银耳多糖的提取工艺
李帅涛
摘要：国内常用的银耳多糖提取方法有热水提取法，酸碱提取法和酶解提取法等，其中酶解提取法具有提取时间短，条件温和等优点。本试验选取了酶解时间和提取时间作为研究对象，探讨了不同条件下银耳多糖的收率，由试验结果表明，解法提取银耳多糖的最适条件为：银耳与水的比例为1g:50ml,加入果胶酶浓度为1%，酶解时间45min,提取时间60min。
关键词：银耳多糖；酶解法；提取工艺
引言：我国银耳资源丰富，为开发应用银耳多糖提供了有利条件。近年来，有关银耳多糖的研究越来越多，但这些研究多为银耳多糖的化学特性和药理作用方面的研究，少有关于银耳中提取银耳多糖的研究。目前银耳多糖的提取方法多为热水浸提法或酸碱法提取，但热水浸提法耗时过长，且收率较底，费时费力，因此不适合大规模的工业生产，而酸碱法提取虽然提取时间较短，却会破坏银耳多糖立的生物活性，使提取到的银耳多糖药用效果大大下降。本试验主要研究使用果胶酶酶解银耳，热水提取的技术来提取银耳多糖的方法。而如今生物工程工艺发展迅速，生物制品价格不断下降，这为用酶解法提取银耳多糖提供了可行性。用酶解法提取银耳多糖不仅能缩短单纯用热水法提取的时间，还不会像酸碱法那样破坏银耳多糖的生物活性。
材料与设备:
①实验材料：银耳;葡萄糖(分析纯):取1g葡萄糖加入1000ml容量瓶中，定容至1000ml;果胶酶：按100ml:1g加入果胶酶;苯酚（分析纯）;精确量取6ml苯酚放入100ml容量瓶中，定容至100ml;浓硫酸(发烟硫酸)
②实验设备：101型电热鼓风干燥；YP202N型电子天平；HH系列恒温水浴锅；电子万用炉;TDZ5-WS型台式低俗离心机；722E型可见分光光度计
分离与纯化：取市售银耳适量，洗净，70℃烘干后，破碎成粉末状，称取粉末0.5g（2%），果胶酶0.25g（1%），同时加入蒸馏水25mL，迅速置于45℃水浴锅中酶解，3个样品为一组，第一组酶解30min，第二组酶解45min，第三组酶解60min。酶解后迅速升温至98℃将酶灭活，然后每组样品分别于98℃水浴中保温浸提30min,45min,60min，浸提完成后置于冷水中冷却至室温，然后于4500rpm离心分离10min，最后取上清液待用。
含糖量测定：银耳浸提液离心后，分别取上清液1ml,加水19ml,即稀释20倍，取银耳浸提稀释液1mL于一洁净试管中，再加入苯酚试液1.0mL，浓硫酸5mL，混匀，室温放置30min，冷却后，于490nm处测定吸光度。
结果与分析：本试验采用果胶酶酶解银耳的方法提取银耳多糖。试验讨论了不同酶解时间与不同提取时间对提取效果的影响，最终确定最佳提取工艺为：在45℃下，用1%果胶酶酶解，水与银耳比例为100ml:1g,酶解时间为45min，然后于98℃热水浴中浸提60min。用此法提取银耳多糖，提取率可达40% ，远高于传统的银耳多糖提取工艺。相比传统工艺，果胶酶提取银耳多糖不仅有较高的提取率，还可以明显缩短提取的时间。银耳多糖的生物活性在长时间高温环境和酸碱性条件下容易受到破坏，酶解法提取环境温和，且提取时间较短，能较好的保留银耳多糖的生物活性。固定酶解时间时，提高提取时间可显著提高提取效果，改变酶解时间时，提取效果有提高，但不大，且从45min 增加到60min增加不显著。
燕山大学 课程设计说明书银耳多糖的提取与纯化工艺的设计 学院（系）：里仁学院建环系 年级专业：10级生物制药 学号：101610051006 学生姓名：韩雨薇 指导教师：崔洪霞 教师职称：副教授
燕山大学课程设计（论文）任务书 院（系）：里仁学院基层教学单位：建环系 说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。
燕山大学课程设计成绩评定表
2013-2014 秋季学期 生物工程专业课程设计 结题论文 银耳多糖的提取与纯化工艺的设计 学院（系）：里仁学院建环系 年级专业：10级生物制药 学号：101610051006 学生姓名：韩雨薇 指导教师：崔洪霞 教师职称：副教授
银耳多糖是银耳中的主要活性物质，来源于银耳子实体和银耳细胞深层发酵孢子中分离、纯化得到的杂多糖。现代医学和药理学的很多研究将银耳多糖的药用功效概括为提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多种生理功能。本设计通过采用微波辅助提取法来提取银耳多糖。在微波提取系统中，影响多糖提取率的主要因素有三个：微波功率、加热时间、加热温度。针对这三个因素分别设计单因素实验，根据单因素实验得出最佳范围，然后再根据所得出的范围做三因素三水平的正交实验，从而得出最佳的提取条件组合。本文系统地综述了银耳多糖的化学组成、制备和提取纯化、生物活性、实际应用等方面的研究概况，并展望了其今后研究方向及开发应用前景。 关键词：银耳多糖；提取；纯化
