒸汽，按消除按钮停止加热。 3）在蒸馏导出管托架上，放上已经加入适量（15 mL左右）的接受液（硼酸和混合指示剂）的锥形瓶。抬起锥形瓶支架使蒸馏导出管的末端浸入接受液内。4）在消化完全冷却后的消化管内，逐个加入10 mL左右蒸馏水稀释样品。 5）向下压左侧手柄，将消化管套在防溅管密封圈上，稍加旋转使其保持接口密封，拉下防护罩。 6）按一下蒸汽按钮，开始蒸馏，到时或到量时自动停止。用洗瓶将蒸馏水冲洗接收，取下锥形瓶。 7）加碱：按一下碱按钮，NaOH溶液量必须至蒸馏液碱性颜色变黑为止。 3. 滴定与计算 吸收氨后的吸收液，用标定后的盐酸溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰紫