实验方案范例
一、基因操作
1、基因A（GeneA）的敲减载体构建
版本1：针对GeneA，在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的shRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。以EcorI和BamHI 内切酶酶切pGP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将shRNA表达框架插入pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的shRNA骨架质粒。
版本2：从Genebank调取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的shRNA序列，经Blast 比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3 组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取pGP shRNA载体15μL 于EP 管，用BamHI 1.5μL 与EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反应4 h 以上；产物回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR 鉴定、DNA 测序。
2、GeneA过表达载体构建
从Pubmed Nucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物直接在GeneA CDS编码区起始和末端设计，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。以cDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理pCDH载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接
并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。
3、GeneA点突变载体构建
版本1：根据突变位点特异性设计突变寡核苷酸引物并合成含突变位点且互补的两条引物。在PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下，合成整个含有突变位点的质粒。在反应液中加入Dpn I 显著性内切酶，37℃1 h。Dpn I 只能切断腺嘌呤甲基化的DNA，能将含有甲基化的原始模板消化，留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化入感受态大肠杆菌。PCR 所得的突变质粒的缺口能在大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。
版本2：使用Hieff Mut?Site-Directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒构建GeneA点突变载体。针对需引入突变的区域设计含突变位点的引物，将质粒进行反向PCR扩增，扩增产物与DpnI混合，置于37℃恒温反应1～2小时进行消化，去除甲基化模板质粒。配制含有Exnase的单点突变重组反应体系。置于37℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。取20 μl 冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中进行转化，随后取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，长出来的阳性克隆PCR，测序鉴定。
4、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cas9法）
从NCBI数据库中查询GeneA的CDS序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择23-250bp的外显子序列输入软件中，进行特异sgRNA设计，根据输出的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。将合成的Oligos以逐步降温的方法退货成双链，然后与Cas9质粒进行连接，转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽后获得含shRNA表达元件的Cas9质粒。错配酶法检测剪切活性：靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断
Cas/sgRNA的活性。
二、病毒包装
1、慢病毒包装
使用Clontech公司的Lenti-X TM HTX packaging System第四代慢病毒包装系统。转染前约24 hr，以4-5×106 Lenti-X 293T细胞/100 mm板的密度接种10 ml细胞，培养过夜。按照说明书，将致力DNA转染体系和polymer体系分别混匀，再将两者混合后室温孵育10min后滴加至293T细胞中，十字形摇晃混匀。4小时候换液，继续培养48小时，收获病毒上清，500g离心10min去除细胞碎片，冻存于-80℃待用。Lenti-X GoStix?检测病毒滴度或者按照梯度稀释法，转染293T细胞，根据感染效率判断滴度。
2、腺病毒/腺相关病毒包装
