基因工程制药
(一) 概述
(二) 基因工程药物生产的基本过程
(三) 目的基因的获得
(四) 基因表达
(五) 基因工程菌的稳定性
(六) 基因工程菌生长代谢的特点
(七) 基因工程菌发酵
(八) 基因工程药物的分离纯化
(九) 基因工程药物的质量控制
(十) 基因工程药物制造实例
表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导
剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。 表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因
等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌
株。
组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达
直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。
诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达
在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。
分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。
可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
(五)基因工程菌的稳定性
传代过程中常出现质粒不稳定的现象
分裂不稳定:工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象（常见）。
结构不稳定:外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
一、质粒不稳定产生的原因
1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率
2.这两种菌的生长比速率差异的大小
对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：
含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性
含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配
受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性宿主的选择
外源基因整合到宿主染色体上
培养基
生长速率
发酵工艺限制性基质
温度
pH 和溶氧
外源基因表达
无抗性平板质粒稳定性的分析方法
稀释
涂布培养10-12 h
随机挑选100个菌落
10-12 h 稳定性(ST, stability )
二、提高质粒稳定性的方法
两阶段培养法:
第一阶段先使菌体生长至一定密度
第二阶段诱导外源基因的表达
减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别 选择性压力：如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长
环境参数调控（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度）
改进载体受体系统
将R1 质粒上的parB基因引入表达型载体中表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞
正确设置载体上的多克隆位点
禁止DNA 片段插在稳定区内
将受体细胞的致死性基因安装在载体上
同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA 单链结合蛋白编码基因）
施加选择压力
根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素
加入大量的抗生素会使生产成本增加
添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力
载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高
优化基因工程菌的培养工艺
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长
速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过
改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定
培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(六)基因工程菌生长代谢的特点
菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子—核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。
控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义。
对菌体生长的调控主要有两种观点：
一种认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率
另一种认为是小分子前体和催化组分等的限制决定了菌体的最大比生长速率
一、菌体生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌
体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产
生代谢副产物乙酸。导致培养基的pH值下降，
从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙
酸的抑制作用。
分批培养中选择不同的碳源，补料培养中控制补料速度、
连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体
生长速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。
