细菌学诊断技术
随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。
一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测
快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa 等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。
Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。
二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术
在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。
1．抗血清凝集技术
早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。
2．乳胶凝集实验
将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7
3．荧光抗体检测技术
用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750份食品样品的检测，结果表明与常规培养法符合率基本一致。
4．协同凝集试验（COA）
业已证实，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段的活性。近年来国内外学者采用抗体致敏的SPA 检测细菌即协同凝集试验。如Rahman等用协同凝集试验鉴定霍乱弧菌O1群的初代分离物做快速筛选，比常规法节省时间，对204份材料用两种方法比较表明协同凝集试验具有较高的特异性和敏感性。
5．酶联免疫测试技术
酶联免疫技术的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验。
应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。
三、分子生物学技术在检测食源性病原微生物中的应用
随着分子微生物生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于食源性病原菌的检测。
1．核酸探针
将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。
2．核酸探针的类型
根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部
DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli.选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。
3．核酸探针的应用：
（1）．用于检测无法培养，不能用作生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素。
（2）．用于检测同食源性感染有关的病毒病，如检测肝炎病毒，流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。
（3）．检测细菌内抗药基因。
（4）．分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。
（5）．细菌分型，包括rRNA分型。
4、核酸探针的特点:
4.1.探针的特异性:
探针检测技术的最大优点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。
以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的是基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，它们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。
检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA序列。
另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火
速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏能力强，所以用比提取制备蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。
核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格的条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。
探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增强反应特异性。
4．2．探针的敏感性
研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10-8摩尔特异DNA片段，相当于0。5pg,1000个碱基对的靶系列，相当于1000---10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng 的水平。
延长培养时间，增强信号强度能提高探针的敏感性。
非放射性物标记探针在高浓度情况下，由于抑制了非特异性吸附，比放射性物标记探针背景干扰小。
制备食品样品时，因机械均浆而导致菌体破裂，产生较高的背景干扰会影响检测敏感性。
在探针上加生物素化的核苷酸长尾能使检测敏感性提高10倍。
细胞中rRNA比DNA多，检测rRNA的探针比DNA敏感。通过扩增DNA含量也能提高检测敏感性。
4．3．探针检测技术中存在的问题
检测一种菌就需要制备一种探针，目前尚未建立所有致病菌的探针，尽管检测速度快，但要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养，任何一种方法不可能有100%的特异性和敏感性，所以必须考虑假阳性和假阴性的问题。
DNA探针还不能完全取得常规检验提供的细菌特性的信息，如在菌株生物型鉴定、血清型和抗药基因上有不足之处。
检测食品时，样品中待检菌量低杂质成分复杂，样品DNA纯度不够高等都会限制探针检测的敏感性。
探针检测是分析基因序列，对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测，因为尽管探针能检测活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能检测其表达产物，所以在评价食品安全卫生上存在一定的局限性。
5．核酸探针杂交技术原理
根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂交反应和液相杂交反应。固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应，如常见的印迹法和菌落杂交法。事先破碎细胞使之释放DNA/RNA然后把裂解获得的DNA/RNA固定在硝基纤维素薄膜上，再加标记探针杂交，依颜色变化确定结果，该法是最原始的探针杂交法容易产生非特异性背景干扰。
液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快5�10倍。缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入反应体系中的干扰剂。
分离杂交DNA探针的方法有两种，一种用羟磷灰石，它仅能与双股DNA结合，单股DNA在和羟磷灰石结合前必须先同一个探针或互补单链杂交成双股DNA才可。当溶液中DNA通过羟磷灰石柱子时，只有双股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脱下来，最后用激活的标记物检测。另一种分离方法运用磁球技术把探针与小磁球连接，再用多核苷酸尾部连接第二探针，不用离心就能分离DNA 与未杂交DNA。短寡核苷酸能和磁球连接，也能从磁球上洗脱，在以mRNA系统进行靶循环的检测过程中，该方法能将背景干扰降低2---3个数量级，从而达到较高的敏感性。
