No.1
Western Blot 原理和操作方法（全）
Western Blot
工作原理
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-1 2mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中加入含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.
样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.
另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.
重要参数
①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:
T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%
其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml)
②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:
蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)
<104 20-30
1×104-4×104 15-20
4×104-1×105 10-15
1×105-5×105 5-10
>5×105 2-5
③分离胶:
电泳凝胶浓度
试剂 10% 12% 15% 10% 12% 15%
H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4
30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5
1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)
2.5 2.5 2.5
3.8 3.8 3.8
10%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6
总体积(ml) 10 15
④浓缩胶
试剂浓度(5%)
H2O(ml) 4 2
30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.5
1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.5
10%SDS(μl) 80 40
10%AP(μl) 60 30
TEMED(μl) 8 4
总体积(ml) 6 3
蛋白质的样品制备：
蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：
1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。一：准备工作：
一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液
清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-2 0℃存放的样品可稳定保持数月）
2)组织样品的制备：
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）
附：
一：裂解液的制备：
组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4
2: Nacl 150 mmoL/L
3: 去氧胆酸钠 0.25%
4：NP-40或Triton-x-100 1%
5: EDTA 1 mmoL/L
6： PMSF 1 mmoL/L
7： Aprotinin 1μg/ml
8: leupeptin 1μg/ml
9: pepstain 1μg/ml
其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。
细胞裂解液：1：NP-40裂解体系：150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
50 mmoL/L Tris(PH8.0)
2：RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
0.5%脱氧胆酸钠
0.1%SDS
50 mmoL/L Tris( ph8.0)
二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液）
50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）
100 mmoL/L DTT
2% SDS
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中D
TT应临时加入，以防降解。
蛋白质定量
1)Bradford法:
检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.
①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定.
②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线.
③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS)
④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.
⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟.
⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度.
2)Lowry法:
检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测.
①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上.
②Folin-ciocalteu酚试剂
③按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A
④按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B
⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白.
⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟.
⑦加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟.
⑧在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度.
3)紫外分光光度法:
检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在.
①纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值.
②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml
蛋白质 A280(1mg/ml)
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA 0.7
③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定:
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)
蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)
1)SDS-PAGE设备和材料
①电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。
②电泳仪（电源）为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。
③振荡器
2）试剂
①丙烯酰胺（电泳级）
②N,N′-甲叉双丙烯酰胺（bis）
③SDS
④TEMED
⑤Tris
⑥过硫酸铵
⑦α-巯基乙醇或DTT
⑧甘油
⑨甘氨酸
⑩溴酚蓝
(11)盐酸
3）聚胶前准备：
①配制凝胶储液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 过滤后4℃避光保存。
②配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 过滤后4℃避光保存。
③配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 过滤后4℃避光保存。
④配制10%SDS
⑤配制10%过硫酸铵（AP）
⑥TEMED原溶液
⑦电泳缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。
4)制胶: 制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则：即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。
①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。
②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90mi n以上以保证完全聚合。
5)预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。
6)加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效
应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7)电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
8)染色和脱色
电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹
①考马斯亮蓝染色:
将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带
为止,一般5-6小时或者4℃过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止.
②染色液配制:
90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质.
③脱色液的配制:
90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液.
附：
一、蛋白标准品的选择
凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有：
① Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix
② Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker
Mix
以上两种Marker均为PIERCE公司的产品，货号为：①prod# 26681; ②prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。
③ Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein
Molecular Weight Marker Mix
以上也为PIERCE产品，货号为：prod# 26651，该标准蛋白同上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。
④ Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix
以上为Sigma公司产品，货号为B2787,作用效果同③
二、对照的设置
一般需要设立:
内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白
阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量
阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞.在实验中
根据你的需要选择
免疫印迹
蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白),将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将NC膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带),再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。
一、设备和材料
转移电泳槽和转移电泳仪(电源)
震荡器
冰箱
滤纸
NC膜
胶片
暗室
二、试剂
封闭液:5%的脱脂牛奶粉TBS-T
第一抗体(Ab1)
第二抗体(标记的Ab2)
底物以及显色指示剂
漂洗液(TBS-T)
转印缓冲液
抗体稀释液
丽春红S
显影液
定影液
三、试剂的配制
封闭液: 5g的脱脂牛奶+100ml的TBS-T
漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T为Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl调节PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml
转印缓冲液: 同5×SDS电泳缓冲液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以
Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需调节PH值 ,用时稀释5倍到1×转印缓冲液.