第一部分文献综述 1、银耳多糖简介 (1) 1.1银耳多糖的组成 (1) 1.1.1酸性杂多糖 (1) 1.1.2中性杂多糖 (1) 1.1.3胞壁多糖 (2) 1.1.4胞外多糖 (2) 1.1.5酸性低聚糖 (2) 2、银耳多糖的提取及制备 (2) 2.1银耳多糖的提取方法 (2) 2.1.1浸提法 (2) 2.1.2超声波辅助提取法 (3) 2.1.3微波辅助提取法 (4) 2.1.4超临界流体萃取法 (4) 2.2银耳多糖的干燥方法 (4) 2.3银耳多糖生理活性试验 (5) 2.3.1银耳多糖清除羟自由基活性 (5) 2.3.2银耳多糖清除超氧阴离子自由基活性 (5) 2.3.3银耳多糖的抗氧化作用 (5) 3、银耳多糖的功能特性 (5) 3.1在食品生产中的加工特性 (5) 3.2在化妆品生产中的加工特性 (5) 3.3银耳多糖的药理学特性 (6) 3.3.1免疫调节作用 (6) 3.3.2抗肿瘤作用 (6) 3.3.3降血糖、降血脂作用 (6) 3.3.4抗溃疡作用 (6) 第二部分课程设计部分 1. 材料 (8)
第一部分：野生灵芝菌种的分离、扶壮、保藏和培养 前言 采集吉林长白山野生灵芝，经过菌种分离，鉴定为GANODERMA（英文名称）多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.) Karst．的菌种。经过纯化扶壮培养，成为一支优良的灵芝菌种，为灵芝菌丝体发酵培养和灵芝多糖的提取奠定了基础。 实验室流程：（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（恒温培养箱）菌种培养扶壮（恒温恒湿冷藏柜）优良菌种保藏（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（摇床）发酵菌种摇瓶培养（用于接种菌种罐） 第二部分：灵芝菌丝体液体发酵培养 前言 液体发酵培养不同于灵芝子实体栽培，周期短，产量高，无污染，灵芝多糖含量高，节省木材和耕地。是一种灵芝多糖理想的工厂化现代科技生产方式。经过摇瓶培养的灵芝菌种接种于种子罐，待生长良好，在接种于扩大的发酵罐中，通过通气恒温培养，长成成年灵芝菌丝体，生长完全后，进行离心分离喷雾干燥，就得到相当于灵芝子实体的灵芝菌丝体粉，多糖含量达到15%左右。进一步提取加工得到高含量的灵芝多糖。 灵芝菌丝体发酵工艺流程:（配料罐）培养液的配制（菌种罐）菌种的发酵培养 （发酵罐）灵芝菌丝体发酵培养（离心机）灵芝菌丝体固液分离（浓缩液配制罐)灵芝菌丝体配制成浓缩液（喷雾干燥塔）浓缩液喷雾干燥，得到灵芝菌丝体粉 第三部分：灵芝菌丝体多糖的提取分离 前言 灵芝菌丝体粉，是大部分不溶解于水，食用以后象灵芝子实体一样，只有少部分成分被吸收，通过现代提取手段，将灵芝菌丝体经过提取罐的水提取，经过真空浓缩，在经过醇沉工艺，加工成可以全部被人体吸收，灵芝多糖含量提高到30-40%灵芝菌丝体提取物。极大的提高了功效，减少了服用量。 灵芝多糖提取工艺流程：(提取罐）灵芝菌丝体粉水提取（外循环真空浓缩罐）提取液真空浓缩（醇沉罐）浓缩液乙醇沉淀多糖（离心机）沉淀多糖分离 (浓缩液储罐）沉淀物配制成多糖浓缩液（喷雾干燥塔）灵芝多糖喷雾干燥 （粉碎机）灵芝多糖粉碎到100目（混合机）灵芝多糖粉批量混合（真空包装机）食品塑袋真空包装。灵芝多糖原料成品
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
目录 摘要 (1) 关键词 (1) Abstract (1) Key words (1) 1 前言 (2) 2 仪器、设备和试剂 (2) 2.1 材料、与设备 (2) 2.2试剂及溶液的配制 (2) 3.方法及试验步骤 (2) 3.1葡萄糖含量标准曲线的制作 (2) 3.2 银耳多糖的提取方法 (3) 3.3 银耳多糖含量的测定 (4) 4 结果与分析 (4) 4.1 银耳多糖含量测定结果 (4) 4.2 酶解法提取银耳多糖结果分析 (5) 5小结与讨论 (6) 参考文献 (7)
果胶酶提取银耳多糖的研究 摘要：国内常用的银耳多糖提取方法有热水提取法，酸碱提取法和酶解提取法等，其中酶解提取法具有提取时间短，条件温和等优点。本试验选取了酶解时间和提取时间作为研究对象，探讨了不同条件下银耳多糖的收率，由试验结果表明，解法提取银耳多糖的最适条件为：银耳与水的比例为1g:50ml,加入果胶酶浓度为1%，酶解时间45min,提取时间60min。 关键词：果胶酶；银耳多糖；酶解 On Pectinase extract of Tremella polysaccharides Abstract:Tremella polysaccharide extraction of hot water extraction method, the acid-base extraction and enzymatic extraction, enzymatic extraction with extraction time is short, under mild conditions. This test selected the study of enzymatic hydrolysis time and extraction time to explore the Tremella polysaccharides yield under different conditions, the results showed that the optimal conditions of the solution extract of Tremella polysaccharides: white fungus and water ratio 1g: 50ml join the pectinase concentration of 1%, the hydrolysis time was 45min, extraction time 60min. Key words: Pectinase; the Tremella polysaccharide; enzymatic