5．1．夹心杂交法（Sandwish hybridization）
它由三种不同作用的核酸成分组成：（1）：与固相支持物连接的捕获探针；（2）产生信号的检测探针；（3）靶核酸序列。靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能于上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答。
5．2．核酸置换杂交分析法（Strand displacement assay）
它是在夹心杂交法的基础上改进的一种方法。先奖捕获探针连接在固相物上，然后在此探针上以微弱的结合方式杂交一个短小能产生信号的核酸，如果靶DNA能与捕获探针杂交可通过竞争置换出带信号的核苷酸片段，在检测过程中产生信号的单股核酸可转化为ATP，再加入荧光素酶，用生物发光分析法检测。其优点在于背景干扰小，敏感性强。缺点为不是所有捕获探针都能应用这种方法杂交，且信号探针会不断地从捕获探针上脱落。
5．3．浸染棒法（Dipstick assay）
它是夹心杂交法最新的一种改进方法。它用两种探针，其中一个进行标记，另一个是单核苷酸长链，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹与多聚腺苷酸长链探针能互补配对的碱基成分，即多聚胸腺嘧啶，尽管杂交反应在溶液中完成，但浸染棒是完成最后检测的固相支持物。它比薄膜法能更有效地减少背景干扰，提高检测
效率。亦已用于沙门氏菌和李氏菌的检测。对荧光素标记探针可用辣根过氧化物酶标记荧光素抗体，通过比色法检测复合物浓度。
6.聚合酶技术（PCR）的原理及其发展
6．1．PCR技术原理
为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年Millus和Cetus发明了最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法·聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA，成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20�40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引入Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。如用同位素标记两种基因（Lac Z和Lam B）的，探针做PCR反应检测水源中E.Coli，检测量达到1�5个细菌/100ml。为快速准确的检测食品中污染的病原微生物带来一线曙光。
当然PCR也存在缺点，主要是系统容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增。特别是1990年Bottger发现某些Taq聚合酶被外源性DNA物质污染。另外试验中需要一定的特殊设备和熟练的操作技术，尚不能全自动化，需要花劳力制备待检样品。
6．2．Qβ复制酶法
Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ复酶系统扩增法。这种命名是根据反应过程中起扩增作用的酶来确定的。通过探针与靶DNA相结合，系统以酶学方法促进扩增。该探针是含有一个模板区域的RNA探针，其三级结构称作MDV1。系统含有RNA指导的RNA聚合酶、Qβ和复制酶。扩增MDV-1的速度很快。每循环一次需15-20秒，共循环15-30分钟。千分之一含量的RNA可扩增到125-200ng，一亿倍扩增。由于大量合成RNA，用简单的比色法就能检测杂交反应。反应呈动力学特征，建立标准曲线，确定初始结合物浓度，就可做定量分析。缺点是酶易受污染，导致敏感性下降，背景干扰限制了方法的实际应用。
6.3．连续扩增反应法（Lar）
Lar是在PCR基础上的又一种改进，同PCR不同之处在于它不扩增单个核苷酸形成DNA分子，而是用一种称作T4DNA连接酶把两个寡核苷酸彼此相连。通过连接酶的作用，两者能相互交联，在这种情况下，同PCR反应一样，连结的寡核苷酸沿原始系列排列，并成为下次循环的模板。循环20-30次可把原始靶DNA
含量增加100万倍。但它需对整个靶DNA序列事先有明确了解，否则一个碱基错配就会导致寡核苷酸相互连结的失败。
6.4．转录放大系统（TAS/3SR/NASBA TM）
1989年Kwoh等介绍了一种新技术，转录扩增系统（TAS），它是包括DNA 合成和RNA转录的双重循环过程。它以变性DNA和一般RNA为引物的寡核苷酸靶序列，这个寡核苷酸上包含多聚酶结合部和与靶序列互补配对的片段。杂交时，引物与靶序列结合，反转录酶延伸引物与靶序列互相配对，热变性后，另外一个寡核苷酸退火成新股DNA。再加入反转录酶产生与新股DNA互补的双股DNA。并延伸原始的已退火的引物至另外一个靶序列上。加入RNA聚合酶，可以扩增RNA 的拷贝数（10-1000）。因此方法仅需4次循环就能得到RNA分子1,000,000个拷贝数。
1990年Gualelli修正了TAS法，设计了一种称作自我片段复制扩增系统（3SR）。3SR与TAS不同之处在于，3SR是等温反应（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初变性这一步，3SR方法还是需要扩增DNA，RNaseH用于降解在TAS反应中形成的RNA-DNA杂合物，并转化成双股DNA。在双股DNA的每一末端都含有一个聚合酶结合部，双股DNA继续循环并作为合成RNA的模板，再次参加反应过程。15分钟就能放大100，000个拷贝。而PCR法即使有100%扩增效果也需要85分钟才能取得同样结果。
与PCR相比它不用热循环，因此不必调节反应温度，所有反应在一个反应管中完成。另外3SR能区分DNA和RNA，同其它扩增反应一样，3SR易受外源核酸的污染。由于反应所需的酶多，并且与其它方法相比，反应严格性低，所以特异性较差。
1989年Cangene发明了核酸片段扩增法（NASBM TM），此法已获得欧洲专利。据报导它能将100个分子的DNA扩增到100ug。
6.5．放大信号检测法
放大信号同时能改善DNA探针的敏感性。有些学者研究处用腺嘌呤酯标志
DNA的生物化学检测方法，反应初始时需加入H
2O
2
，酯结构的破坏会产生光，光
亮强度与存在的靶DNA含量成比例关系，也有人用一种称作磷酸苯二氧化物做生物发光剂，有报导称，此物质在碱性磷酸酶作用下转化为发光物质，用比色法检测它比OPD和HRP敏感10倍以上。1989年Mclaprae介绍了用化学显影学致敏剂作为标记物，加热后，能释放出光，用固相薄膜检测能增加敏感性，生物化学发光法在DNA探针检测上效果很好。
最近推崇非同位素的标记物是酶标抗体。标记抗体能与共价结合的DNA探针标记物相结合。如在探针尿嘧啶残基上标记荧光素，再用高度亲和力的辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体检测原始探针。胞嘧啶磺化物或在鸟嘌呤上引入2-乙酰氨基荧光素及其衍生物也能替代荧光素和酶连结抗体。
另一种途径是把非活性的S-肽从核糖核酸酶上连结到DNA探针上，杂交后，加入S-蛋白，可重新构建功能酶。再循环酶放大系统中检测活化的核糖核酸酶。
现又研究出一种新方法，它是把探针切成两半，每半标记两种不同的能相互联结的荧光物质或酶系统成分中的一种。当两种探针杂交相互靠近时，激活能量状态的荧光物质转移到邻近的荧光物质或酶系统受体上，而激活受体产生信号。反应过程不用进行分离，因为若没有发生杂交反应，两种成分不能相互靠近，不会产生检测信号。
7.分子生物学技术在食源性病原菌检测上的应用：
7.1.沙门氏菌
食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需四天，阳性报告还要延迟2-3天。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有2000多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有1个细菌/25克样品，所以需要增菌培养。
AOAC最近认可了Gene-Tark沙门氏菌比色分析法。这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（FITC），再用辣根过氧化酶标记抗FITC的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上杂交，对239株沙门氏菌的特异性检出率为100%，假阳性率为0.8%（BAM/AOAC培养法假阳性率是2.2%。）
