湖南大学
硕士学位论文
高灵敏度荧光免疫分析方法研究
姓名：吴争鸣
申请学位级别：硕士
专业：分析化学
指导教师：吴朝阳
20080701
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
福州大学专题报告姓名/学号：王佳婕/10112010517 学院：物理与信息工程学院 专业：通信与信息系统 导师：洪蛤畔副教授 研究方向：生物医学信息的检测与处理
荧光免疫分析定量检测技术 免疫分析(immunoassay , IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种分析技术。根据标记技术手段的不同，免疫分析主要分为放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析等[1]。 1941年，Cons等用荧光素和抗体的结合来定位组织中的抗原，提出了荧光免疫分析法（Fluorescence Immunoassay，FIA）的概念[2]。荧光免疫分析法常用试剂是荧光素，荧光素一直是分析领域中常用的有机荧光分子标记物。在特定波长的激发光作用下，某些有机荧光分子很容易被激发至饱和状态并发出荧光，而这些荧光分子还能在很短的时间内进行多次的重复激发和测量。荧光免疫分析法就是根据荧光分子的这种特性进行定量分析的。 一、荧光免疫分析 荧光免疫分析的方法有很多,常见的有以下几种：荧光偏振免疫分析、荧光猝灭免疫分析、荧光增强免疫分析。 荧光免疫分析在国内外被广泛地应用在临床检测中，如内分泌疾病检测（甲状腺、糖尿病及生长素类的检测）、传染病检测（肝炎、艾滋病等）、妇产科疾病检测（HCG、FSH、Testosterone等）、肿瘤标志物检测（AFP、PSA、CA系列）、遗传科疾病检测（产前筛查、新生儿筛查及基因杂交检测等）、血液及细胞学检测（贫血、白血病及细胞试验与分析等）[3]。免疫组织化学、微阵列、多标记物的免疫分析等新应用也不断地涌现出来[4]。 荧光免疫分析技术的基本原理是将抗原抗体反应的高度特异性 与荧光的可测量性结合起来，以荧光物质作为示踪剂标记抗体（或抗原）制成特异性试剂，可用于检测特定的抗原抗体浓度，以便进一步进行病理学或免疫组织化学的免疫分析[4]。 相对于定性检测和半定量检测，定量检测在临床应用中更具有实际意义。它可以直接读出待测物质的浓度，为临床诊断提高可靠依据，可应用于疾病的早期诊断。 二、荧光免疫定量检测 1.荧光检测机理 某些物质经紫外光的照射，吸收了一定波长的入射光（紫外光）后，即可发射出较入射光波长稍长的光，这种光称为荧光。由于物质的分子结构不同，所能吸收紫外光的波长及发射荧光的波长也有所不同，利用这个特性可以对待测物质进行有针对性的检测。在一定条件
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
全自动荧光免疫分析仪 工作原理 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
一、基本结构 （一）按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流动式(FLOW SYSTEM)、分立式(DISCRETE SYSTEM)两大类。 1．流动式指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这是第一代自动生化分析仪。 2．分立式指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成。其中有几类分支。 (1)典型分立式自动生化分析仪。此型仪器应用最广。 (2)离心式自动生化分析仪，每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合，反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。 3．袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定。 4．固相试剂自定生化分析仪(亦称干化学式自动分析仪) 是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。 (二)典型分立式自动生化分析仪基本结构 1．样品(SAMPLE)系统 样品包括校准品、质控品和病人样品。系统一般由样品装载、输送和分配等装置组成。 样品装载和输送装置常见的类型有： (1)样品盘(SAMPLE DISK)，即放置样品的转盘有单圈或内外多圈，单独安置或与试剂转盘或反应转盘相套合，运行中与样品分配臂配合转动。有的采用更换式样品盘，分工作和待命区，其中放置多个弧形样品架(SECTOR)作转载台，仪器在测定中自动放置更换，均对样品盘上放置的样品杯或试管的高度、直径和深度有一定要求，有的需专用样品杯，有的可直接用采血试管。样品盘的装载数，以及校准品、质控品、常规样品和急诊样品的装载数，一般都是固定的。这些应根据工作需要选择。 (2)传动带式或轨道式进样即试管架(RACK)不连续，常为10个一架，靠步进马达驱动传送带，将试管架依次前移，再单架逐管横移至固定位置，由样品分配臂采样。
免疫分析法 1,熟悉免疫分析法的基础知识 ,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法 第一:概述 基本原理 基本条件 方法分类 免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法. 1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA). 酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等. 一,基本原理 (一)竞争抑制原理 实质都是抗原一抗体竞争结合反应 Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原 Ab:特异抗体 Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物 K:平衡常数(K=K1/K2). 抗原-抗体反应须满足以下条件: Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质; 所加入Ag*和Ab的量应是固定的; Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点; Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中. 