植物多糖及其提取方法 1 前言 多糖是自然界和生物体中广泛存在的物质，它是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。它具有多种生物活性，与生物机能的维持密切相关，与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工、转移方面起着不容忽视的作用。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。我国对多糖研究始于20世纪70年代，植物多糖由于它们独特的功能和低毒性，作为新药发展的方向具有广阔的应用前景，越来越多的研究人员将目光投向植物多糖。 2 植物多糖的结构 植物多糖是由许多相同或不同的单糖以a或p一糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等。多糖有复杂的四级结构，一级结构指糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型及糖链有无分支、分支的位置与长短等；二级结构指多糖主链以氢键为主要次级键而形成的有规则构象；三、四级结构是指以二级结构为基础，糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序地空间产生规则构象。植物多糖的
主链与支链形成了特殊的构型一凹形槽。凹形槽是一级结构与构象的体现。凹形槽的支链与活性关系为：支链度越大，凹形槽越多，生物活性越大。近年来，人们对多糖的结构和活性的研究不断深入，进一步阐明了多糖作用机制与结构的关系，其多样性的生理活性更加受到重视。 3 植物多糖的功能 多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。 (1)免疫调节功能。由于现代医学、细胞生物学及分子生物学快速发展，人们对免疫系统的认识越来越深入。免疫系统紊乱，会导致人体衰老和多种疾病的发生。植物多糖是一种免疫调节剂。多糖对肌体的免疫调节作用，包括激活巨噬细胞，激活网状内皮系统，激活T和B细胞，激活补体，进干扰素的生成，促进白细胞介素的生成，诱生肿瘤坏死因子等。 2)抗肿瘤活性植物多糖主要是通过增强机体的免疫功能来达到杀伤肿瘤细胞的目的，许多高等植物中都含有抗肿瘤活性的多糖，如芦荟多糖、香菇多糖提取物、人参多糖具有
银耳多糖的提取工艺 李帅涛 摘要：国内常用的银耳多糖提取方法有热水提取法，酸碱提取法和酶解提取法等，其中酶解提取法具有提取时间短，条件温和等优点。本试验选取了酶解时间和提取时间作为研究对象，探讨了不同条件下银耳多糖的收率，由试验结果表明，解法提取银耳多糖的最适条件为：银耳与水的比例为1g:50ml,加入果胶酶浓度为1%，酶解时间45min,提取时间60min。 关键词：银耳多糖；酶解法；提取工艺 引言：我国银耳资源丰富，为开发应用银耳多糖提供了有利条件。近年来，有关银耳多糖的研究越来越多，但这些研究多为银耳多糖的化学特性和药理作用方面的研究，少有关于银耳中提取银耳多糖的研究。目前银耳多糖的提取方法多为热水浸提法或酸碱法提取，但热水浸提法耗时过长，且收率较底，费时费力，因此不适合大规模的工业生产，而酸碱法提取虽然提取时间较短，却会破坏银耳多糖立的生物活性，使提取到的银耳多糖药用效果大大下降。本试验主要研究使用果胶酶酶解银耳，热水提取的技术来提取银耳多糖的方法。而如今生物工程工艺发展迅速，生物制品价格不断下降，这为用酶解法提取银耳多糖提供了可行性。用酶解法提取银耳多糖不仅能缩短单纯用热水法提取的时间，还不会像酸碱法那样破坏银耳多糖的生物活性。 材料与设备: ①实验材料：银耳;葡萄糖(分析纯):取1g葡萄糖加入1000ml容量瓶中，定容至1000ml;果胶酶：按100ml:1g加入果胶酶;苯酚（分析纯）;精确量取6ml苯酚放入100ml容量瓶中，定容至100ml;浓硫酸(发烟硫酸) ②实验设备：101型电热鼓风干燥；YP202N型电子天平；HH系列恒温水浴锅；电子万用炉;TDZ5-WS型台式低俗离心机；722E型可见分光光度计 分离与纯化：取市售银耳适量，洗净，70℃烘干后，破碎成粉末状，称取粉末0.5g（2%），果胶酶0.25g（1%），同时加入蒸馏水25mL，迅速置于45℃水浴锅中酶解，3个样品为一组，第一组酶解30min，第二组酶解45min，第三组酶解60min。酶解后迅速升温至98℃将酶灭活，然后每组样品分别于98℃水浴中保温浸提30min,45min,60min，浸提完成后置于冷水中冷却至室温，然后于4500rpm离心分离10min，最后取上清液待用。 含糖量测定：银耳浸提液离心后，分别取上清液1ml,加水19ml,即稀释20倍，取银耳浸提稀释液1mL于一洁净试管中，再加入苯酚试液1.0mL，浓硫酸5mL，混匀，室温放置30min，冷却后，于490nm处测定吸光度。 