7.2李斯特杆菌
1981年首次确定它是一种食源性病原菌，1985年加尼福利亚发生爆发性流行，现用检测方法大多采用冷增菌，费时费力。
FDA于1987年最新研制出针对李斯特菌致病基因β�溶血素的探针，随后GENE-TARK研制出商品化检测李斯特菌的DNA探针，它能特异性识别细菌的16SrRNA。该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品需先在LEB中培养16�22h，然后侵染比色检测，假阴性率为0.8�4.7%（常规法为
1.4�
2.9%。）
1989年Bessesea等运用扩增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法检测单核细胞增生型李斯特菌，DNA检测量低于25ng，即少于1000个菌体，特异性强，能检测出50株不同的单核李斯特菌，而不与12株非单核李斯特菌和12种非李斯特菌属的细菌发生反应。
7.3.弧菌
关于用DNA探针检测溶血性弧菌中溶血基因的报导很多。国外对DNA探针和单克隆抗体法在检测鞭毛抗原方面作了比较，结果发现DNA探针法阳性检出率高。近年来用PCR扩增DNA片段，再做探针检测，能检出新鲜龙虾仁中的弧菌，检测敏感性为10个细菌/克，但要用凝胶电泳进一步鉴定。因此，不太合适检测
食品。1989年Olive构建了一个热稳定溶血素基因的寡核苷酸DNA探针检测付溶血弧菌。
7.4.志贺氏菌
目前志贺氏菌检测方法存在着质粒容易丢失和受内源菌干扰的问题。用核酸探针检测可克服上述缺陷。现采用人工合成32P标记的寡核苷酸探针在固定薄膜上做菌落杂交检测志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（EIEC），也有人用PCR扩增技术检测志贺氏菌和（EIEC）。PCR扩增前需将福氏痢疾菌扩增培养到10000个/ml，增菌后检测需6�7小时才能得到结果。敏感性为≤1个细菌/克。但PCR扩增后需做凝胶电泳进一步鉴定，对常规检测来讲太繁琐。
7.5．耶尔森氏菌
Hill等研制出针对同耶尔森氏菌侵袭性质粒有关的DNA探针。用菌落杂交法对人工污染食品所做试验敏感性明显地受内源菌的影响。近年来，有人人工合成了一个24bp的寡核苷酸探针。它是针对侵袭性质粒DNA中一部分的探针，用它检测各种食品中耶尔森氏菌，发现，尽管无法区分无毒菌株且检测限量不理想，但能检测出10000－100000个细菌/克样品。样品中内源性细菌对试验方法没干扰。1989年Feng.P等研制针对由染色体编码的耶尔森氏菌侵袭性基因的DNA探针。
7.6.弯曲杆菌
检测弯曲杆菌的探针是用非放射性物质标记的。标记物为发光素。靶顺序为rRNA。近来用碱性磷酸酶标记人工合成的寡核苷酸检测人工污染的粪便样品，检测量为100000个菌落形成单位（CFU），敏感性和特异性达100%。
探针对空肠弯曲杆菌的最低检测量为20000至800000个活菌。由于粪便成分复杂，影响敏感性，此方法只在临床检测中应用，尚未用于食品检测。
7.7.葡萄球菌
大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素A、B、C和E。
最近，GeneTark推出检测金黄色葡萄球菌的探针，能半定量样品中的葡萄球菌，尚未得到AOAC的认可。方法采用侵染棒比色法，探针检测的基因序列是23srRNA。敏感性100%，假阳性率为9.3%，人工污染样品中没有假阳性结果发生。
7.8.假单胞菌属
亦已研制出能检测从肉品中分离到的DNA基因序列相似的假单胞菌的DNA
探针。
7.9.大肠杆菌
大肠杆菌是食品和水源污染粪便的指示菌。Gene�Tark研制出用侵染棒检测大肠杆菌中16srRNA的探针。样品需前增菌处理，以异硫氰荧光素（FITC）标记探针，再用辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体检测杂交复合物。Hsu等报导方法特异性（除相近的志贺氏菌外）达100%，假阳性率为1.2%（目前使用的BNM/AOAC法为23.4%）。
七十年代人们认识到，E.coli中某些血清型是致病菌，可作为粪便污染的指示菌。用DNA探针检测大肠杆菌肠毒素于1984年得到AOAC的认可。近来研究出用PCR法检测不耐热肠毒素的方法，它可以编码不耐热肠毒素基因序列为引物，用PCR法扩增相应的DNA片段，不扩增耐热肠毒素基因。检测量为20个E.coli/100ul。Sander等构建了一个能检测产生与志贺氏菌毒素相同毒素的大肠杆菌菌株（SLTEC）的探针。增菌后能检测牛肉和其它食品中是否存有SLTEC。1990年Feng.P等研制出大肠杆菌GUD（β�葡萄糖醛酸酶）基因的探针，GUD 是AOAC认可的MUG（4�甲基伞形酮�β�D�葡萄糖醛酸），试验中检测的酶，现用PCR法扩增GUD基因，再用DNA探针杂交。MUG试验（即MUG在GUD作用下释放出4�甲基�7�羟香豆素，它在长波紫外光照射下产生兰色荧光）存在的问题是大肠杆菌中发现有MUG阴性分离物，包括大肠杆菌O157：H7血清型的所有菌株，而DNA探针证实GUD基因存在于所有大肠杆菌，包括O157：H7和志贺氏菌菌株中。MUG阴性菌株是由于GUD活性受到分解代谢产物的抑制。Kaspar等报导GUD抗体能和3/4MUG阴性菌株的提取物反应。这表明某些菌株是能产生GUD的，但没有活性，这可能是因为底物无法进入某些菌株细胞内或产物（4�甲基�7�羟香豆素）不能释放到外界中。因此使用GUD探针检测E.coli比MUG试验准确。
7.10.病毒
每年因病毒引起的食物中毒约占2�12%，如1982年Norwalk病毒引起美国5000人患肠胃炎，此外凸隆病毒、柯萨奇病毒、萼状病毒和细小病毒也都能引起爆发性肠胃炎。很久以来人们就发现食品中存在致病性病毒，但对它们的检测方法报导甚少。
食品中病毒检测与临床病毒检测不同。因为每克粪样中约含几千万个病毒粒子，而食品中仅有一个病毒粒子就会引起疾病。尽管如此，要造成对人的危害，尚需摄入成千上万的病毒粒子。为保证人类健康，更精确评价病毒污染食品的程度，只有用DNA探针技术才能实现这一目的。
对市售食品中病毒种类尚缺乏足够的研究，大部分学者只注重对肠道病毒、脊髓灰质炎病毒的研究，其它病毒因方法问题尚未详细报导。即便食品中含有病毒，由于它们数量少，难以从样品中分离和在细胞上复制，实际上低估了食品中病毒的种类。目前的检测方法，需要把病毒沉淀，在细胞和动物上复制验证。DNA 探针技术已用于检测凸隆病毒、腺病毒和细小病毒，但还没有用在食品检测上。很难获得足够数量的病毒粒子大大限制了DNA探针技术在检测病毒上的应用。空斑杂交技术缺乏足够的敏感性，而且需事先用PCR扩增DNA片段，它只能用于检测纯培养的病毒。
FDA用合成的DNA探针检测因食用贝类食品引起肠炎患者粪样中的细小病毒，还用DNA探测环境样品中的甲肝病毒。但尚未发现用探针检测Norwalk病毒的报导。
四、病原微生物的自动化系统
近年来，随着计算机技术的不断发展，对病原微生物的鉴定技术朝着微量化、系列化、自动化的方向发展，从而开辟了微生物检测与鉴定的新领域。最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。
AMS为美国VITEK厂产品，属于自动化程度高的仪器，由7个部件组成应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质，可用于不同的用途，卡片用后可弃去。
操作时，先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。
该套系统检测卡片为14种，每一种鉴定卡片要含有25种以上的生化反应指标，基本同常规检测鉴定，检测所需时间4�8小时，最长不超过20小时。
临床细菌学检验的质量控制流程 1、质量的概念和质量保证 影响检验结果质量的因素很多,实验过程中,仪器、试剂和操作等均会引起试验结果的误差,衡量检验结果的质量常用准确度和精确度,或特异性和灵敏度。具体采用哪一种指标应根据实验的性质决定,目前临床细菌学检验的工作内容大致有3类,衡量起质量的技术指标不完全相同。 第一类是检出细菌的实验,包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代的细菌感染,混合菌较常见,一份标本中,会有2种以上细菌存在。无论标本直接涂片还是分离培养,检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量,应该用细菌检出率或细菌分离率来衡量。 第二类是鉴定细菌的实验。通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。对分离到的病原菌都做出准确的鉴定,是反映细菌事工作质量的一个重要方面。 第三类是药敏实验。有稀释法和纸片法,前者是半定量的实验,可以用准确度和精密度来衡量,后者以敏感或耐药的形