这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础 (二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线) 用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率. B代表结合的标记抗原; F代表游离的标记抗原; T代表总的标记抗原. B/F-[Ag] B/(B+F)×100%-[Ag] (三)抗原一抗体反应的特点 1.特异性 一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应. 抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型. 抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力. 交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合. 2.可逆性
全自动POCT荧光免疫定量分析仪 基础医学与临床医学的飞速发展，对医学检验提出了新的要求和挑战。近年来，医院诊疗的患者数量日益增加，检验人员尤其是大医院检验科和门诊操作压力和工作强度大。标志着“全实验室自动化与一体化”流水线工作站的兴起，在一定程度上解决传统医学检验操作繁琐、样本周转周期长，人为干扰因素不确定等问题，作为IVD行业新兴的细分领域，POCT设备的出现，让所有的检验师们看到了严峻挑战下的新希望！作为国内领先的体外诊断品牌—基蛋生物科技股份有限公司始终致力于我国POCT行业发展。 如何将自动一体化大型设备与快速简便化小型仪器进行有机的结合？在充分调研和听取广大客户的用户体验下，加上十余年的POCT市场运作经验，基蛋生物越发感受到来自全国市场对于全自动POCT仪器需求的呐喊。经过数载精心的设计与研发，结合市场的不断反馈与改进，作为POCT行业发展的新标杆——全自动POCT仪器Getein1600完美问世！ 更便捷：全自动，可自动完成质控、吸样、稀释、混匀、测量、计算、打印报告全过程，程序自动升级，支持LIS、HIS系统互联。 高通量：同一样本可同时检测三种不同的检测项目，可同时检测48个样本，样本量检测可达150个/小时，平均检测时间不超过30秒/样本。 更精简：最低仅需10ul样本量即可完成检测，支持全血、血清、血浆、尿液样本检测。 更功能：具备样本随机插入功能，可随时进行急诊样本检测。 更美观：10.1寸液晶触摸显示屏设计，操作更方便，结构及软件模块化，便于升级维护。 更丰富： 心肌标志物类项目：心肌肌钙蛋白I（cTnI）、N-端脑利钠肽前体（NT-proBNP）、心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）N-端脑利钠肽前体/心肌肌钙蛋白I二合一（NT-proBNP/cTnI）、肌酸激酶同工酶/心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白三合一（CK-MB/cTnI/Myo）、肌酸激酶同工酶/心肌肌钙蛋白I/心型脂肪酸结合蛋白三合一（CK-MB/cTnI/H-FABP）、D-二聚体（D-Dimer）等； 炎症标志物类项目：降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白（U-CRP）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原/C反应蛋白二合一（PCT/CRP）；
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程 一、产前筛查定义及其原理 产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β- ）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE 3 抑制素A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。 二、唐氏综合征的产前筛查 唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。 1.以孕妇年龄作为筛查指标 最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。一般认为35岁以上
荧光免疫分析仪的核心板解决方案 生活水平的提升，人们越发关注自身健康问题，家庭医疗设备也得到广泛关注。而过往的荧光免疫分析仪，因体积较大，检查结果输出缓慢等问题难以走进家门，如何突破这项技术，改善医疗体系呢？本文将详细介绍改进荧光免疫分析仪的解决方案。 荧光免疫分析仪简介 荧光免疫分析仪用于医院体外检测，主要对人体的血清/血浆/全血/尿液样本进行检测，辅助诊断人的心肌损伤，心力衰竭，急性冠状动脉综合征，心血管炎症，静脉血栓栓塞，常规炎症，细菌/病毒感染的鉴别，急慢性肾病等疾病的早期发现及治疗。 荧光免疫分析仪的发展 1、检验医学发展趋势： ●自动化； ●简便化； ●准确化； 2、减少患者的看病时间，降低患者的经济压力 快速的病情检查是影响康复时间的重要因素，及时准确的检验结果是提高诊断治疗质量的保障，针对每一个病人具体情况的个体化诊断是临床合理用药的前提，而以荧光免疫分析仪为代表的POCT(快速检测）设备则完全可能是实现这些目标的有效途径。 3、目前医院的全自动荧光免疫分析仪依旧占据医院主导，而手持式荧光免疫仪慢慢将占据市场主流，逐步走进生活。 图1检测分析实验室 荧光免疫的原理 荧光免疫分析仪的工作原理是以镧系元素作为荧光标记物，利用这类物质有长荧光寿命的特点，延长荧光时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得的信号完全为长寿命镧合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰，利用增强液的作用使荧光信号增强使铕离子很容易解离出来生成铕合物，采用脉冲光源，照射物品后即短暂熄灭，