取5μg重组质粒用PacI酶切然后胶回收大片段，用TurboFect TMin vitrotransfection Rengent 以2μg每孔（6孔板）转染融合度为80-90%的293T细胞包装病毒。转染后24 h，在荧光显微镜下观察绿色荧光数量与分布情况，以跟踪腺病毒的包装与增殖过程；转染6-8 d，局部出现绿色荧光葡萄串样聚集现象；转染10-12天，大量细胞病变变圆脱壁，出现明显的空斑，待约50%细胞从培养容器底部脱落时收集全部培养液与细胞至离心管中，将细胞悬液于-80/37℃反复冻融并涡旋振荡2次，5000g离心5 min，收集上清液，即为第1代病毒悬液。
用第1代病毒悬液侵染融合度约90%的293Ａ细胞，2-3天后，细胞出现病变，开始变圆脱落，待脱落50%左右，收集细胞按前述方法收集上清液，即为第2代病毒悬液。用第2代病毒悬液再次侵染293T细胞，重复“侵染—冻融—收集”，以大量扩繁病毒和提高病毒滴度。将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白（GFP）标记法测定病毒滴度。
三、细胞功能检测试验
细胞预处理（以用敲减基因研究基因对细胞增殖为例）：细胞以50000个/孔接种于6孔板，实验分组：①空白对照②阴性对照③实验组。37℃，5%CO2培养过夜后，换上OPTI-MEM培养基，同时加入根据MOI计算所需的病毒量，轻轻摇匀后继续培养4天，期间在荧光显微镜下观察绿荧光表达效率。
1、细胞活性检测
1）MTT实验
消化细胞并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度于96孔板中接种，每组设置5个复孔，连续检测5天。检测前，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT（PBS配制，pH=7.4），与37℃中孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解。然后在酶标仪上，读取490nm波长的吸光值。
2）CCK8实验
使用Cell Counting Kit（CCK8）CCK-8/WST-8试剂盒：消化细胞并制成单细胞悬浮液，以2000个/孔的密度于96孔板中接种，每组设置5个复孔，连续检测5天。检测前，每孔加入10μl CCK-8 试剂，37 ℃避光孵育2 h；然后将孵育后的培养基移到酶标板中，450 nm 处用BIO-RAD 酶标仪测定的吸光度。
3）Brdu实验
细胞以1.5×105个/ml细胞量接种于六孔板中（内放置一盖玻片），每组设置3个复孔，培养1天，
用含0.4％FBS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。加入BrdU（储液：1.0 mg/ml，终浓度为0.03 μg/ml），37℃，孵育40min。吸去上清，盖玻片用PBS轻轻洗涤2-3次，置于甲醇中固定10min后在空气中干燥，0.3％H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。随后用5％正常兔血清封闭，甲酰胺100℃，5 min变性核酸，冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数。
2、克隆形成
1）平板克隆（贴壁细胞）
细胞以500个/孔的细胞量接种于六孔板中，十字形手法摇匀，每组设置3个复孔，37℃，5% CO2中培养。每隔2天在显微镜下观察克隆的大小，每隔3天换上新的培养液。待大多数单克隆中的细胞数大于50的时候，在荧光显微镜下拍照。随后吸去培养液，用PBS 小心洗涤一次，每孔加0.1 ml 10％甲醇溶液固定细胞30 秒钟。吸去甲醇溶液，每孔加0.1 ml 结晶紫染液，室温中放置20 分钟。轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。
2）软琼脂集落形成（悬浮细胞）
细胞消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1000个/ml。制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和37℃左右预温的细胞悬液以1：9比例在40℃均匀混合，加入培养皿（直径60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。制备上层琼脂,取37℃不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入40℃、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。37℃、5%CO2静置培养2-3周后观察克隆形成情况。
3、细胞周期
细胞以30%的密度接种于6cm培养皿中，48 h 后用胰酶消化细胞，收集样品；12,000 rpm 离心5 min，收集细胞，弃上清；用预冷的PBS 洗涤两次，加入预冷的70%乙醇，于-20 ℃固定过夜；1,500 rpm 离心5 min，弃上清，用3 ml 的PBS 洗涤一次；加入250 μl 的100 μg/ml 碘化丙啶（propidium iodide, PI），250 μl RNase A（100μg/ml ），4 ℃避光孵育30 min；上流式细胞仪前以200 目尼龙网膜过滤细胞，以防细胞团聚堵塞流式细胞仪；采用Beckman 流式细胞仪分析样品，计数2-3 万个细胞；流式细胞仪结果用细胞周期拟和软件Flowjo 进行分析，每组实验独立三次重复。
4、细胞凋亡
1）AnnexinV/7-AAD流式
使用凯基公司KGA1026试剂盒。用不含EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm，3min 离心，吸去上清，用PBS洗1遍，离心后用PBS重悬细胞，进行细胞计数。取1E+5 个细胞量的悬液，离心弃上清，加入500 μl Binding buffer 重悬细胞。加入5 μL Annexin V-APC，混匀后，再加入5 μL 7-AAD染液，混匀，室温，避光，反应5-15 min后置于冰上。1小时内进行流式细胞仪机检测。GFP的绿色荧光：FITC通道筛选GFP阳性细胞进行Annexin V-APC／7-AAD荧光检测。Annexin V-APC的红色荧光：激发波长633nm，最大发射波长660 nm。7-AAD红色荧光：激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm。