式报告,属于定性的实验,但实验过程中测量抑菌环是定量的指标。也应以准确度和精确度衡量。 所以实验室人员必须清楚认识到以上这一点,在实验室的设计和管理方面就应该主动设置误差检测系统,实验中一旦出现误差及时发出警报,查明原因及时纠正。 2、室内质量控制 2.1在职人员 2.1.1须受过细菌学检验的专门基础教育以及相关的生物交全防护知识,并以细菌检验为专业,及时终结并积累工作经验。 2.1.2作人员必须具有严谨的工作态度,技术操作须完全遵守操作规程,并直接参与质量控制工作。 2.1.3工作人员应不断加强自身的业务学习,及时了解本领域的新进展,将所掌握的新知识应用到实际工作中。 2.1.4实验室管理人员应注意利用一切机会培养技术人员,积极参加国际、国内学术会议、专业培训班,获取新信息。因为细菌学检验,投资人员培训远比投资与仪器设备更重要。 2.2操作手册及参考书
细菌学检查 非发酵菌 鼻疽假单胞菌 鼻疽假单胞菌（P.Mallei）是鼻疽病的病原菌。可从患者血液、脓液、痰中分离到。 【临床意义】 对马、骡、驴的传染性很强，犬、猫、羊等都可被感染。可通过擦伤皮肤、直接接触 和吸入本菌而感染。人类感染较少见，但经常与病畜接触的人也可患鼻疽病。实验室感染 也可发生。 产碱假单胞菌 【临床意义】 为条件致病菌，可引起脓胸、眼部感染、脓肿等 恶臭假单胞菌 恶臭假单胞菌(P.Putida)为鱼类的一种病原菌，常可从腐败的鱼类中检出，偶尔可从 尿路感染患者的尿中及血库存血中分离出来。 非发酵菌 非发酵菌（Nonfermenters）大多是条件致病菌。包括十几个菌属的数十个种别，如 假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属、莫拉氏菌属等。 由于非发酵菌有很多菌属，每个菌属又有多个种，因此对其必须先进行初步分群，即 先进行科、属的鉴别，然后再进行种间鉴别。 腐败假单胞菌 腐败假单胞菌（P.Putrefaciens）为腐物寄生菌，分布非常广泛，河水、污水、土壤、牛奶、鸡蛋等均有存在。可引起奶油、鱼、肉变质并产生H2S。 【临床意义】 本菌为条件致病菌。可引起人类中耳炎、创伤后溃疡、败血症、呼吸道感染，以及糖 尿病或体弱患者的皮肤化脓性溃疡。 假单胞菌属
假单胞菌属（Rseudomonas）分布很广，水、污水、土壤和空气中均存在。本属有几 十个菌种，临床较常见的有十种左右。代谢菌种为铜绿色假单胞菌。人类感染的非发酵菌，假单胞菌占70%～80%。主要是铜绿色假单胞菌（占55%～65%）。 类鼻疽假单胞菌 类鼻疽假单胞菌（P.Pseudomallei）可引起类疽病。 【临床意义】 为条件致病菌。人类接触污染的污水、土壤或通过直接接触（划破皮肤或擦伤）而进 入人体，也可从呼吸道、消化道进入人体而感染。但罕见人与人之间相互传染。 本菌可潜伏体内几年不发病，在多发地区这种隐性感染是很高的。败血性类鼻疽病如 不及时治疗进展迅速，且死亡率很高。 类产碱假单胞菌 类产碱假单胞菌（P.Pseudoalcaligenes）与产碱假单胞菌很相似，属于假单胞菌中 的产碱群。 【临床意义】 可引起肺炎、术后膝关节感染、脑膜炎和败血症。 嗜麦芽假单胞菌 嗜麦芽假单胞菌（P.Maltophilia）在自然界分布很广，自来水、河水、污水、牛奶 和冻鱼中均可存在，在正常人的咽喉、痰和粪便中可检出。 【临床意义】 本菌为条件致病菌，可引起大叶性肺炎、支气管肺炎、吸入性肺炎、心内膜炎、结膜炎、脑膜炎、伤口感染和败血症等。 斯氏假单胞菌 斯氏假单胞菌（P.Stutzeri）在水中及土壤中到处可见，在粪便、肥料、人类的呼吸道、泌尿道均可发现。 【临床意义】 本菌为条件致病菌。可引起呼吸道感染、中耳炎、关节炎、尿路感染及败血症。 铜绿假单胞菌
细菌学检验一、名词解释 Imvic实验 Sop 基因突变 Sos显色实验 探针 芽孢 二、选择题 【A型题】 1．证明细菌具有鞭毛结构的常用方法是：E A．革兰染色法 B．抗酸染色法 C．普通琼脂培养法 D．液体培养法 E．半固体培养法 2．革兰染色法在临床上常用于： B A．鉴别细菌的血清型别 B．协助临床选择用药 C．诊断疾病 D．解释发病机制 E．判定细菌的免疫性
3．测量细菌的常用单位是：B A．mm B．μm C．nm D．pm E． 4．不属于细菌的基本结构的是：D A．细胞壁 B．细胞膜 C．细胞浆 D．细胞器 E．核质 5．细菌细胞壁的最主要成分是： B A．脂类 B．蛋白质 C．糖类 D．脂蛋白 E．***聚糖 6．不属于细胞基本结构的是： A A．鞭毛 B．中介体 C．细胞膜 D．核糖体 E．核质
7．青霉素抗菌作用的机理是： A A．干扰菌细胞壁的合成 B．破坏菌细胞壁上的磷壁酸 C．干扰菌细胞蛋白质的合成 D．破坏菌细胞膜的通透性 E．破坏菌细胞壁的多糖骨架 8．溶菌酶的杀菌机理是：E A．干扰菌细胞壁交联桥的合成 B．干扰二氨基庚二酸的活性 C．破坏聚糖骨架上四***侧链的连接D．干扰菌细胞核质的活性 E．破坏菌壁多糖骨架β-1、4键的连接9．关于L型细菌叙述错误的是：C A．由于细胞壁缺陷常呈多形态 B．染色体不易着色 C．无致病力 D．常规细菌学检查多呈阴性 E．除去诱导因素可回复成原来的细菌10．质粒是细胞的：A A．染色体以外DNA B．核质RNA C．储存高能的胞浆颗粒 D．胞浆中rRNA E．中介体
11．关于菌毛叙述错误的是：A A．是细菌的运动器官 B．分为普通菌毛和性菌毛 C．成分是蛋白质 D．普通菌毛与细菌的致病性有关 E．普通光学显微镜下不能看见 12．细菌的革兰染色性不同主要是因为：D A．形态不同 B．营养需要不同 C．生理功能不同 D．细菌细胞壁结构不同 E．致病性不同 13．细菌学形态学检查中最常用染色方法是： E A．抗酸性染色法 B．特殊染色法 C．暗视野墨汁染色法 D．美兰单染色法 E．革兰染色法 14．细菌的繁殖形式是：D A．接合 B．裂殖 C．胞子 D．二分裂 E．复制
细菌感染的原因与诊断标准 人体全身各个器官，各系统都可发生细菌感染，引起多种疾病，常见的有细菌性感冒。那么，为什么会出现细菌感染呢？细菌感染有什么症状？一起来看看下面的回答吧。 一、出现细菌感染的原因： 细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，细菌则容易侵入体内；人体的免疫反应可分为非特异性免疫反应及特异性免疫反应两种，后者又可分为细胞免疫与体液免疫两方面。 当机体免疫功能下降时，不能充分发挥其吞噬杀灭细菌的作用，即使入侵的细菌量较少，致病力不强也能引起感染；条件致病菌所引起的医源性感染也逐渐增多。细菌因素主要与病原菌的毒力和数量有关。毒力强或数量多的致病菌进入机体，引起败血症的可能性较大。细菌侵入人体后是否引起感染，与人的防御、免疫功能，细菌的毒力及数量有关。完整的皮肤和粘膜是防止细菌侵入人体的天然屏障。 细菌感染的原因与诊断标准 二、细菌感染如何诊断？ 临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可有感染性休克和迁徙性病灶。病原微生物自伤口或体内感染病灶侵入血液引起的急性全身性感染。临床上部分患者还可出现烦躁、四肢厥冷及紫绀、脉细速、呼吸增快、血压下降等。 病毒感染：能在人体寄生繁殖，并能致病的病毒引起的传染病。主要表现有发热、头痛、全身不适等全身中毒症状及病毒寄主和侵袭组织器官导致炎症损伤而引起的局部症状。 真菌感染：真菌感染引起的疾病称为真菌病，发病率最高的念珠菌病和皮肤癣菌病由人体正常菌群的真菌引起，感染可区分为：表面感染，皮肤感染，皮下组织感染，深部感染和条件性感染。 三、细菌感染的治疗和预防： 细菌感染最好预防，而且最容易治疗，一般都有特效药，只要治疗及时一般都能治愈。预防只要注意清洁卫生即可防止感染。经常保持皮肤和粘膜的清洁和完整，避免创伤，切忌挤压，应积极治疗、控制慢性病，合理使用免疫抑制剂和抗生素类药物，烧伤病房应严格消毒等措施，均可预防发生。 一切明显的或隐匿的化脓性病灶如能及早予以清除，感染的发生就可以减少。小儿时常见的等每易继发较重的呼吸道感染，从而发生细菌感染。对这类病儿，必须加强保护。对不论多么细小的皮肤创伤必须予以重视，早作适当处理。 四、细菌性感冒和病毒性感冒有什么区别？
