一、固相萃取基本原理与操作
1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理
固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1)疏水作用力:如C18、C8、Silica、苯基柱等
2)离子交换作用:SAX, SCX,COOH、NH2等
3)物理吸附:Florsil、Alumina等
2、p H值对固相萃取的影响
pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲,因为吸附剂本身是完全离子化的状态,目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲,其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化,而对于弱酸性化合物,其pH 值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲,必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附,而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。
3、固相萃取操作步骤及注意事项
针对填料保留机理的不同(填料保留目标化合物或保留杂质),操作稍有不同。
1)填料保留目标化合物
固相萃取操作一般有四步(见图1):
?活化---- 除去小柱的杂质并创造一定的溶剂环境。(注意整个过程不要使小柱干涸)
?上样---- 将样品用一定的溶剂溶解,转移入柱并使组分保留在柱上。(注意流速不要过快,以1ml/min为宜,最大不超过5ml/m in)
?淋洗---- 最大程度除去干扰物。(建议此过程结束后把小柱完全抽干)
?洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。(注意流速不要过快,以1ml/min为宜)
如下图1:
2)填料保留杂质
固相萃取操作一般有三步(见图2):
?活化--除去柱子的杂质并创造一定的溶剂环境。(注意整个过
程不要使小柱干涸)
?上样--将样品转移入柱,此时大部分目标化合物会随样品基液流出,杂质被保留在柱上,故此步骤要开始收集(注意流速不要过快)
?洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集,合并收集液。(注意流速不要过快)
此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。
如下图2:
二、固相萃取方法的建立与优化
固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单,但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素,归纳起来可通过下图来了解:方法建立如下图片1.jpg:
方法建立如下图片2.jpg:
1、初步固相萃取方法的建立
建立初步的萃取方法要考虑:
·选择合适的SPE柱
·选择合适的固相萃取方法
·方法的优化
2、固相萃取柱的选择<
1)柱填料的选择
首选根据目标化合物与干扰物的差异,如极性,分子量,pka值等,选择合适的填料。
固相萃取柱的选择如下图片.jpg:
2)固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说,被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%(参考值,同一种SPE柱对不同的目标物选择性不同,吸附容量不同);
离子交换型的固相萃取柱,必须考虑离子交换的容量。不同厂家的小柱离子交换容量稍有差异。下表附SPE小柱的容量和洗脱参数
SPE柱上样容量和洗脱体积的选择
规格最大上样量最小洗脱体积100mg/1mL5mg250μL
200mg/3mL10mg500μL
500mg/6mL25mg 1.2mL
1g/6mL50mg 2.4mL
3、选择合适的固相萃取方法
固相萃取的保留机制可分为两种:
·吸附剂(填料)保留目标化合物:绝大多数化合物应用此机制,填料保留其目标组分及少量杂质,通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质,最后选择合适的(洗脱)溶剂把目标组分洗脱下来。
根据吸附剂的保留机理可进一步分为:
(1)反相(C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1)
·分析物:非极性至中等极性
·基质:水溶性
·方法:
a.活化:通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化,然后用水平衡
b.淋洗:含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质
c.洗脱:极性或非极性溶剂洗脱目标物(2)正相(Silica, Florisil,Diol,NH2)·分析物:中等极性到强极性
·基质:非极性至中等极性
·方法:
a.活化:非极性有机溶剂
b.洗脱:非极性有机溶剂
如下图片:
(3)阳离子交换(SCX,PRS,COOH)
u 分析物:阳离子(碱性)化合物
u 方法:
1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂过柱后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样:样品溶液pH值要小于其pKa两个单位(以保证其带电荷)
3.洗脱:洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位(中和分析物的电荷)
(4)阴离子交换(SAX,PSA,NH2,PAX/MAX )
u 分析物:阴离子(酸性)化合物
u 方法:
1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂活化后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
2.上样:样品溶液pH值要大于其pKa两个单位(以保证其带电荷)。
3.洗脱:洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位(中和分析物的电荷)。
u 吸附剂(填料)保留杂质:
食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分,所以上样后即开始收集目标组分,最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。
(1)活化:以样品所在的有机溶剂进化活化,1-2柱管体积
(2)上样:提取液转移至柱,并收集流出液
(3)洗脱:用样品所在的有机溶剂进一步洗脱,收集流出液。合并上样和洗脱流出液。4、固相萃取方法的优化
1)影响萃取效率的因素
(1)填料(固定相)----- 核心
选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。
(2)洗脱溶剂的强度:
?采用正相固定相时,溶剂强度随其极性增强而增加;
?采用反相固定相时,溶剂强度随极性减弱而增强。
(3)pH值:
离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小,可以使固定相带电荷,被分析物带相反电荷,而使干扰物质不带电荷;或者反过来,使固定相带电荷,干扰物质带相反电荷,而使被分析物不带电荷。
(4)操作:控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等2)常见问题及解决方法
·分析物回收率低
·萃取重现性差
·洗脱馏分中含有干扰物
·SPE柱流速降低或阻塞
具体解决方案如下:
A. 分析物回收率低
?未保留?