显影液：H2O--750ml
米土尔--3g
无水亚硫酸钠---100g
对苯二酚---3g
溴化钾---3g
无水碳酸钠：先加5gPH10.0不够时再加5g
注：以上配定加H2o定容至1000ml
定影液：起始水温：60℃ H2o 700ml
硫代硫酸钠：240g
无水亚硫酸钠：25g
冰醋酸：48ml
注：加H2o至1000ml
四、电印迹
蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质Ag活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF 膜。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。
一．半干式电转印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。
2. 将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min.
3. 按照以下顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。
4. 每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。
二．湿式电转印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶方法同半干式电转印。
2. 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。
3. 电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。
五、印迹膜上总蛋白的染色
在确定印迹中是否存在总蛋白之前,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况,并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功,同时,该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性.
丽春红S印迹膜染色法：
丽春红S适用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后续的处理中红色染料易被洗去,由于与蛋白质的结合是可逆性的,该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术, 丽春红S带负电荷,可以与带正电贺的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色条带.
1)丽春红溶液的配制:
储存液(10×)： 0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,临用前稀释10倍为应用液.
2)操作步骤
①转印结束后取出印迹膜至于丽春红S应用液中,并在室温下搅动5-10分钟
②将膜放入PBS洗数次,每次1-2分钟,并且更换PBS
③根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记
至此膜可以用于封闭和加入抗体
六、膜的封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5%N-fat milk.
封闭过程：
1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。
3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
七、抗体杂交
抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（A b2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。
杂交过程：
１）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1ug/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h.
２）液洗膜3次x10min
３）标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1h，洗膜3x10min
八、检测
根据标记Ab2的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有HRP标记 Ab2的的增强化学发光(ECL)和DAB检测系统.
1) 辣根过氧化物酶-DAB法:
①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.
②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带
③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.
2) 辣根过氧化物酶-ECL法:
增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来:
ECM显色剂配制:按mlH2O加显色剂A、B各1滴,混匀.
在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液,月1-5分钟
用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触.
将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟,冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长到数小时.
冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直参考马斯亮蓝染色选择最
佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析.
2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.
4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)
5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象
6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解
8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.
9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔
10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.
11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极.
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移 到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附 蛋白质，且能保持电泳分离的多肽 类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶 或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的 蛋白成分。该技术也广泛应用于检 测蛋白水平的表达。 ? 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺 SDS? Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺 H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 ? 1. ?SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 ? 2. ?匀浆缓冲液： M Tris-HCl(pH ml；10%SDS ml；β-巯基乙醇 ml；ddH 2 O ml。
3. ?转膜缓冲液：甘氨酸 g；Tris g；SDS g；甲醇200 ml；加ddH 2 O定容至1000 ml。? 4. ? M PBS：NaCl g；KCl g；Na 2HPO 4 g； KH 2PO 4 g；加ddH 2 O至1000 ml。 ? 5. ?膜染色液：考马斯亮兰 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH 2 O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 g 溶于20 ml的 M PBS 中。 ? 6. ?显色液：DAB mg； M PBS ml；硫酸镍 胺 ml；H 20 2 μl。 二、蛋白样品制备 ? 1. ? 单层贴壁细胞总蛋白的提取 ? （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 ? （2）?每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（～）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。? （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） ? （4）?每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 ? （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） ? （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1. 