《细菌学检验》教学大纲 （供卫生检验专业使用） 一、课程性质、目的和任务 细菌学检验是卫生检验专业重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。通过学习，使学生掌握细菌学检验的基本技术和常见重要致病细菌及分子生物学技术。本课程通过课堂讲授、讨论、实验实习、自学等方式进行教学。要求学生掌握细菌的分离培养方法、血清学实验及分子生物学技术在细菌学检验中的应用；掌握常见重要致病细菌的生物学性状、检验方法和预防医学意义。为学生今后从事疾病预防控制、卫生监督、科学研究等方面的工作奠定必要的基础。 二、课程基本要求 本课程分为掌握、熟悉、了解三种层次要求；“掌握”的内容要求理解透彻，能在本学科和相关学科的学习工作中熟练、灵活运用其基本理论和基本技能；“熟悉”的内容要求能熟知其相关内容的概念及有关理论，并能适当应用；“了解”的内容要求对其中的概念和相关内容有所了解。 通过本课程的学习，使学生掌握细菌的分离培养方法、血清学实验及分子生物学技术在细菌学检验中的应用；掌握常见重要致病细菌的生物学性状、检验方法和预防医学意义。 考试内容中“掌握”的内容约70%，“熟悉、了解”的内容约25%，有5%左右的大纲外内容。 本大纲的配套使用教材是卫生部规划教材《细菌学检验》（张朝武主编，北京：人民卫生出版社，2006年）。 三、课程基本内容及学时分配 细菌学检验教学总时数为63学时，其中理论为27学时，实验为36学时。细菌学检验共分十七章，大体分为基本理论、基本技能和各论两个部分。第一部分从第一章到七章，主要内容为细菌学实验的基本要求、细菌学检验基本技术、细菌的分子生物学检测、细菌的分型及其检测技术、细菌的分类与命名、化学物质致突变性的微生物检测方法、消毒学试验技术；第二部分从八章到十七章，主要内容为革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性球菌、肠杆菌科、弧菌属、革兰氏阳性杆菌、与医学有关的其他细菌、螺旋体属、立克次体、衣原体和支原体等。 第一章细菌学实验的基本要求（2学时） 【掌握】 1．实验室生物安全级别； 2．实验室生物安全设备； 3．实验室内的质量控制。 【熟悉】 1．实验室生物安全管理；
微生物学检验题库及答案
《微生物学与检验》题库及答案 一.名词解释 1.医院感染 2.肥达反应 3.内基小体 4. 噬菌体： 5.血浆凝固酶 6.败血症 7.灭菌 8.药物敏感试验 9.外 - 斐氏试验 10.L 型细菌 11.菌群失调： 12.微生物 13.细菌 14.最小抑菌浓度 15.菌落 16.汹涌发酵 17.无菌操作 18.流感杆菌“卫星现象” 19.培养基 20.包涵体 21.正常菌群 22. 内毒素 23. 干扰现象： 24.菌血症 25菌丝： 二.填空题 1 L 型细菌是指（）。 2 杀灭物体上所有微生物的方法称为（）。 3 细菌 H-O 变异是指（）。 4 药敏试验所用标准培养基是，所用菌液相当于（）个细菌／ ml ，细菌接种采用（）划线接种法。 5 细菌致病因素包括（）、（）和（）。 6 细菌引起的全身感染包括（）、（）、（）和（）四种类型。 7 不染色标本检查主要用于观察细菌的（）。 8 影响革兰染色结果的关键步骤是（）。 9 有动力细菌在半固体培养基中的生长现象是穿刺接种线（），无动力细菌穿刺接种线（）。 10 糖发酵试验用于观察细菌分解糖是否产（）和（）。 11 靛基质试验的原理为，细菌产生的色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸而生成（），此代谢产物与加入的试剂反应，生成（）。 12 链球菌根据溶血现象分为（）、（）和（）三种类型。 13 葡萄球菌触酶试验结果为（）性，链球菌触酶试验结果为（）性。 14 呈现脐窝状菌落的球菌是（）。 15 抗 O 试验是测定病人血清中（）抗体效价的试验，用于风湿热等疾病的辅助诊断。 16 血平板上呈现草绿色溶血环的病原性球菌是（）和（）。 17 IMViC 试验包括（）、（）、（）和（）四项试验。 18 分解乳糖的细菌在肠道选择平板上呈现（）菌落，不分解乳糖则为（）菌落。 19 KIA 斜面红色表明，底层黄色、有气泡表明（）、（），有黑色沉淀表明（）试验阳性 20 霍乱弧菌生物型包括（）和（）。 21 AIDS 的传染源是（）和（），传播途径主要有（），（）和（）。 22 真菌菌落有（）、（）和（）三种。 23 病毒培养方法有（）、（）和（）。 24 病毒的基本结构由（）和（）组成，有些病毒还具有（）。 25 流感病毒根据抗原结构不同分（）、（）、（）三型，其中容易引起流感大流行的是其中的（）型。
结核病细菌学检验 一、目的和任务 结核病人的细菌学检查，是发现传染源的最主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。因此，结核病细菌学检查是国家结核病控制规划(NTP)的重要组成部分，在结核病防治工作中起着不可缺少的重要作用。 二、实验室的职能 为落实国家结核病控制规划中对结核病传染源监控要求，应建立各级结核病细菌学实验室，明确其职能和工作围。 各级结核病细菌学参比实验室(简称参比实验室)，应明确为各自辖区的结核病控制工作服务的宗旨。 (一)国家结核病参比实验室 在卫生部结核病控制中心领导下，国家结核病参比实验室负责全国结核病细菌学工作的规划，实施等技术管理，并向中心报告工作。 国家结核病参比实验室，应保持适当数量和结构的人员编制：专业人员15～20人，其中高级专业技术职称3名以上，中级10名，初级7名。 参比实验室的职能： 1根据国家结核病控制规划的要求，规划全国结核病细菌学工作，制定实施措施，对全国结核病细菌学监控质量进行督导和评估。国家结核病参比实验室负有指导、协调、督导各省(市、自治区)参比实验室的工作。 2建立结核病细菌学实验技术标准化准则、操作规程及规章制度。推行WHO推荐的国际通用的结核病细菌学检查技术。 3建立可行的涂片镜检、分离培养、药物敏感性试验的质量控制标准和质量控制系统。 4承担非结核分支杆菌菌种的最后鉴定，和其它非常规分析手段的实施。 5建立结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床菌株库网。制定库网的管理、交流和资源提供办法。 6开展结核病细菌学等实验诊断新技术，新方法的基础研究，及其实际应用可行性评估。 7对我国结核病控制的实施性研究，提供细菌学服务。此外，对常规结核病细菌学检查方法进行实施性研究。 8培训省(市、自治区)或地、市参比室技术人员。 (二)省(市、自治区)参比实验室 省级参比实验室，是我国结核病控制规划细菌学监测中的重要环节。在省结核病防治所(科)的领导和国家结核病参比实验室的指导下，负责所在辖区结核病细菌学工作计划的制定和实施等技术管理。 省级参比实验室，应有5～10名专业人员，其中含中、高级专业技术职称人员2名以上。 省级参比实验室，至少具有50平方米以上的实验工作场所。具备开展检查项目的相应仪器
非发酵菌 鼻疽假单胞菌 鼻疽假单胞菌（P.Mallei）是鼻疽病的病原菌。可从患者血液、脓液、痰中分离到。 【临床意义】 对马、骡、驴的传染性很强，犬、猫、羊等都可被感染。可通过擦伤皮肤、直接接触和吸入本菌而感染。人类感染较少见，但经常与病畜接触的人也可患鼻疽病。实验室感染也可发生。 产碱假单胞菌 【临床意义】 为条件致病菌，可引起脓胸、眼部感染、脓肿等 恶臭假单胞菌 恶臭假单胞菌(P.Putida)为鱼类的一种病原菌，常可从腐败的鱼类中检出，偶尔可从尿路感染患者的尿中及血库存血中分离出来。 非发酵菌 非发酵菌（Nonfermenters）大多是条件致病菌。包括十几个菌属的数十个种别，如假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属、莫拉氏菌属等。 由于非发酵菌有很多菌属，每个菌属又有多个种，因此对其必须先进行初步分群，即先进行科、属的鉴别，然后再进行种间鉴别。 腐败假单胞菌 腐败假单胞菌（P.Putrefaciens）为腐物寄生菌，分布非常广泛，河水、污水、土壤、牛奶、鸡蛋等均有存在。可引起奶油、鱼、肉变质并产生H2S。