以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长寿命荧光；由于物质的分子结构不同，其吸收的紫外线波长以及发射荧光的波长有所不同，顾可以利用这一特性对待测物进行测定。 图2荧光免疫分析仪 荧光免疫的架构以及应用领域 1、全自动荧光免疫分析仪硬件基本架构： 图3全自动荧光免疫分析仪硬件框图 2、荧光免疫分析仪现在作为POCT（快速检测）仪器已经被广大医院和家庭所认可；同时荧光免疫分析仪凭借其快速检测的性能，在其它诸多领域也都在使用比如：IVD、食品安全快速检测、环境快速检测、动植物疾病诊断等行业都对荧光免疫分析仪有所需求。 荧光免疫分析仪解决方案 针对荧光免疫分析仪ZLG致远电子也推出了Cortex-A7/ Cortex-A8两款不同性能的解决方案： 1)小体积核心板可以用在不同种类的荧光免疫分析仪中，预留丰富的扩展接口，同时 为了方便客户开发，致远电子提供周到的技术支持以及详细的技术开发资料；
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。 （一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。
1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为例，其荧
、基本结构 (一)按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流动式(FLOW SYSTEM、) 分立式(DISCRETE SYSTE两大类。 1．流动式指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这是第一代自动生化分析仪。 2．分立式指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成。其中有几类分支。 (1) 典型分立式自动生化分析仪。此型仪器应用最广。 (2) 离心式自动生化分析仪，每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合，反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。 3．袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定。 4．固相试剂自定生化分析仪(亦称干化学式自动分析仪) 是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。 ( 二) 典型分立式自动生化分析仪基本结构 1样品(SAMPLE系统 样品包括校准品、质控品和病人样品。系统一般由样品装载、输送和分配等装置组成。 样品装载和输送装置常见的类型有： (1) 样品盘(SAMPLE)ISK),即放置样品的转盘有单圈或内外多圈，单独安置或与试剂转盘或反应转盘相套合，运行中与样品分配臂配合转动。有的采用更换式样品盘，分工作和待命区，其中放置多个弧形样品架(SECTOF作转载台，仪器在测定中自动放置更换，均对样品盘上放置的样品杯或试管的高度、直径和深度有一定要求，有的需专用样品杯，有的可直接用采血试管。样品盘的装载数，以及校准品、质控品、常规样品和急诊样品的装载数，一般都是固定的。这些应根据工作需要选择。 (2) 传动带式或轨道式进样即试管架(RACK不连续，常为10个一架，靠步进马达驱动传送带，将试管架依次前移，再单架逐管横移至固定位置，由样品分配臂采样。 (3) 链式进样试管固定排列在循环的传动链条上，水平移动到采样位置，有的仪器随后可清洗试管。 分配加样装置大都由注射器、步进马达或传动泵、加样臂和样品探针等组成，① 注射器
一、前言 近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。 二、时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。 正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。 采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。 三、时间分辨荧光分析的测量方法 （1）解离增强测量法 解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+
一、基本结构 （一）按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流动式(FLOW SYSTEM)、分立式(DISCRETE SYSTEM)两大类。 1．流动式指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成。这是第一代自动生化分析仪。 2．分立式指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成。其中有几类分支。 (1)典型分立式自动生化分析仪。此型仪器应用最广。 (2)离心式自动生化分析仪，每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合，反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。 3．袋式自动生化分析仪是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定。 4．固相试剂自定生化分析仪(亦称干化学式自动分析仪) 是将试剂固相于胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品滴加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。 (二)典型分立式自动生化分析仪基本结构 1．样品(SAMPLE)系统 样品包括校准品、质控品和病人样品。系统一般由样品装载、输送和分配等装置组成。 样品装载和输送装置常见的类型有： (1)样品盘(SAMPLE DISK)，即放置样品的转盘有单圈或内外多圈，单独安置或与试剂转盘或反应转盘相套合，运行中与样品分配臂配合转动。有的采用更换式样品盘，分工作和待命区，其中放置多个弧形样品架(SECTOR)作转载台，仪器在测定中自动放置更换，均对样品盘上放置的样品杯或试管的高度、直径和深度有一定要求，有的需专用样品杯，有的可直接用采血试管。样品盘的装载数，以及校准品、质控品、常规样品和急诊样品的装载数，一般都是固定的。这些应根据工作需要选择。 (2)传动带式或轨道式进样即试管架(RACK)不连续，常为10个一架，靠步进马达驱动传送带，将试管架依次前移，再单架逐管横移至固定位置，由样品分配臂采样。
时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项