第二章基因工程工具酶 一、解释下列名词 1、Restriｃtiｏn and ｍｏdificａｔion（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质(DNA）得现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主得限制作用称为修饰。 ２、 Matched enｄｓ（or cohesive ｅnｄ）（匹配末端或粘性末端)识别位点为回文对称结构得序列，经限制酶切割后,产生得相同得，互补得末端称为匹配粘端，亦即粘性末端 ３、 Blｕｎt ｅndｓ平末端。在回文对称轴上同时切割DNＡ得两条链，产生得没有碱基突出得末端称为平末端。 4、Ｓtar ａctiｖiｔy星星活性。在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似得序列，这个改变得特殊性称星星活性。 5、 KlｅnoｗfrａｇｍeｎｔＫｌenow 片段。KlｅnoｗDNA聚合酶就是E、col ｉＤNA polymｅrase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去5’——3’ 外切活性得多肽大片段,而聚合活性与3＇-—5' 外切活性不受影响. 6、Rｅveｒse trａnsｃriｐtasｅ反转录酶。即依赖于RNA 得ＤNA 聚合酶，它有５’--3＇合成DNA 活性,但就是无3’——５＇外切活性。 7、Ｔermiｎａｌｔransferaｓe（末端转移酶) 8、Ligase连接酶。催化DＮA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来得酶。 9、T４polyｎuｃｌeｏtide kinase（T4多聚核苷酸激酶)催化AＴP得γ-磷酸基转移至ＤＮＡ或ＲNA 得5' 末端。 1０、Alkalｉne phosphatａse（碱性磷酸酶）催化除去ＤNＡ或RNA ５' 磷酸11、S1 ｎｕcleａse Sｌ核酸酶.可降解单链DNA 或RNA ，产生带5＇磷酸得单核苷酸或寡核苷酸双链;对dsＤＮA,dｓＲNA ，DNＡ：ＲNA杂交体不敏感。 二、填空题 １、限制性内切核酸酶（Ｒestriction eｎｄonucleａse)得命名就是按属名与种名相结合得原则得，通常第一个大写字母取自（属名得第一个字母 ),第二、三个字母取自（种名得前两个字母）,第四个字母则用(菌株名）表示。 ２、Ⅱ型限制酶识别回文对称序列,在回文序列(内部)或（附近）切割DNA,产生带3'－OH 与5’-P基团得ＤNＡ得产物，需（Mg2+)得存在才能发挥活性,相应得修饰酶只需SＡM。 3、识别相同序列得限制酶称（同裂酶） 4、ＤNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端,能发生载体自连，影响载体与外源DＮA得连接效率,常用得防止载体自连得方法有(去磷酸化)、(部分补平)。 5、完全得回文序列应具备两个特点即(能够在中间划一个对称轴，两侧得序列两两对称互补配对)与（两条互补链得5'-—3’ 得序列组成相同，即将一条链旋转１80°，则两条链重
基因工程制药技术研究进展 信息检索课程（综述）中文摘要 以DNA重组技术为核心的现代生物技术是一个正在不断发展的高技术综合体系，也是国际上优先发展的高技术领域之一。自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。DNA重组技术不仅直接提供干扰素、红细胞生成素（EPO）等基因工程药物，供临床治疗使用，提高对恶性肿肿瘤、心脑血管病、重要传染病和遗传病的防治水平，而且也广泛应用丁改造已有的抗生素和生物制品等传统医药工业。基因工程药物已形成一个巨大的高新技术产业 关键词基因工程，药物，研究，发展
信息检索课程（综述）外文摘要 Title Genetic engineering pharmaceutical technology Research progres Abstract With recombinant DNA technology as the core of modern biological technology is a continuous development of high technology integrated system, is also the international priority development of one of the high technology fields. Since the 1970 s genetic engineering since birth, the first application of genetic engineering and now the most active field of research is medical science. Recombinant DNA technology not only directly provide interferon, erythropoietin (EPO), and other genetic engineering drugs for clinical use, improve the malignant swollen tumor, cardio-cerebrovascular disease, important infectious disease and genetic disease prevention level, but also widely used in reconstruction of the existing antibiotics and biological products, and other traditional Chinese medicine industry. Genetic engineering drugs has formed a huge new and higl technology industries. Keywords Genetic engineering, medicine, research, development
名词解释 1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、 构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5’端相同。是PCR的起始点。 6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制 序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中进行繁殖的工具。 8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经 进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而 形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过 这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为 单克隆抗体。 15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和 重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16.改形抗体改性抗体（reshaped antibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 （V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的 宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimeric antibody）。 18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区 的整体空间构象。 19.单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链 可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲
名词解释 1. 基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2. 基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、构建重 组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3. 逆转录逆转录(reverse transcription )是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4. CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5. 引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5'端相同。是PCR的起始点。 6. 表达载体所谓表达载体(expression vector)是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能 使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7. 克隆载体克隆载体(cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术，送进受 体细胞中进行繁殖的工具。 8. 载体载体(vector)，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9. 报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿 主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10. 启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11. PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12. 包涵体包涵体(inclusion body)是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体 结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13. 蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系 实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14. 单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗 体。 15. 基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和重新装配， 然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16. 改形抗体改性抗体(reshaped antibody,RAb )是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 (V)中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17. 嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中 表达，这种抗体叫做嵌合抗体( chimeric antibody )。 18. 镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区的整体 空间构象。 19. 单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv),是由抗体重链可变区和轻链可变区 通过15?20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲 和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
基因工程课程习题选择题 001 基因工程操作的三大基本元件是【Ａ】 I 供体II 受体III 载体IV 抗体V 配体 ＡI + II + III ＢI + III + IV ＣII + III + IV ＤII + IV + V ＥIII + IV + V 002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】 I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV Ｅ I + II + III + IV 003 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】 Ａ基因诱变 Ｂ分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ遗传工程 Ｅ基因无性繁殖 004 基因工程的单元操作顺序是【B】 Ａ增，转，检，切，接 Ｂ切，接，转，增，检 Ｃ接，转，增，检，切 Ｄ检，切，接，增，转 Ｅ切，接，增，转，检 005 下列有关基因的叙述，错误的是【A】 Ａ蛋白质是基因表达的唯一产物 Ｂ基因是 DNA 链上具有编码功能的片段 Ｃ基因也可以是 RNA Ｄ基因突变不一定导致其表达产物改变结构 Ｅ基因具有方向性 006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【D】 Ａ修复自身的遗传缺陷
Ｂ促进自身的基因重组 Ｃ强化自身的核酸代谢 Ｄ提高自身的防御能力 Ｅ补充自身的核苷酸消耗 007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是【D】 ＡBacillus amyloliquefaciens ＢEscherichia coli ＣHaemophilus influenzae ＤProvidencia stuartii ＥStreptomyces lividans 008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【D】 Ａ 2' -OH 和 5' -P Ｂ 2' -OH 和 3' -P Ｃ 3' -OH 和 2' -P Ｄ 3' -OH 和 5' -P Ｅ 5' -OH 和 3' -P 009若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接与载体拼接的是【D】 M N Ａ A/AGCTT T/TCGAA Ｂ C/CATGG ACATG/T Ｃ CCC/GGG G/GGCCC Ｄ G/GATCC A/GATCT Ｅ GAGCT/C G/AGCTC 010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是【B】 Ａ质粒是共价环状的双链 DNA 分子 Ｂ天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列 Ｃ质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制 Ｄ松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增 Ｅ质粒并非其宿主细胞生长所必需 011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】 Ａ穿梭质粒 Ｂ表达质粒 Ｃ探针质粒 Ｄ整合质粒 Ｅ多拷贝质粒