【临床意义】 本菌为条件致病菌。可引起人类中耳炎、创伤后溃疡、败血症、呼吸道感染，以及糖尿病或体弱患者的皮肤化脓性溃疡。 假单胞菌属 假单胞菌属（Rseudomonas）分布很广，水、污水、土壤和空气中均存在。本属有几十个菌种，临床较常见的有十种左右。代谢菌种为铜绿色假单胞菌。人类感染的非发酵菌，假单胞菌占70%～80%。主要是铜绿色假单胞菌（占55%～65%）。 类鼻疽假单胞菌 类鼻疽假单胞菌（P.Pseudomallei）可引起类疽病。 【临床意义】 为条件致病菌。人类接触污染的污水、土壤或通过直接接触（划破皮肤或擦伤）而进入人体，也可从呼吸道、消化道进入人体而感染。但罕见人与人之间相互传染。 本菌可潜伏体内几年不发病，在多发地区这种隐性感染是很高的。败血性类鼻疽病如不及时治疗进展迅速，且死亡率很高。 类产碱假单胞菌 类产碱假单胞菌（P.Pseudoalcaligenes）与产碱假单胞菌很相似，属于假单胞菌中的产碱群。 【临床意义】 可引起肺炎、术后膝关节感染、脑膜炎和败血症。
细菌学检验重点 （选择20个20分，填空52个26分，名词解释6个18分，简答6个24分，论述1个12分） 注：以下内容主要是老师的红字部分，可能看的过程有些吃力，大家结合课件和书本看哈，帮助理解，不过老师说过考点重点在红字部分的 第一章细菌学实验的基本要求 1、实验室生物安全(Laboratory biosafety): 实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。 2、生物安全防护基本要求 实验室生物安全防护（biosafety protection for laboratories） –实验对象：致病的微生物及其毒素 –` –综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等 –确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。 实验室生物安全通用原则 ?积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物； ?主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位向周围环境释放； ?尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。 3、实验室必须设有专职的生物安全负责人 实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。 * 生物安全等级 ?生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级。 –实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高。 4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区和污染区 5、各级生物防护实验室特点 ?一级生物安全防护实验室（BSL-1/P1）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等。 ?二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2 ） 实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。 : 在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。 ?三级生物安全防护实验室（BSL-3/P3）：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗。 ?四级生物安全防护实验室（BSL-4/P4 ）：适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。 6、控制措施 ?安全设备和个体防护是实验室工作人员与致病微生物及其毒素直接接触的一级屏障。 ?所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶的操作，都必须在生物安全柜内进行。 7、生物安全柜（BSC）biosafety cabinet(概念、分级及特点) ?具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜，可有效降低实验过程中产生的有害气溶胶对操作者和环境的危害。(净化排气) ?? ?根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为I、Ⅱ、Ⅲ级3种类型。 ?实验室应按要求分别配备I、Ⅱ、Ⅲ级生物安全柜。 Ⅰ级生物安全柜：外部空气
细菌学诊断技术 随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。 一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa 等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。 Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。 二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术 在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。 1．抗血清凝集技术 早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。 2．乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7 3．荧光抗体检测技术
一、名词解释1．毒性噬菌体能在宿主细胞内复制、增值，产生许多子代噬菌体，最终裂解宿主细菌。2．温和噬菌体与宿主菌的染色体整合，随细菌DNA 的复制而复制，随细菌的分裂而传代，不产生子代噬菌体。3．前噬菌体（百度百科）整合在宿主基因组上的温和噬菌体的核酸称之为前噬菌体。整合在细菌基因组中的噬菌体基因组。4．溶原性细菌带有前噬菌体的细菌称为溶源性细菌。5．噬菌斑在固体培养基上，噬菌体对宿主菌细胞的裂解作用可使菌落溶解，导致在带菌琼脂平板上产生空斑，易于观察。6．L-型细菌是一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。7．MIC 最低抑菌浓度稀释法所得到的某抗菌药物的抑制待测菌生长的最低浓度。8．链激酶试验9．血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变成为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。10．肥达反应用已知伤寒沙门菌的O、H 抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌的H 抗原作为诊断菌液，与受检血清作试管或微孔板凝集试验，检测受试血清中有无相应的抗体及其效价的一种半定量试验。11．内毒素内毒素是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖（LPS）组分，只有当细菌死亡破裂或用人工方法裂解菌体后才释放。12 . 鲎试验鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种独特的有核变形红细胞。这种变形细胞的裂解物可与微量的细菌内毒素发生凝胶反应。因此，可用此反应定量和半定量检测细菌内毒素。13 . RTD 能产生次于融合性裂解的最高稀释度，既是该噬菌体的RTD。14 . 串珠试验将带测菌接种于含0.05~0.1IU/ml 青霉素的普通营养琼脂培养基37℃、6h 后，炭疽杆菌可发生形态变化，在高倍显微镜下检查，同时用不含青霉素的琼脂片培养物对照，阳性菌体膨隆相连似串珠，而类炭疽杆菌则无此现象。15 . 卡介苗BCG 将牛分枝杆菌经过13 年230 次传代培养而获得的减毒活疫菌株。16 . 外斐反应变形杆菌属的某些菌株（X19,X2.Xk）的菌体（O）抗原与斑疹伤寒立克次体（和恙虫病立克次体）有共同抗原，故可用这些变形杆菌抗原（OX19，OX2，Oxk）代替立克次体作为抗原与相应患者血清进行交叉凝集反应，此称外斐试验，辅助诊断立克次体病。17 . S9 哺乳动物微粒酶系统，是体外致突变试验的代谢活化系统。