?被淋洗?
?未被洗脱或部分洗脱?
首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集,进样分析,确定问题来源回收率差如下图片:
重现性差如下图片:
相关图片如下:
相关图片如下:
举例说明
1. 参考文献方法用C18柱做相关药物的净化,过柱方法如下:分别用乙酸乙酯、甲醇和水活化小柱,然后把处理过的样品过柱(溶剂为具一定pH值得缓冲溶液),水淋洗小柱后,用乙酸乙酯洗脱目标物。
结果:接受液混浊状,回收率和重现性都不理想,可能是什么原因呢?
答案:正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二,其一因为淋洗溶剂(水)与洗脱溶剂(乙酸乙酯)不互溶,如果不抽干洗脱溶剂与目标物不能充分作用,所以造成回收率和重现性都没有保证,同时从外观上看接受液是液混浊液;其二如果淋洗过程不抽干小柱,洗脱溶剂里会引入水(淋洗剂),对下一步浓缩造成很大的困难。
相关图片如下:
2、水中的灭草松前处理方法
取500ml水样过滤,待过Cleanert PEP柱(相当于Waters HLB)净化
1)用5mL四氢呋喃洗柱子,除掉杂质
2)用5mL甲醇1mL/min活化柱子
3)用5mL纯水1mL/min活化柱
4) 500mL的水样以5mL/min的速度过柱
5) 5mL纯水2mL/min淋洗
6)小柱真空抽干20min
7) 0.9mL的甲醇1mL/min淋洗,弃去淋洗液
8) 3mL四氢呋喃1mL/min的速度洗脱柱子,收集洗脱液浓缩定容至3mL液相检测。
结果:回收率不理想,请问此方法有何问题?
答案:因为目标物灭草松呈酸性,pKa=3.3,而选择的小柱PEP是极性的。所以正确的做法是样品在过柱之前一定要调节水样的pH值小于等于3,使目标物分子化,以保证目标物能被小柱充分保留,否则在上柱的过程中容易造成“漏”的现象,从而造成回收率差。
三、固相技术应用实例解析
1、食品领域应用
1)动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测(Cleanert PCX, P/N: CX15 06)
1.实验材料
1.1 固相萃取小柱:PCX(150mg/6mL)
1.2 四种β-激动剂药物:盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物。
2. 试样的制备
取猪肝空白样品,经过液液萃取初步处理后,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。
3. 净化
依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱,将上述备用液过柱,依次用水5mL、甲醇5mL淋洗,真空抽干,用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱,收集洗脱液于具塞玻璃试管中,50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL /min左右。
4. 衍生化及检测
将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50℃烘箱中加热片刻,除去水分后,加入甲苯100mL 和双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)100mL,涡旋振荡20s,密封玻璃塞,置于80℃恒温烘箱中加热1小时,冷却后加入300mL甲苯,作为试样溶液,供气相色谱-质谱分析(色谱柱:DA-5MS, 30m×0.25mm×0.25μm,P/N:1525-3002)。
5. 结果
5.1 回收率实验(精密度和准确度)
将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后,分别添加一定量的标准溶液,配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五个浓度的试样溶液,每批次同一浓度做5次平行实验,共4个批次(样品典型回收率色谱图见附图)。
猪肝中实验结果列表如下
添加浓度(μg/L)回收浓度
(μg/L)
平均回收值
(μg/L)
平均回收率
(%)
相对标准偏差
(%)
1 0.75
0.72 72.40 5.93 0.67
0.72
0.70
0.78
2 1.62
1.63 81.30 1.23 1.66
1.60