第三节基因工程制药生产的基本过程 工具酶的分离纯化 载体的分离纯化 外源DN A 和目的基因的分离和获得 夕卜源DNA 与载体DNA 的切割与连接 宿主细胞的选择和基因导入操作 基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 基因工程菌中试 基因工程菌的扩増和发酵生产 基因工程药物的分离和纯化技术 变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控 制 十二、基因工程药物的制 造实例 五、 六 、 七 、 八
六.基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 （_）基因工程菌质粒的不稳定性 （二）质粒稳定性的分析方法 （三）质粒不稳定的原因（四）提高质粒稳定性的方法（五）基因工程菌的生长速率（六）蛋白质产量/菌体 数量比 （七）能量供应与菌体生长的关系 （八）小分子前体.催化剂供应与菌体生长的关系
■因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的w. 现象,有分裂不稳定和结构不稳定。由于质粒不稳定导致的质粒丢失菌与含有质粒的菌之间生产速率不一致导致可能的生长优势,进而能在培养基中逐渐取代含质粒菌成为优势菌群,从而减少基因表达的产率,导致基因工程菌在生产过程中出现不稳定现象。 (二)质粒稳定性的分析方法
(1)将工程菌堵养液样品适当稀释,均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基,培养10-12h ,统计所长出的菌落数A ； (2 )然后随机挑选100个菌落,接种到含有抗生素标记的平板堵养基,壇养10?12h , 统计所长出的菌落数B ； (3 )计算B/A的比值。该比值能反映质粒的稳定性?称为稳定性(stability.ST)
不稳定的原因 指基因工程菌在分裂的子代菌体中,出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关: (1)工程窗产生幺失质粒的概率,拷贝量低的工 程细菌,它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。 (2 )丢失质粒的细菌.含有质粒的工程菌之间的 竞争力大小。 2、结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失.或者发生 碱基重排.缺失现象,最终导致工程菌性能改变的现象。
基因工程制药
(一) 概述 (二) 基因工程药物生产的基本过程 (三) 目的基因的获得 (四) 基因表达 (五) 基因工程菌的稳定性 (六) 基因工程菌生长代谢的特点 (七) 基因工程菌发酵 (八) 基因工程药物的分离纯化 (九) 基因工程药物的质量控制 (十) 基因工程药物制造实例
表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导 剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。 表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因 等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌 株。
组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达 直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。 诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达 在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
第二章基因工程制药 教学目的： 了解基因工程技术在医药工业中的应用； 熟悉基因工程制药中常用的工具酶、克隆载体； 掌握基因工程药物无性繁殖系的构建过程。 教学重点： 基因工程药物无性繁殖系的构建 计划学时：4 第一节基因工程制药概述 DNA技术，是基因分子水平上的遗传工程，是70年代初期在分子遗传学基础上发展起来的一个崭新领域，是一门能人工定向改造生物遗传性状的育种新技术。 一、基因工程技术在医药工业中的应用 （1）基因工程药物品种的开发 利用基因工程细菌等表达人类—些重要基因片段，可产生具生理活性的肽类和蛋白质类药物，降低生产成本。 如应用传统的技术方法提取1mg生长激素抑制素(Somatostatin)需要用十万只羊的下丘脑，所要耗费的资金大约等于经由人造卫星从月球上搬回1kg石头。而用基因工程方法生产这一激素只需10L大肠杆菌培养液，其价格大约为每毫克0.3美元。 （2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型 应用基因重组技术将各种酶、受体模型筛选所需的靶酶的活性中心或受体的配体、亚基等在微生物中大量表达，有利于采用机器人进行大量筛选。 （3）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物。 （4）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用 用带关键酶基因的质粒转换菌种，增加菌种中的关键酶基因剂量和转录水平；抑制菌种其它非必要基因的表达，提高相应产量的同时使提取、精制、半合成等后处理工序变得更方便；将血红蛋白基因克隆进菌种后提高对缺氧环境的耐受力，减少供氧这一限制因素的影响并节约能量。 （5）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。 （6）基因工程抗体在医药工业中的应用 它通过原核生物细胞或昆虫细胞表达抗体的小分子有效部位进行大规模廉价生产，可用作导向药物的载体。 二、应用基因工程和蛋白质工程技术开发的新型药物简介 1．人胰岛素（Insulin) 胰岛素用于临床糖尿病的医治已有近70年的历史，长期以来，其来源仅仅是从动物的胰脏中提取，而动物胰岛素与人胰岛素在氨基酸组成上存有一定的差异，长期注射人体会产生自身免疫反应，影响治疗效果。自80年代初开始用基因工程技术大量生产人胰岛素了。 国外人胰岛素的基因工程生产一般采用两种方式：一是分别在大肠杆菌中合成A链和B链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。美国Eli Lilly公司采用该法生产的重组人胰岛素Humulin 最早获准商品化；另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，如丹麦Novo Nordisk工业公司用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。 我国，1993年，北京大学报道了以部分牛凝乳酶原B基因与人胰岛素原基因进行融合，高表达出融合蛋白，经加工后可得到具有天然活性的人胰岛素原纯品。 2 人生长激素（Human growth hormone, hGH） 主要用途是治疗侏儒症，临床试验认为对慢性肾功能衰竭和Turner综合症也有很好疗效。 3 干扰素(Interferon，IFN)