结果与分析：本试验采用果胶酶酶解银耳的方法提取银耳多糖。试验讨论了不同酶解时间与不同提取时间对提取效果的影响，最终确定最佳提取工艺为：在45℃下，用1%果胶酶酶解，水与银耳比例为100ml:1g,酶解时间为45min，然后于98℃热水浴中浸提60min。用此法提取银耳多糖，提取率可达40% ，远高于传统的银耳多糖提取工艺。相比传统工艺，果胶酶提取银耳多糖不仅有较高的提取率，还可以明显缩短提取的时间。银耳多糖的生物活性在长时间高温环境和酸碱性条件下容易受到破坏，酶解法提取环境温和，且提取时间较短，能较好的保留银耳多糖的生物活性。固定酶解时间时，提高提取时间可显著提高提取效果，改变酶解时间时，提取效果有提高，但不大，且从45min 增加到60min增加不显著。
Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(3), 230-236 Published Online May 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/4116237105.html,/journal/ojns https://https://www.doczj.com/doc/4116237105.html,/10.12677/ojns.2018.63033 Extraction and Antioxidation of Polysaccharide from Tremella fuciformis Ying Li, Min Lv, Shilong Cang, Dongyu Hou, Shaoyi Yu, Xinjun Zhu College of Life Science, Dezhou University, Dezhou Shandong Received: May 10th, 2018; accepted: May 24th, 2018; published: May 31st, 2018 Abstract Tremella polysaccharides were extracted from Tremella dry sample using ultrasonic extraction method. The effect of material to liquid ratio, temperature and time on the extraction efficiency was investigated, and the results showed that the optimum ratio was 1:40, the temperature was 60?C and the extraction time was 30 min. The antioxidant activity of Tremella polysaccharides was investigated using 2,2’-Azino-bis(3-ethyl benzothiazo line-6-sulfonic acid)(ABTS)asradical model. The results showed that Tremella polysaccharides extracted via ultrasonic extraction method had obvious antioxidant activity. Keywords Temella Polysaccharides, Ultrasonic Extraction, Antioxidant 银耳多糖的提取及抗氧化的探究 李颖，吕敏，仓世龙，侯冬玉，于少艺，朱新军 德州学院生命科学学院，山东德州 收稿日期：2018年5月10日；录用日期：2018年5月24日；发布日期：2018年5月31日 摘要 以银耳干品为实验材料，研究了超声提取法对银耳多糖提取效率的影响。通过考察料液比、温度及提取时间对银耳多糖提取率的影响，发现在料液比为1:40，温度为60?C，提取时间为30 min为最佳提取条件。 以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为自由基模型，考察了银耳多糖的抗氧化性能。 结果表明，该法提取的银耳多糖具有明显的抗氧化能力。
一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与
酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 1．5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。另外，超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。超声提取的影响因素有：超声时间、超声频率（一般低频中提取效率高，但也有例外）、料液比和温度等。 1．6 微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力强、选择性高、加