裂解 1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml 裂解液，加20μlPMSF 混匀 2) 称取30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入600μl 上述1中液体（加入液 体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2. 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s ，两次（间隔5s ），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室） 1) 自带1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超 纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5. 保存 变性结束 AP 管盖放一然后4℃1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2. 配制分离胶 1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl （白色枪头） 2) 10%分离胶的配置：（用50ml 烧杯。板配块胶，板配2块板） 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3. 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4. 水封
W e s t e r n b l o t基本操作 步骤 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含 1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为 0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Westernblot基本操作步骤 1、溶液配制： ①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%， v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1MTris·HCl（pH7.6）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5mlTween-20（0.05%， v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5%BSA（5g/100ml，称取1gBSA至20mlTBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDSloadingbuffer,10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满RunnigBuffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定
Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。
Western blot 的详细操作步骤 一．蛋白样品的提取 1.先从-80°冰箱内取出sham 1d/3d组，SAH+PBS 1d/3d组，SAH+SP 1d/3d组， SAH+Tregs 1d/3d组脑组织样品(区分脑皮层，海马区)，并对这四种样品进行编号样品1,2,3,4,等脑组织在室温下复温后，用预冷的PBS将脑组织表面的血性物质冲洗掉，并用吸水纸吸掉组织表面多余的水分，然后分别把样品1,2,3,4放到预冷的培养皿1,2,3,4中，分别用眼科剪刀1,2,3,4将脑组织分别剪成一个大块以及几个小块。然后分别将样品1,2,3,4称重，每个脑组织样品秤取500mg(可变化)并分别装入2ml的预冷的EP管中，同时把匀浆器（编上编号）置于冰盒内预冷。 2.按照每250mg脑组织加入1ml的RIPA的比例加入对应量的RIPA于盛有脑组织的 EP管1,2,3,4中，同时按照裂解液：cocktail=1:500的体积比加入cocktail(我们有现成的试剂)（一种蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶降解蛋白），然后用眼科剪刀（注意：不同的样品用不同的剪刀，提前把剪刀编上号1,2,3,4）将脑组织剪碎，尽量剪的碎一点以利于下一步的匀浆。 注意：这一步的处理过程要在冰盒中进行以抑制蛋白质的降解。 3将已经剪碎的EP管1,2,3,4中的脑组织倒入对应序号的匀浆器1,2,3,4中，在冰上匀浆脑组织，直至匀浆液变得无颗粒（大致用30min，最少是1次/分钟，尽量多匀浆几次）。 4.匀浆结束后，用1ml的移液枪将匀浆好的脑组织匀浆液从匀浆器中转移到对应序号的 预冷的EP管1,2,3,4（提前将要用的EP管编上号1,2,3,4并置于冰上预冷）中.每个样品转移2ml样品匀浆液。 5. 先将盛有脑组织匀浆液的EP管配平(移液枪吸取等量)后，将其放入离心机内，4℃ 离心，18000 rpm 20min。 6. 用移液枪从分层后的液体中抽取上清液(大约吸取0.5-1ml)，并转移到在冰盒中预冷的另外4个EP管1,2,3,4中，保存上清于-80度冰箱内直至使用。 二，Western blot之蛋白定量（蛋白浓度测定） 采用96孔板法 （1.）试剂如下表配置 注意：样品BSA栏中加入稀释后的样品25ul，根据样品稀释倍数来决定PBS与原液的比例，最后保证加入的样品总体积达到25ul。
Western Blotting试验步骤 一，组织蛋白提取 1.准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充 分混合。 注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。 2.组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织 建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。 注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。 3.将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP 管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二，提取液中总蛋白的测定 用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。 1.配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂 （50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔， 2.稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品 一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按
0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。 3.稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的 样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。 4.在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测 定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 样品蛋白布板： 空白对照布板：
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上
的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1.裂解 1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀 2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3.离心（在基础4楼416室） 1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4.变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： S5 00：10 S5 100．0 00：10 温度时间（时： 5.保存 变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用 WB实验步骤
1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 2.配制分离胶 1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris?HCL 10%SDS 150μl AP（催化剂促凝作用） 150μl TEMED 9μl 3.灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封
Westernblot实验步骤及注意事项 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。 3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。