2）DAPI染色
培养的单层细胞(未固定)或新鲜组织的冰冻切片等，PBS漂洗5分钟；DAPI工作液（DAPI储存液：将0.5mgDAPI溶于5ml PBS中，分装，低温长期保存；DAPI工作液：用PBS稀释DAPI储存液，终浓度为0.1ug／ml）室温染色5～20分钟(可根据实验材料的染色结果而定)；PBS漂洗；水溶
性封片剂封片，游离细胞也可直接用含DAPI的PBS封片；最后进行荧光显微镜观察：正常的细胞核呈强荧光，细胞质无荧光；固定的组织细胞同样处理，亦可得到相似的染色结果。
5、细胞运动
1)细胞划痕实验
消化细胞，按照80%的密度，接种于24孔板，每组设置三组重复。细胞培养过夜后，用预先灭菌的细竹签或枪头在孔的中部横向划伤一个区域，确保每一组划伤的区域大小一致，用PBS洗去漂浮的细胞，加入新鲜培养基。每隔24 h进行一次显微拍照，第一次拍照时作好记录，以后每次观察和拍照记录同一区域细胞生长的状态。照片用IPP统计软件对愈合前后的划伤区域面积进行统计，比较不同组之间愈合的速度，以此判断细胞的运动能力。
2）Transwell小室（Corning，3422）迁移实验/matrigel预制Transwell小室（BD，354480）侵袭实验
实验前，实验细胞用无血清培养基进行饥饿培养12-24h。用胰酶消化细胞，终止消化后，1500rpm 离心3min，吸去上清，用PBS重悬细胞清洗细胞1遍，离心弃上清后用含0.1%BSA的无血清培养基重悬细胞，并进行细胞计数。用含0.1%BSA的无血清培养基调整细胞密度至1E+5/ml（不同细胞所需细胞密度不同）。于24孔板中加入500 μL完全培养基(下室培养基血清浓度不同细胞会有所不同)；Transwell小室（以下简称小室）内部加入200 μL 细胞悬液；用镊子将小室小心转移至含有完全培养基的24孔板孔中，避免出现气泡；将24孔板轻轻放进细胞培养箱（5%CO2，37℃）中培养24h（不同细胞所需时间不同）；轻轻吸去上室培养基，用PBS润湿后的棉签轻轻擦去上室内的细胞；将小室底面浸入10％甲醇溶液中固定细胞30秒钟，转移至纯净水中，把甲醇洗掉，再把小室底面浸入结晶紫染液中染色20min，用纯净水清洗至背景清晰。镜下随机选取5个视野，计数穿过膜细胞数。每个
小室中加入100μl 33%醋酸，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液在酶标仪上570nm 测其OD值。
6、细胞衰老
使用碧云天β-半乳糖苷酶染色试剂盒（C0602）进行检测，步骤如下：预处理的细胞，按照40%的密度，接种于24孔板。待细胞生长3-4天后，吸去上清。用PBS洗涤1次加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制染色工作液。37℃孵育过夜，可以用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察并计数，被染成深蓝色的细胞即为衰老阳性细胞。
四、研究模型的建立
1、新鲜组织分离原代细胞
新鲜手术取得或冻存的组织于37 ℃快速复温，原代细胞培养工作液清洗3次，尽量修剪去除纤维组织，将组织块剪成约1 mm3大小的小块，弯头吸管吸取组织块均匀种植于75 cm2培养瓶瓶底，瓶内加入少量原代细胞培养工作液，小心翻转培养瓶使组织块黏附于瓶底，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6-8 h，待组织贴壁后，正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。每日定时观察细胞生长状况，记录细胞生长满瓶时间，并收集培养细胞送病理学检查。
①酶消化法纯化肿瘤细胞：当组织块培养15-20d后，组织块（包括无活性的肿瘤细胞、破碎细胞和成纤维细胞等）自动脱落。取出培养瓶，弃掉培养基和漂浮的组织块，用5 mL PBS 洗涤一次。加1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋转培养瓶4-5次，使胰蛋白酶包被所有瓶内细胞，放入37 ℃细胞培养箱中2 min。取出培养瓶在倒置显微镜下观察，可见部分细胞首先变圆、脱落被消化下来，这时停止消化。这些首先被消化下来的细胞为成纤维细胞，吸除成纤维细胞及消化液。加入5 mL培养液，
用吸管吹打细胞，收集细胞悬液。离心后弃上清。加入PBS 洗涤细胞沉淀，再离心弃上清，再加入培养液后接种于培养板中继续培养。
②机械刮除法纯化肿瘤细胞：用不锈钢丝末端插橡胶刮头或裹少许脱脂棉制成，高压灭菌后备用。用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜下，刮除无标记空间；再用PBS冲洗1-2次，洗除被刮掉的细胞；继续培养，如发现成纤维细胞残留，重复刮除至完全除掉为止。
2、细胞分选（以分离肿瘤组织中的CD133+细胞为例）
1）流式分选