基因工程药物研发的基本过程 基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原 的一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,具有抑 制皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑 制因子[1 , 2 ] ,对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消 化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景. PCR产物的T载体克隆 （一）重组T质粒的构建 一．原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双
生物制药技术在制药工艺中的应用戎镭 发表时间：2019-07-18T09:20:42.590Z 来源：《科技尚品》2019年第2期作者：戎镭 [导读] 随着科学技术的不断进步，生物制药技术也日新月异，在制药领域获得了更为广泛的应用。就目前的现状而言，生物制药技术不断实现技术创新，为生物制药行业的发展提供了持续动力，同时还进一步优化了制药工艺的实践。在此基础上，本文将对生物制药技术在制药工艺中的应用进行探讨，为推进制药工艺发展提供更好的建议。 河北维安职业健康评价有限公司 中图分类号：TQ464 文献标识码：A 引言 生物制药技术离不开微生物。微生物主要包括细菌、真菌和病毒等用肉眼难以观察的微小生物，它们种类丰富、繁殖速度快，并且在生长过程中能产生次级代谢产物，这一特点被广泛应用。工业微生物技术主要包括微生物制药技术。近年来，利用微生物转化，使得药物研制取得了诸多突破性的进展，给医药工业创造了巨大的价值。微生物制药菌种的特点是纯种，即只能有一种菌种，且此菌种的性能要好，才能用于微生物制药产业当中。 1生物制药领域的发展状况 随着生命科学相关技术的发展，生物制药领域于二十世纪八十年代开始兴起，在过去的几十年中交叉融合其它学科的理论知识和尖端技术，不断挑战最新前沿科技，赶超天然产物分离提取药物的方式和化学合成药物的手段而成为研发新药方面的强有力助手。生物制药领域的核心技术主要包括：基因工程制药技术、细胞工程制药技术和生化工程制药技术。这三大前沿技术的开拓和推广极大地推动了药物研发的进程，凭借其特异性强、毒副作用小等独特的优势在生物制药领域发挥着至关重要的作用。基因工程是指在基因水平对生物进行人为改造的技术，通过体外对生物ＤＮＡ进行裁剪而得到目的基因片段，再将目的片段连接到载体上，之后将载体植入宿主细胞或细菌中进行表达。目前，基因工程制药技术已经在制备胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等方面广泛应用，并取得了良好的临床疗效。细胞工程是在细胞水平上应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人类的意愿进行遗传操作和组织培养的技术，具有节约时间的优势，同时利用细胞核移植技术开发的乳腺生物反应器生产蛋白质类药物大大降低了药物生产成本。此外，利用细胞融合技术在体外将骨髓瘤细胞和免疫细胞进行杂交融合制备的单克隆抗体同样具有重要的药用价值，因此生物制药技术已经成为医药生物高新技术产业的重要组成部分。生化工程一般是利用分离、提纯的方法获得蛋白质、氨基酸、多肽、多糖及其衍生物等制药产物的技术。首先通过生化工程制药技术合成先导化合物分子，然后在此基础上通过结构修饰改造获得最优药物分子的途径也是研发新药的一种重要策略，现在临床应用的多肽类药物和结构类修饰药物多是采用生化工程制药技术开发而来的。 2生物制药技术在生物工艺中的应用 近年来，利用微生物转化，使得药物研制取得了诸多突破性的进展，给医药工业创造了巨大的价值。并在制药工艺当中获得了普遍的应用。 2.1肿瘤疾病的治疗应用 现代生活中肿瘤疾病对人类造成了极大的困扰，严重影响人们的身体健康，危及人的生命甚至一度出现谈癌色变的社会现象。而生物制药技术的兴起，进一步优化了对肿瘤疾病的预防和治疗作用，为人们的健康生活保驾护航。在肿瘤疾病方面，利用生物制药技术的高科技基因技术，让制造出来的药物能够与肿瘤因子进行对抗，能进一步控制病情恶化、防止肿瘤进一步扩散。例如，生物制药技术通过利用基质金属蛋白酶，控制肿瘤血管的生长转移速度，能够有效控制患者病情。 2.2生物制药技术在神经疾病治疗方面的应用 神经系统疾病是目前发病率比较高的一种疾病，其中包括脑中风、老年痴呆以及帕金森等类型的疾玻而针对这些疾病的生物制药技术研究已经取得了一定的成就，利用Cerestal药物可以有效恢复脑中风患者的脑力，进而缓解患者病情。 2.3生物制药技术在疾病免疫防御药物研制方面的突破 部分人因为自身免疫能力差，对病毒的抵抗能力较弱，容易引发一些疾玻基于这样的状况，生物制药技术针对部分病毒的预防药物进行研制，并且已经取得一定成效。例如，TNF-a抗体就是一种疾病预防药物，它的主要作用是治疗风湿性关节炎。另外，针对冠心病疾病的治疗，生物制药也研制出单克隆抗体药物，由此来提升人们的身体免疫力。生物制药技术在蛋白质药物以及重组多肽类药物中的应用。通过利用生物制药技术将不同生物体的DNA进行基因的重组，然后再利用基因重组来实现不同生物之间基因的融合，这样就可以在分子水平基础上进行一些疾病的治疗。 3生物制药领域的发展前景 3.1多学科交叉融合更加发展 学科的交叉点便是科学新的生长点，近些年来，科研人员逐渐意识到仅凭单一学科的知识和技术很难满足重大科研突破的需求，尤其像生物制药这样集生命科学、化学、医学、药学等学科交叉融合为背景的领域。并且这些年来重大的科学突破往往都是通过多学科之间相互配合、在学科交叉的界面取得的。因此科研领域提出将学科交叉融合作为新的科学前沿进行大力发展。而拥有多学科交叉背景的生物制药领域无疑是这一科学前沿的典型代表，并且多学科交叉融合为生物制药领域提供了各学科现代高新技术的支持，推动了生物制药领域的蓬勃发展。 3.2现代高新技术更加进步 如今随着生命科学及相关技术的发展进步，科研人员针对过往的化学药物无法在完全正确的位置生效而导致毒副作用明显的问题开发了全新的"生物导弹"药物。导弹，顾名思义是集精准、威力与一体的，而运用现代高新技术在生物制药领域开发新药的特点之一便表现为靶向性。脂质体是一个很好的例子，它的结构类似于细胞膜，因此它便拥有良好的脂溶性，这一特点为它运输药物提供了极大的方便，被包裹在其中的药物也因此会降低对身体的毒性。而靶向性则是将抗体或信息分子植入脂质体的膜上，使其具备特异性结合的能力来体现的。这种通过高新技术开发的生物药物在用于抗肿瘤方面有很强很好的效果。如阿霉素是一种抗肿瘤药物，但它的毒副作用同样不可小觑，不仅抑制骨髓功能、而且还具有心脏毒性，被列入了２Ａ类致癌物清单之中。但近年来科研人员开发的脂质体阿霉素，其表面包裹了高分子