第一节时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。 下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作. 1、样本的采取和保存 TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。 样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行 实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去
离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。 板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。 TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 3、加样 在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。 加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！ 加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。 加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。 注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！ 使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。 4、孵育 在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。 目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的
时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用 武学成1,2(综述),何 林1,周克元2(审校) (1.深圳人民医院检验医学部,广东深圳518001;2.广东医学院,广东湛江524001) 中图分类号:R44616 文献标识码:A 文章编号:100622084(2006)0720434203 摘要:标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变。20世纪80年代出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为最有发展前途的非放射免疫标记技术。本文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用。 关键词:时间分辨荧光免疫分析技术;铕;标记技术 The R esearch and C linical Application of Time2resolved F luoroimmunoassay WU Xue2cheng1,2,HE Lin1, ZHOU K e2yuan2.(1.The Medical Laboratory Department o f Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen518001,China; 2.Guangdong Medical College,Zhanjiang524001,China) Abstract:The marked immunoassay technique gives the changes from macroanalysis to microanalysis.T ime2 res olved fluoroimmunoassay technology is a non2radio2immunity labeling technique having m ost perspective future because of its unique advantage since1980s.This article reviewed s ome aspects about it including fundamental principle,basic reagent,basic technique and the its clinical application in recent years. K ey w ords:T ime2res olved fluoroimmunoassay;Europium;Labeling technique 随着生物标记技术的不断进步,免疫分析技术得到了长 足的发展。免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射 免疫技术转变。在此期间,涌现了一大批非放射免疫技术,例 如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫 分析技术(time2res olved fluoreimmuoassay,TRFI A)等。但是从灵 敏度来说只有时间分辨荧光免疫分析技术可与放射免疫媲 美。TRFI A是20世纪80年代迅速发展起来的的一种公认的 最有发展前途的非放射免疫标记技术。 1 时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理 TRFI A是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、 激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液 (有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生 物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀 伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的 荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系 中分析物的浓度,达到定量分析的目的。 