多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。 纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。 1.2.1发酵、提取 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通 气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙 醇，离心得乙醇沉淀物一Le[‘’。 1.2。2分离、纯化 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分 部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓 缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2· Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱， 后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法 检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含 lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o 1.2.3鉴定 1.2.3.1纯度 (l)HPLC法将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;
银耳多糖资源化学与应用 摘要：本文介绍了银耳多糖的资源状况、结构特性、生物活性、提取纯化及检测研究进展，总结了银耳多糖的开发与利用现状，为今后银耳多糖的有效开发与深加工利用提供重要参考。 关键字：银耳多糖；生物活性；开发利用 银耳又称白木耳、雪耳，被称为“菌中之冠”。自古以来，银耳作为一种珍贵的食用菌和重要药材，被誉为“延年益寿之珍品”。银耳含有丰富的多糖、蛋白质、矿物质、维生素等营养及功能成分，其中银耳多糖的含量约占银耳干重的60~70%，研究发现银耳多糖具有降血脂、降血糖、抗溃疡、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、改善记忆力等功效[1-2]。近年来，银耳多糖还被广泛应用于食品、保健品、化妆品及医药等领域。本文对银耳多糖的资源状况、结构特性、生物活性、提取分离及检测研究进展进行了介绍，为银耳多糖的有效开发与深加工利用提供重要参考。 1 银耳的资源状况 银耳是中温型菌类，主要生长于温带和亚热带地区。我国是银耳的重要产区，其中以福建古田、四川通江的产量最大，另外在我国浙江、江西、台湾、内蒙古、西藏等地区均有分布。我国于1958年在福建古田首创瓶栽法开始种银耳，1978年首创袋栽法开始推广种植，1983年开始利用棉籽壳大规模种植银耳。随着制种和栽培技术的发展，银耳产量大幅度提高。目前我国银耳主要采用层架式代料栽培，该方法原料易得、生长周期短、产量高、空间利用率高、管理方便，且所得银耳中氨基酸含量略高于段木栽培[3]。我国是银耳生产及出口大国，银耳资源十分丰富，但有关银耳制种及栽培、银耳成分及价值、银耳加工及利用等方面都有待更进一步的深入研究。 2 结构特性与生物活性 2.1 银耳多糖的结构特性 银耳多糖是以α-(1→3)-D-甘露糖为主链的杂多糖，主链的2,4,6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及普通糖醛酸等残基组成的侧链。银耳多糖在子实体、孢子、发酵液和细胞壁中都有存在，其组成单糖有葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖醛酸。银耳多糖作为银耳的主要活性成份可分为酸性杂多糖、中性杂多糖、酸性低聚糖、胞壁多糖和胞外多糖5大类，其中酸性杂多糖约占银耳总多糖的70~75%，为木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主的多聚体，其中有少量岩藻糖。而中性杂多糖约占银耳总多糖的20%，为木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的多聚体[4]。 2.2 银耳多糖的生物活性 2.2.1 降血糖血脂 银耳多糖能够阻抑肠道对脂类的吸收，减少外源性脂类进入机体外，对高脂血症有一定的降脂作用。田春雨等[5]研究银耳多糖对链脲佐菌素和高能量饲料诱发的2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂的影响，结果表明采用高能量饮食加STZ诱发的2型糖尿病大鼠空腹血糖、
武汉工商学院 生物制药工程技术论文 学院：环境与生物工程学院 专业：生物工程年级：2012级 学生：夏继承学号1204011104 指导教师：乐薇职称: 副教授 题目: 水浸提银耳多糖的关键技术研究 2015年4月5日