18 . SOS 显色试验是一种利用微生物“SOS”修复能力检测致突变物、致癌物的方法。19 . Ascoli 热沉淀反应在病兽腐败脏器或包皮虽经长时间煮沸仍可与相应免疫血清发生环状沉淀反应。20 . 反应素人感染梅毒螺旋体后，除产生特异性抗体外，还产生一种反应素（脂质抗体）。21 . 非螺旋体抗原试验用于初筛梅毒螺旋体。22 . 支原体是一类无细胞壁、形态上呈高度多形性，可通过除菌滤器，在无生命的培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。23 . 衣原体是一类具有独特生长发育周期、专性细胞内寄生、能通过细菌滤过器的原核细胞性微生物。 24 . 立克次体是一类微小杆状或球杆状、革兰阴性、除少数外仅能在宿主细胞内繁殖的原核细胞性微生物。25 . 病毒仅由核酸（DNA 或RNA）和蛋白质外壳构成的专营细胞内生存的寄生物。二、重点复习：1、简述食品卫生细菌学样品采样的原则、种类及特点。 21 样品采集原则：①具有代表性②防止样本受到外源性污染③防止细菌生长④食物中毒时应及时采集可疑食物样本采样种类：分大样、中样和小样。大样：一整批样本；中样：混合样本，200g；小样：分析用，检样，25g。2、简述药敏试验的目的及方法。K-B 法药敏试验的影响因素有哪些？73 目的：测定抗菌药物抑制或杀死细菌的能力。方法：纸片扩散法、稀释法、E-试验法、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法。目前常用的方法是纸片扩散法、稀释法，多用于需氧菌和碱性厌氧菌。因素：①培养基②琼脂浓度与厚度③PH 值④药物纸片的质量⑤操作因素⑥菌液浓度3、菌种保存的方法、特点及菌种保管的规章制度。防止菌种退化的主要措施有哪些？87— 90 保藏方法：一培养基保藏法：1 琼脂斜面保藏法二载体干燥保藏法三真空冷冻干燥保藏法四低温及超低温保藏法2 半固体穿刺法3 石蜡封存法防止菌种退化措施：①控制传代次数②用典型菌株和菌落传代③通过易感动物传代使菌种恢复原有特性④定期检查菌种性状4、细菌
临床医学检验技术（中级)-微生物和微生物学检验 (B1型题) 1、不会通过母婴途径传播的RNA病毒是 A.HAV B.HSV C.HCMV D.HIV E.HPV 2、通过性接触传播的RNA病毒是 A.HAV B.HSV C.HCMV D.HIV E.HPV 3、接种左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，新型隐球菌呈棕黑色菌落的是 A.芽管形成试验 B.厚壁孢子形成试验 C.酚氧化酶试验
D.尿素酶试验 E.毛发穿孔试验 4、假丝酵母菌属中仅白假丝酵母菌阳性的试验是 A.芽管形成试验 B.厚壁孢子形成试验 C.酚氧化酶试验 D.尿素酶试验 E.毛发穿孔试验 5、医院感染最重要的感染源为 A.患者 B.医院工作人员 C.探视者 D.陪同人员 E.未彻底消毒灭菌的血液制品 6、可作为共同传播媒介物引起医院感染的为 A.患者 B.医院工作人员 C.探视者 D.陪同人员
E.未彻底消毒灭菌的血液制品 7、不属于钝化酶的是 A.乙酰转移酶 B.核苷转移酶 C.磷酸转移酶 D.红霉素酶 E.CTX-M型酶 8、细菌对氯霉素的耐药机制为 A.乙酰转移酶 B.核苷转移酶 C.磷酸转移酶 D.红霉素酶 E.CTX-M型酶 9、具有高度变异性的肝炎病毒是 A.HAV B.HBV C.HCV D.HDV E.HEV
10、可形成包涵体的肝炎病毒是 A.HAV B.HBV C.HCV D.HDV E.HEV 11、耐碱不耐酸的细菌是 A.结核分枝杆菌 B.痢疾志贺菌 C.伤寒沙门菌 D.霍乱弧菌 E.脑膜炎奈瑟菌 12、细胞壁含脂类最高的细菌是 A.结核分枝杆菌 B.痢疾志贺菌 C.伤寒沙门菌 D.霍乱弧菌 E.脑膜炎奈瑟菌
锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应
注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。 （5）生产工序监测采样 车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。 车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。 车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检 3、 采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、 数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日） 取样注意事项： （1）防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触；取样的操作要规范、迅速（无菌操作）；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏） (2)取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法 二、送检 采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的减少或增多。 1、无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微 生物进一步污染； 2、进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途遥远， 可将不需冷冻的样品，保持在1～5 ℃环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备； 3、送检样品不得加入任何防腐剂； 4、水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在3h内送 检，在送检途中一般都应加冰保存； 5、对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。 6、检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。其内容包括：样 品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度和湿度等
临床细菌学检验的质量控制 目的研究临床细菌学检验质量控制措施。方法本组抽取我院于2012年8月～2013年8月从各科室采集的4500例细菌标本进行临床实验。分析检验结果的准确性。结果经临床病理证实，临床细菌学检验质量优良为2412例，合格为1778例，不合格为310例，合格率为93.11%。结论规范管理程序，保证标本质量采集的质量，对提高临床细菌学检验的质量具有重要意义。 标签：样本采集；检验质量；细菌学 随着医疗技术的快速发展，细菌学检验逐渐成为临床医学中重要的组成部分。通过对入院患者进行标本采集、研究等，可为临床治疗提供依据。由于临床细菌学检验内容非常复杂，包括标本采集、运送、保存、药物过敏检验等多方面的内容，任一环节出错，都会对检查质量造成影响，因此我们必须格外注意各环节的操作标准。现对我院采集的4500例细菌标本的检验过程进行综合分析，得出如下结论。 1资料与方法 1.1一般资料本组抽取我院于2012年8月～2013年8月从各科室采集的细菌标本4500例，其中559例血液标本，678例粪便标本，894例尿液标本，686例脓液标本，759例生殖道分泌物，924例痰液标本。 1.2方法将采集的标本进行分类处理，对不同的标本进行临床细菌学检验，记录检验结果。 1.3临床评价标准参照医学微生物检验规范对本组实验进行综合评价。根据检验结果的准确性进行综合评价，以优良、合格、不合格作为评价等级。对不合格标本进行研究，分析其影响因素。 2结果 本组4500例标本，其中优良为2412例，合格为1778例，不合格为310例，合格率为93.11%。其中，以粪便标本和血液标本的检查合格率最高，见表1。本组310例不合格，不合格率为6.89%，其具体影响因素见表2。 3结论 随着医疗技术的进步，细菌学开始广泛的应用于临床诊断中，为临床治疗提供准确的依据。临床细菌学检验的过程主要包括细菌采集、运送、管理、检验等，在这一系列的过程中，往往会受到其他因素的干扰，影响检验质量。 3.1影响临床细菌学检验质量的因素