2 时间分辨荧光分析技术简介 TRFI A的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、 分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、 反应模式。 2.1 基础试剂 2.1.1 示踪剂的选择和使用 所使用的稀土元素主要位于 元素周期表中的ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium,Y) 和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium,Eu)、铽(terbium, Tb)、钐(samarium,Sm)、钕(neodymium,Nd)、镝(dysprosium,Dy) 等5种被用作TRFI A示踪剂,尤以Eu3+常用。一般用Eu2O3 制备成EuCl 3 ,再经纯化和常温真空抽干,然后干燥保存。用 Eu3+等镧系元素作为示踪剂有以下特点:①荧光物质激发光 谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的 差,称为S tokes位移。普通荧光物质荧光光谱的S tokes位移 只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干 扰严重。游离铕的荧光信号虽然相当微弱,但当Eu3+与螯合剂形成螯合物时,产生分子内和分子间能量传递,使Eu3+的荧光强度显著增强,S tokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰;②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间(decay time)长,为传统荧光的103～106倍。稀土离子及一些常见荧光物质的荧光寿命(见表1)。镧系元素的荧光不仅强度高,而 且半衰期也很长,介于10～1000μs之间。这样,用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光,即通过时间分辨,极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFI A高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素2生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰[1];③镧系螯合物激发光光谱较宽,最大激发波长在300～500nm,可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带很窄,甚至不到10nm,可采用只允许发射荧光通过的滤光片,进一步降低本底荧光;④Eu3+等镧系标记物与放射性同位素相比不受半衰期的影响。如125I标记试剂最长可用3个月,酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题,使其应用受到限制。Eu3+与双功能螯合剂螯合,可形成稳定的螯合物,稳定性很高,2年内能保证质量。再者,Eu3+标记物体积很小(为原子标记),标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小),又可实现多位点标记[2]。标记物稳定就可以对标记物进行多次激发,通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法,可大大减少偶然误差,提高准确度。同时多位点标记技术,不仅使检测更灵敏,也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。 2.1.2 稀有元素双功能螯合剂 稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸)连接。目前常用镧系元素标记的双功能螯合剂有异硫氰酸2苯基2二乙胺四乙酸(IC B2E DT A)、β2萘甲酰三氟丙酮(β2NT A)、二乙基三胺五乙酸环酐(DTPAA)、4,72二氯磺基苯21,102菲罗啉22,9二羧酸(BCPDA)及对2异硫氰酸2苄基2二乙三胺四乙酸(P2IC B2DTT A)等5种。Y uan等[3]合成出一种稳定的能发出强烈荧光的Eu3+络合剂4,4′2二(1,1′,2,2′,
酶联荧光免疫分析仪（MINI VITDS) 一、操作步骤： 开机预热20-30分钟（夏天）出现运行、仓位状态、批号菜单等对话框。 1、放入试剂条和SPR管（内有抗体，一人一份，管和条相对应，最多可做12人份） 2、加入200ul样本血清在试剂第一孔中。 3、总仓位状态出现A、B空闲，加入样本血清放入A仓就点A，放入B仓就点B。 4、有①、②、③、④、⑤、⑥个仓位选出现。 5、点①出现样本编号如58号输入58号，如果有编号②按回车 键出现A2→对应试管编号输入编号，A3、A4、A5、A6以此类推。 6、按返回上级菜单→再按返回→开始→大约30-50分钟出单。 二、所用东西： 用蒸馏水，这个实验的本质量抗原抗体反应。试剂条有抗原，SPR 管有抗体（1人1份），将条子和管子对应放入A仓或B仓。 1孔放血清，5孔酶联抗体（有酶联抗体，有砱酸酶）6、7、8孔洗脱液，10孔4-甲基砱酸伞形酮水解后变成4-甲基伞形酮。 开机预热夏天30分钟，冬天40分钟。 空闲能用点仓位状态→显示温度→仓位温度36.5-37.5℃ ？代表查看错误信息键 化验单子用热敏纸，宽度为110mm。
三、机器的维护： 化验试剂每换一次批号要扫一次MLE卡，换项目也要扫MLE卡。 扫卡方法： 在A仓或B仓放入MLE卡→批号菜单→读取MLE→点A仓或B仓→批号信息。 ①每隔14天做一次定标（S）质控（C） S（定标）做两个、C（质控）做一个标本量为200ul ②或每换批号要扫一次MLE卡必须做一次定标质控 如批号(STR)130814-0才会打出来s（定标）c(质控） 定标质控粉剂不溶解可长期保存，一旦溶解必须在-20℃冰箱里反复冻不解超过四次。 溶解后如不能放入冷冻，在冷藏室里只能保存两天。 把枪头插入移液器，在质控加入3ml蒸馏水，定标物加入2ml蒸馏水，枪打到500ul定标，质控物溶解5-10分钟，对应A仓放入3管3条，2个S,1个C。 仓位状态如A仓，选1→检测→选择检测→选TSH→S1→回车 →S→回车→C1→返回仓位A TSHS1 TSHS2 TSHC1 枪头调为200ul每个条子加200ul（试剂S第一孔第二条子S加200ul试剂，C第二条子第一孔→开始 仓位灯亮开始化验 甲状腺激素正常范围0.25-5uIU/ml 甲亢<0.15uIU/ml 甲减>75uIU/ml