目录 水浸提银耳多糖的关键技术研究 (1) 摘要 (1) Abstract (1) 2.实验试剂及仪器 (2) 2.1实验试剂 (2) 2.2实验仪器 (3) 3.实验部分 (3) 3.1标准曲线的制作 (3) 3.2实验材料预处理 (4) 3.3单因素试验 (4) 3.3.1料水比单因素试验 (4) 3.3.2温度单因素试验 (4) 3.3.3pH值比单因素试验 (4) 3.3.4时间单因素试验 (4) 3.4单因数试验结果与讨论 (4) 3.5正交试验 (6) 3.6正交试验结果与讨论 (7) 3.7验证性试验 (7) 4.结论 (7) 致谢 (9)
水浸提银耳多糖的关键技术研究 摘要 为充分利用提取银耳多糖，探讨银耳多糖的水浸提的关键技术。本设计用正交分析法研究了温度、pH值、料水比、时间等四个因数对银耳多糖的水浸提法的效率影响，并获得的最佳的提取条件为温度50℃，pH值12，料水比1:50，时间2h。 关键词：水浸提取；银耳多糖；关键技术 Key techniques of water extraction of tremella polysaccharide Abstract To make full use of tremella polysaccharide extracted, this paper discusses the key technology of tremella polysaccharide water leaching. This design for the four factor of water extraction of tremella polysaccharide extraction efficiency was studied, and obtain the best extraction conditions for temperature is 50 ℃, the pH value is 12, the ratio of material to water is 1:50, time is 2 h Key words: water immersion extraction; Tremella polysaccharide; The key technology 1
1、多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。 1.1溶剂法 1.1.1水提醇沉法 水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。 1.1.2酸提法 为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1.1.3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。 1.1.4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术就是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体就是指物质处于临界温度与临界压力以上时的状态,这种流体兼有液体与气体的特点,密度大,粘稠度小,有极高的溶解,渗透到提取材料的基质中,发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大,提取结束后,再通过减压将其释放出来,具有保持有效成分的活性与无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件(TC＝304.6 ℃,Tp＝7.38 MPa)容易达到,常用于超临界萃取的溶剂,在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物,在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点就是设备复杂,运行成本高,提取范围有限。 1.2酶解法 1.2.1单一酶解法 单一酶解法指的就是使用一种酶来提取多糖,从而提高提取率的生物技术。其中经常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用,使其结构变得松散;蛋白酶还会使糖蛋白与蛋白聚糖中游离的蛋白质水解,降低它们对原料的结合力,
银耳提取银耳多糖工艺流程 一、综述 1、银耳 银耳又名白木耳，是一种高等真菌，性味甘、平、具有滋阴润肺、养胃生津之功效，自古以来被人们看作是延年益寿的佳品，是世界公认的最珍贵的食用菌和重要药材。 银耳子实体中除银耳多糖物质外，还含有一定量的果胶质、蛋白质、粗纤维等成分，这些物质的存在，将不利于多糖物质的提取分离和纯化。 2、多糖 多糖又名多聚糖，通常由多个单糖分子通过缩合、失水从而由甘糖键结合而成的一类分子结构复杂的高分子化合物。根据其脱水缩合的成分不同，可分为均一性多糖、不均一性多糖。 多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖、调节身体免疫力等多种作用。 3、银耳多糖简介 银耳多糖( Tremella polysaccharides，TP) 是银耳的重要活性成分( 约占银耳干重的60%-70% ) ，是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖。 大量研究表明，从银耳中提取分离得到的银耳多糖具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变、抗肿瘤等作用，能增强机体耐缺氧能力，清除自由基。 1.1银耳多糖的组成 银耳多糖的主链是由α-(1-3)-糖苷键组成的甘露聚糖，主链的2，4，6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及普通糖醛酸等残基组成的侧链，其活性中心是α -(1-3)-甘露聚糖这一共同结构部分。银耳多糖种类包括酸性杂多
糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖和酸性低聚糖五种，不含核酸、蛋白 质类物质[3]。 1.1.1酸性杂多糖 约占银耳总多糖的70%~75%，为木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主的多聚 体，中有少量岩藻糖。 1.1.2中性杂多糖 约占银耳总多糖的20% 左右，为木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的多聚 体。 1.1.3胞壁多糖 根据文献报道，一种是从胞壁外层产生的酸性多糖，由D-葡萄糖醛酸、 D-甘露糖和D-木糖组成；另一种为碱性多糖，由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、 D-甘露糖和D-木糖组成。 1.1.4胞外多糖 结构以a-(1-3)连接的甘露糖为主链。 1.1.5酸性低聚糖 2、银耳多糖的提取及制备 银耳中含有丰富的银耳多糖，主要采用热水浸提、碱浸提法、酶法提取、辅以超声波或微波处理，对多糖进行提取；然后经Sevage法除蛋白、双氧水或活性炭脱色、乙醇沉析分离，再经透析法、超滤法或层析法纯化，最后经干燥、粉碎，得多糖成品。因含有胞壁多糖，破细胞壁技术就成为提高提取多糖得率的主要因素。 2.1银耳多糖常用的提取方法 2.1.1热水浸提法 最常用的方法，用水来作为溶剂。 优点：简单易操作。
实验一银耳多糖的制备及分析 实验名 称 实验一银耳多糖的制备及分析 实验班 级09级药学本 科1班 09级药学本 科2班 实验课 时间 11.19 11.20 实验目的： 1. 学习真菌多糖类的分离、纯化原理。 2. 掌握多糖类物质的一般鉴定方法。 实验原理： 银耳（Tremella fuciformis）是我国一种传统的珍贵的真菌，具有滋补强壮、扶正固本之功效。银耳中含有的多糖类物质则具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。 多糖（polysaccharides）的纯化方法很多，但必须根据目的物质的性质及条件选择合适的纯化方法。而且往往用一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。1、乙醇沉淀法：乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的浓度以1%----2%为佳。加完酒精，搅拌数小时，以保证多糖完全沉淀。沉淀物可用无水乙醇、丙酮、乙醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状产品。 2、分级沉淀法：不同多糖在不同浓度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的黏多糖。 3、季铵盐络合法：黏多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等能形成季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以解离，溶解，释放。 本实验采用固体法培养获得的银耳子实体，经沸水抽提、氯仿—正丁醇法除蛋白质和乙醇沉淀分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB
（溴化十六烷基三甲铵）络合法进一步精制可得银耳多糖精品，然后进行定性分析。 实验内容与方法： 1、提取 将20g银耳实体和800ml水加入1000ml烧杯中，于沸水浴中加热搅拌8h，离心去残渣（3000r/min,25min）。上清液用硅藻土助滤，水洗，合并滤液后于80摄氏度水浴搅拌浓缩至糖浆状。然后加入1/4体积的氯仿—正丁醇溶液，摇匀，离心（3000r/min,10min）分层，再用分液漏斗分出下层氯仿和中层变性蛋白，然后重复去蛋白质操作2次。上清液用2moL/L氢氧化钠调至PH7.0，加热回流，用1%活性炭脱色，抽滤，上清液于80摄氏度水浴浓缩至原体积的1/3.