自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得 到飞速的发展，基因工程药物就成为各国政府和企业投资研究开发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。目前，世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点，展开了激烈的市场竞争。到1999年底为止，全球至少已有近 3000家生物工程公司在从事生物药品与基因产品研究与开发。据不完全统计，在欧美诸国，已经上市的基因工程药品接近一百种，大约还有超过300种以上的药物处于临床试验阶段，约2000种在研究开发中，形成了一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 基因工程制药技术的发展，掀起了对传统制药行业的巨大的冲击波。基因工程制药技术的快速发展，基因工程药物广阔的应用范围和更小的副作用使得研发机构和制药企业跃跃欲试；基因工程制药本身为高科技技术，涉足其中的上市公司在股市上的良好表现吸引了投资者的关注。基因工程制药行业成为制药行业和投资方面关注的焦点，适时推出，本报告分为五个部分：基因工程制药发展简介、中国基因工程制药行业现状、中国基因工程制药市场状况、中国基因工程制药行业发展趋势和附录。 基因工程制药发展简介部分介绍了基因工程制药的概念、世界基因工程制药史上的重大事件和研究进展方面。同时还介绍了世界上几个主要国家（美国、欧洲、加拿大、日本和中国）的基因工程制药发展现状和趋势，包括生物公司情况、研发投入情况和生物技术制药公司运营特点，以及生物技术药品的销售情况和在医药市场中逐步扩大的市场份额趋势。由于美国在世界生物制药和基因工程制药方面处于领先地位，本部分重点介绍了美国基因工程制药行业的状况。 中国基因工程制药行业现状部分介绍了中国基因工程制药行业的发展的初创阶段、大发展阶段和后基因时代三个阶段；中国基因工程药物的研究成果和批准上市情况；由于基因工程制药行业属于高科技行业，且无论国内还是国外股市上，生物制药尤其是涉及基因工程制药的公司表现良好，所以本报告专门介绍了中国国内投资基因制药行业的上市公司，包括这些上市公司的分类，在基因工程制药方面的投入情况，并对其中表现突出的三家公司的经营管理能力、盈利能力和成长性进行了比较分析；同时，本部分还对我国基因工程制药行业存在的主要问题，如研发能力和投入相对不足，同中产品生产厂家过多以及缺乏产业化机制等问题进行了分析。 中国基因工程制药市场状况部分对中国基因工程制药的市场现状和发展进行分析：先从消费者需求和基因工程药物广泛的应用范围上阐明了我国基因工程制药的存在的市场基础；介绍了中国基因工程制药市场销售情况和日趋激烈的竞争情况；中国目前基因工程药物多以仿制为主，中国国内的相关产品的研究和开发由于缺乏资金的支持而进展缓慢，而入世又迫在眉睫，入世后，知识产权方面的纷争、进口
基因工程与生物药物 ：华龙 班级：生物制药1301 学号：1302150003
摘要 自1972 年DNA重组技术诞生以来,生命科学进入了一个崭新的发展时期。以基因工程为核心的现代生物技术已应用到农业、医药、轻工、化工、环境等各个领域。它与微电子技术、新材料和新能源技术一起,并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱, 而利用基因工程技术开发新型生物药物更是当前最活跃和发展迅猛的领域[ 1]。从1982年美国 Lilly 公司首先将重组人胰岛素投放市场,标志着世界第一个基因工程药物的诞生。基因工程制药作为一个新兴行业得到各国政府的大力支持, 各国都积极研究和开发各种基因工程药物,并取得了丰硕成果。本文通过对基因工程药物的开发、应用和研究方法等研究进展进行综述。 Abstract Since 1972, DNA recombinant technology was born, life science has entered a new period of development.Gene engineering as the core of modern biotechnology has been applied to agriculture, medicine, light industry, chemical industry, environment and other fields . It and microelectronic technology, new materials and new energy technologies together, tied for the four future beneficial to the people's livelihood the big pillar of science and technology, and using genetic engineering technology to develop new biological drugs is the most active and rapidly developing field. From the United States in 1982 Lilly's first recombinant human insulin on the market, marking the birth of the world's first gene engineering medicine. Genetic engineering pharmaceutical as an emerging industry has received great support from governments the countries are actively research and development of various genetic engineering drugs, and achieved fruitful results. In this paper, through the development of gene engineering medicine, research and Application Research progress is reviewed in this paper. 关键词 基因工程、生物药物、研究进展、应用 Genetic engineering、 biological medicine、 research progress,、application