无菌条件下收集肺癌病人手术中切除的肺癌肿瘤组织，用PBS缓冲液清洗组织2次，利用眼科剪去除组织中的坏死部分和血管等，将肿瘤组织块浸泡于5倍体积的peniclillin (1 000 U/mL)和streptomycin(1 000 U/mL)混合液中10 min。弃抗生素，将肿瘤组织剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织小块，然后加入5倍体积的胰酶消化液(0.25%胰酶含0.02% EDTA)，于37 ℃环境下震荡消化30 min。随后，加入5倍体积的含10%胎牛血清的细胞完全培养基加以终止，上下颠倒震荡使细胞脱落，过200目筛网，于1500 r/min离心5 min。收集细胞沉淀，加入100 μL预冷的PBS缓冲液，随后加入rabbit anti-human CD133-FITC monoclonal antibodies各4μL，并于4℃环境中避光孵育30min。利用流式细胞仪(BD FACSAria，BD Bio-science，CA，USA)将CD133+和CD133-分选出来，并悬浮于无血清的干细胞培养基动物实验培养基中，37℃、5%CO2培养。
2）磁珠分选
组织消化为细胞同上，获得的细胞用分选缓冲液洗涤，以800 g 速度离心3 min 弃上清，将沉淀加入300μL 分选缓冲液混匀，再加入100μL CD133 免疫磁珠，混匀后4℃避光孵育30 min，再
加入缓冲液洗涤，以800 g 速度离心10 min，弃上清，再用缓冲液重悬细胞。先用500 μL缓冲液冲洗分选柱，将细胞悬液过柱。缓冲液洗分选柱3 次，移柱出磁场。1 mL 缓冲液洗柱，用泵加压，收集洗液即为CD133+细胞。
五、机制研究
1、高通量筛选
1）基因芯片/蛋白芯片
GeneA shRNA慢病毒感染细胞6天后，TRIzol裂解后吸出小部分，进行qPCR检测，验证敲减效率。其余样品冻存与-80℃后送芯片公司（***公司）进行***芯片检测。样品实验分组：阴性对照组、实验组。
检测结果通过标准化处理，差异筛选后，进行GO分析、pathway分析，筛选出GeneA敲减后，变化最大的信号通路。
2、蛋白-蛋白相互作用
1）酵母双杂筛选目的基因相互作用蛋白（以文库筛选为例，也可进行一对一验证）通过PCR 方法扩增GeneA基因cDNA 片段，克隆进入pGBKT7 载体，构建pGBKT7-GeneA 诱饵质粒；将被诱饵质粒转化的AH109 分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade 和SD/-Trp/X-α-Gal 平板上，以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因；确认没有自激活，就可将已被诱饵质粒转化的AH109与预转染于Y187 的人类肝cDNA 文库进行酵母双杂交，分离阳性克隆中的cDNA，并测序。所得序列与数据库进行对比，获得与GeneA有蛋白相互结合作用的候选分子。
2）Co-IP(以一对一验证为例，也可与质谱联用进行筛选)
将欲验证相互作用的2个分子（A和B）分别构建表达载体并共转染293T细胞。转染后24-48 h 后收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4℃，最大转速离心30 min后取上清；取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg GeneA的抗体，4℃缓慢摇晃孵育过夜；取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4℃以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟，分别用A和B的抗体进行Western Blot检测。
3）GST-pulldown
方案1：已知目的GeneA，欲寻找A549细胞中与GeneA有相互结合作用的未知蛋白（GST-pulldown 结合质谱技术）
构建GeneA的带GST标签表达载体，转染至293T，48小时后收集细胞，裂解、蛋白定量。A549细胞蛋白裂解液用GST-谷胱甘肽琼脂糖珠子于4℃孵育2h，以去除非特异性结合蛋白，孵育后于4℃，800g离心5 min后取上清。根据293T蛋白浓度，加入过量GST-谷胱甘肽琼脂糖珠子以及预处理后的A549蛋白裂解液，于4℃孵育过夜。离心5 min收集沉淀并用1 XPBS（含0. 5% TritonX-100）洗涤。沉淀加入2X 电泳上样缓冲液于沸水浴10 min裂解，10%分离胶的SDS-PAGE分离，考马氏亮蓝染色显示蛋白质条带。
切取蛋白质条带进行酶解。蛋白质条带用双蒸水冲洗2次，加入100ul新配制的脱色工作液(50%乙腈，25mmol/L NH4HCO3)，37℃水浴30min，直至蛋白质条带呈无色透明。加50%乙腈脱水直至胶块完全变白后再进行还原烷基化，即加入80ul 10mmol/L DTT，57℃水浴1h，吸去多余的DTT 后加80μL6mmol/L IAA置于暗处反应45min。25mmol/L NH4HCO3吸胀并加50%乙腈脱水，最后
置于真空干燥器中冷冻干燥。加入胰蛋白酶酶解16h，吸出含肽片段的上清后在胶块上加40ul萃取液(100%乙腈，5%TFA)，超声辅助提取两次，合并萃取液和吸出的上清液体后冷冻离心干燥。冻干后的样品用35L样品溶解液（0.1%甲酸，50%乙腈）溶解，12000g，12min离心，取上清用德国Bruker 公司的HCT仪器进行质谱分析。
质谱数据分析主要采用本地化的Mascot程序，使用MatrixScience网站（https://www.doczj.com/doc/417555146.html,）提供的IPI_rat_3.26RAT_v3.26进行检索。检索时，可接受的肽段相对分子质量误差为0.6。氨基酸固定修饰方式选Carbamidomethyl(C)修饰，可能的修饰方式选Oxidation(M)修饰。本地运行的Mascot数据库查询结果的有效值为39分以上。
方案2：已知目的GeneA和GeneB，验证A和B是否有相互结合作用（GST-pulldown）分别构建GeneA的带GST标签，GeneB带His标签表达载体，将这两个载体共转染入293细胞，48小时后收集细胞，裂解。取50-70ul GST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将293细胞裂解液与之混匀，4℃孵育1小时，离心收集沉淀，用PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，然后分别用GST和His抗体进行Western Blot检测，以裂解液和GST空载体分别作为阳性、阴性对照。