然后加入3倍体积的95%乙醇，离心（3000r/min,15min），沉淀用无水乙醇洗涤2次，乙醚洗涤一次，真空干燥得银耳多糖粗品 2、纯化 取粗品1g，溶于100ml水中，溶解后离心（3000r/min,10min）除去不溶物，上清液加入2%CTAB溶液至沉淀完全，摇匀，静置4h，离心（3000r/min,10min）,沉淀用热水洗涤3次，加100ml 2mol/L 的氯化钠溶液于60摄氏度解离4h, 离心（3000r/min,10min），上清液扎袋流水透析12h，透析液于80摄氏度水浴浓缩，加3倍量95%乙醇，搅拌均匀后，离心（3000r/min,10min），沉淀再分别用无水乙醇，乙醚洗涤，真空干燥，得精品银耳多糖。 3、理化性质分析 将银耳多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中，观察其溶解性。另外在浓硫酸存在的条件下观察银耳多糖与a—萘酚的作用，于界面出观察颜色变化。 4、含量测定 多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生成醣醛类衍生物，与蒽酮作用形成有色化合物，进行比色测定。 请同学们（1）熟悉本次实验内容； （2）在网上查阅测定多糖含量有几种方法； （3）详细写出蒽酮-浓硫酸测定银耳多糖的实验步骤
１.多糖得提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类、多糖得提取首先要根据多糖得存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理、动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚得混合液进行回流脱脂,释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高得根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性得有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖得提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。 １.１溶剂法 １.1.1水提醇沉法 水提醇沉法就是提取多糖最常用得一种方法。多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择 水、醇等极性强得溶剂。用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到７０％左右,利用多糖不溶于乙醇得性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置5h,多糖得质量分数与得率均较高。影响多糖提取率得因素有:水得用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取得提取方法。但由于水得极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性得成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续得分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。 １、1.2酸提法 为了提高多糖得提取率,在水提醇沉法得基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团得多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋得存在抑制了酸性杂质得溶出,稀酸提取法提取得到得多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键得断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用、因此酸提法也存在一定得不足之处。 1.1、３碱提法 多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖得浸出,可提高多糖得收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓得碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品得风味与色泽、 1、1、4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术就是近年来发展起来得一种新得提取分离技术、超临界流 体就是指物质处于临界温度与临界压力以上时得状态,这种流体兼有液体与气体得特点,密度大,粘稠度小,有极高得溶解,渗透到提取材料得基质中,发挥非常有效得萃取功能。而且这种溶解能力随着压力得升高而增大,提取结束后,再通过减压将其释放出来,具有保持有效成分得活性与无溶剂残留等优点、由于CＯ2得超临界条件(ＴC=3０4.６℃,Tp＝7.3８MPa)容易达到,常用于超临界萃取得溶剂,在压力为8~40MＰa 时得超临界ＣO2足以溶解任何非极性、中极性化合物,在加入改性剂后则可溶解极性化物、 该法得缺点就是设备复杂,运行成本高,提取范围有限、 1、2酶解法 １.2.1单一酶解法 单一酶解法指得就是使用一种酶来提取多糖,从而提高提取率得生物技术。其中经常使