3、DNA-蛋白相互作用: 染色质免疫共沉淀技术(ChIP-PCR)
将GeneA表达载体转染293T样品（10cm培养皿），加入37%甲醛（终浓度为1%），37℃孵育10min后加入甘氨酸终止交联。吸去培养基，PBS洗涤2遍，用细胞刮将细胞收集于15 ml离心管中，预冷后离心去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer，超声破碎，离心取上清300μl（其他冻存于-80℃），分成3组：100ul加GeneA抗体作为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M
NaCl（NaCl终浓度为0.2M）；65℃处理3小时解交联，跑电泳，检测超声破碎效果。加入900 ul CHIP Dilution Buffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1小时，4℃静置10分钟沉淀，700rpm离心1分钟。取上清。各留取20ul作为Input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。加入60ul Protein A Agrose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2小时。4℃静置10分钟后，700rpm 离心1 分钟。除去上清。缓冲液清洗沉淀复合物后进行洗脱。管中加入20ul 5M NaCl，混匀，65℃解交联过夜。解交联结束后，每管加入1ul RNaseA (MBI)，37℃孵育1小时。每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl(pH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45℃处理2小时。DNA片段的回收——omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。设计引物进行PCR鉴定。
4、RNA-蛋白相互作用：RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP-PCR）
将GeneA表达载体转染293T样品，消化细胞，离心去上清。加入polysome lysis buffer进行裂解。冻融后离心，上清转移至新的EP管中。Sigma beads置于1.5mlEP管中，EP管置于磁力架上，吸去上清，加入封闭液进行封闭3h，去掉封闭液后，加入IP solusion重悬beads，平分至2个EP 管中，分别加入细胞裂解上清。置于磁力架上10数秒后，吸出一点上清作为input mRNA，加入TRIzol 置于室温。其余含beads的IP solution置于4℃混合仪翻转4h，然后将EP管置于磁力架上10数秒后，吸去全部上清，并用缓冲液洗beads4-5次后，加入TRIzol，这部分为output。将input和output 两部分样品用氯仿抽提RNA，反转录后，设计引物进行PCR鉴定。
六、动物实验--裸鼠成瘤
细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分组，阴性对照组，实验组。
订购裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司，Balb/c裸鼠，雄性，6周龄。每组10只），适应一周
后进行注射：细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2E+6个细胞，注射体积为100μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，80mg/kg，待小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一分4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一分-80℃冻存。
对于转移模型，还需要打开腹腔，统计转移灶结节数量，并置蓝色背景布上拍照。将转移灶一分为二，一分4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一分-80℃冻存。
4%多聚甲醛固定后续用石蜡包埋，制成石蜡切片，用于免疫组化。-80℃冻存样品进行总蛋白抽提，用于Western Blot检测。
七、免疫组化
收集临床病理样本：收集临床病理和随访资料齐全的200例***癌症患者样本，分组根据不同TMN 分期。一部分组织制作石蜡块用于组织微阵列芯片检测；另一部分新鲜组织用于总RNA抽提，并反转录为cDNA。
通过免疫组化检测GeneA在***癌组织芯片中的表达情况：根据临床病理资料和治疗、预后数据，分析GeneA的表达与肿瘤的临床症状（包括药物缓解率（response rate, RR），疾病控制率(disease control rate, DCR)，无进展生存期（progression-free survival, PFS）和总生存期（overall survival, OS））及其他临床病理特征之间的相关性。使用SPSS 17.0软件进行数据统计分析。
反转录获得的cDNA，进行real-time PCR 检测：确定组织样本中GeneA以及其他下游分子的mRNA表达水平。结合临床病理资料，分析GeneA在不同恶性程度的***肿瘤中表达差异，同时验证其通路机制中的相关分子。