1.沙门氏菌的微生物学诊断过程分述如下： 1）病料采集、处理: 未污染病料直接接种普通琼脂、血琼脂或鉴别培养基平板分离细菌；污染材料如饮水、粪便、饲料、肠内容物和已败坏组织等，常需要增菌培养基如亮绿-胆盐-四硫磺酸钠肉汤等增菌后再行分离。这些培养基能抑制其他杂菌生长而有利于沙门氏菌大量繁殖。接种后于37℃培养12-24-48h。 2）肠道菌鉴别培养基中的培养:蘸取上述增菌培养物在SS培养基中划线分离，经37℃培养24h。若观察到其中长出黑色或黄色菌落，则视为可疑菌落； 3）可疑菌落接种三糖铁培养基：挑取上述SS平板中的可疑菌落作成纯培养，病同时在三糖铁培养基斜面和底层穿刺，37℃培养24h。如观察到在三糖铁琼脂底层呈黄色，或黑色，斜面上为红色，则进一步判定疑似为沙门氏菌； 4)纯培养物的形态学检查和系统生化项目鉴定：将上述疑为沙门氏菌的培养物涂片，经革兰氏染色，镜检；同时接种于各种生化培养基中培养，以鉴定其生化特性；) 5)纯培养物的血清学鉴定（属和型）:同时可将三糖铁上的培养物与沙门氏菌A-F组多价抗0血清及各单因子血清做玻板凝集试验，以鉴定其属、型抗原； 6）确诊报告：综合上述各项检测结果对此病例做出确诊。 2.炭疽杆菌的微生物学诊断过程分述如下： 1）病料采集：(疑似)死于炭疽的病畜尸体严禁剖检；要在动物尸体末梢循环处采血或切开肋间采集脾脏，切口烙封或用浸泡消毒药水的纱布填塞； 2）细菌学检查 a.形态学检查:上述病料涂(触)片，干燥、固定后，以碱性美兰或瑞氏或姬姆萨染色法结合革兰氏染色，如发现有荚膜的 竹节状链杆菌，革兰氏染色呈阳性的两端平截的链杆菌时，结合流行病学、临床症状即可做出初步诊断； b.病料分离培养:可选用普通琼脂平板、血琼脂平板及普通肉汤对上述病料进行分离培养。如在普通平板上分离出扁平、 灰白色不透明、干燥、无光泽、边缘不整齐，低倍镜或放大镜观察边缘呈卷发状的大菌落时，则为疑似菌落。挑取此疑似菌落接种于营养肉汤中进行培养，观察其是否具有炭疽杆菌肉汤培养物的生长性状。必要时还可用分离菌的纯培养物做串珠试验及明胶穿刺培养。 c.动物接种试验:取上述分离菌的肉汤培养物或将病料用灭菌生理盐水制成1:5悬液，皮下注射小鼠，小鼠常于注射后 24-36h死于败血症，剖检可见注射部位胶样浸润，脾肿大等病变；取血液、脏器等涂片、镜检，如发现竹节状有荚膜的链杆菌，结合上述各项检查结果，即可做出确诊。 3）血清学检查对于不能进行细菌学检验的病料如皮毛等可进行血清学诊断。 a.阿(Ascoli)氏热沉淀试验:将病兽皮革或尸体组织切碎后，加水煮沸过滤，取滤液滴加于小管内的免疫血清面上，室温 或37℃放置十分钟后，如见两液接触面出现白色沉淀环，即为阳性，证明滤液中有炭疽杆菌的多糖质抗原。 b.琼扩试验也可用上述待检抗原及标准免疫血清做琼扩试验，若观察到免疫血清孔和待检抗原孔之见出现白色沉淀线， 即为阳性，证明滤液中有炭疽杆菌抗原。 4）确诊报告根据上述各项诊断结果，判定该动物感染了炭疽或此兽皮中污染了炭疽杆菌。 3.致病性大肠杆菌的微生物学诊断的内容和步骤分述如下； 1)病料采集、处理及分离培养: 对败血症病例，可无菌采集其病变的内脏组织；直接接种在血琼脂或麦康凯培养基平板中分离细菌；对幼畜腹泻及猪水肿病病例应采集器肠内容物或黏膜刮取物以及相应肠段的肠系膜淋巴结，分别接种于麦康凯琼脂及血琼脂培养基中于37℃培养24-48h后，如观察到在麦康凯培养基中长出红色菌落或在血平板上菌落周围呈β溶血(仔猪黄痢与水肿病菌株)，则视为可疑菌落。 2)可疑菌落接种三糖铁培养基：挑取上述可疑菌落在普通琼脂斜面做纯培养，并同时在三糖铁培养基斜面和底层穿刺，37℃培养24h，做初步生化鉴定。如观察到在三糖铁琼脂底层呈黄色，斜面上为黄色或红色，则进一步判定疑似为大肠杆菌； 3）纯培养物的形态学检查和系统生化项目鉴定：将上述三糖铁反应模式符合大肠杆菌的培养物或其纯培养涂片，经革兰氏染
临床微生物学检验技术复习练习试题绪论 选择题 A 型题（只选一个最佳答案） 1.细菌属于原核细胞型微生物的主要依据 A 单细胞，结构简单 B 原始核，细胞器不完善 C 二分裂方式繁殖 D 有细胞壁 E 对抗生素敏感 2.属于非细胞型微生物 A 细菌 B 病毒 C 衣原体 D 真菌 E 立克次体 3．第一架观察微生物的显微镜放大的倍数 A 200倍 B 266倍 C 500倍 D 366倍 E 1000倍 4．不属于原核细胞型微生物的是 A 螺旋体 B 衣原体 C 支原体 D 真菌 E 放线菌 5．首次使用固体培养基的科学家是 A 琴纳(Edward Jenner) B 巴斯德 (Louis Pasteur) C 伊凡诺夫斯基(Iwanovsky) D 列文胡克(Leewenhoek) E 郭霍(Robert Koch) 6．微生物特点描述哪项错误 A 形体小，结构简单 B 肉眼看不见的低等生物 C 分布广，种类多 D 繁殖快，代谢强 E 不易发生变异 B型题（每题只选一个最佳答案，备选答案可重复被选） A 法国的巴斯德
B 德国的郭霍 C 俄国的伊凡诺夫斯基 D 中国的汤飞凡 E 荷兰的列文胡克 1.最早观察到细菌 2.创用固体培养基分离细菌 3.病毒发现起重要贡献的是 4.狂犬病疫苗、炭疽病疫苗研制者 5．首先证实有机物发酵和腐败是由微生物引起 6．首先成功地分离出沙眼衣原体 7.结核杆菌、炭疽芽胞杆菌的发现者 X型题（选2个以上答案） 1.属于原核细胞型微生物 A 细菌 B 病毒 C 衣原体 D 真菌 E 立克次体 2．微生物与人类的关系 A 大多数微生物可导致人发病 B 微生物可以制造菌肥和杀死害虫，促进农作物生长 C 微生物可以产生多种抗生素 D 微生物可为基因工程提供必不可少的工具酶和载体系统 E 病原微生物可以引起人和动物发病 填空题 1．微生物的特点：； ； ； 。 2．原核细胞型微生物仅有原始核质，无 、； 缺乏，只有核糖体。
细菌学诊断新技术 随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。 一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B 群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。 Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。 二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术 在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。 1．抗血清凝集技术 早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。 2．乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7 3．荧光抗体检测技术 用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750份食品样品的检测，结果表明与常规培养法符合率基本一致。 4．协同凝集试验（COA） 业已证实，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段的活性。近年来国内外学者采用抗体致敏的SPA检测细菌即协同凝集试验。如Rahman等用协同凝集试验鉴定霍乱弧菌O1群的初代分离物做快速筛选，比常规法节省时间，对204份材料用两种方法比较表明协同凝集试验具有较高的特异性和敏感性。 5．酶联免疫测试技术 酶联免疫技术的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验。 应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通
水质的细菌学检查 一、目的要求 (一)学习水质的细菌学检查法 (二)了解水质状况同细菌数量的关系及大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 二、基本原理 检测水中的细菌数量是评价水质状况的重要指标之一。饮水是否合乎卫生标准，需要进行水中细菌数量及大肠菌群数量的测定。大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌，由于大肠菌群是一群能发酵乳糖的革兰氏阴性、无芽孢杆菌，它们在乳糖培养基中经37℃培养24小时即能产酸、产气，所以常将其作为粪便污染的标志。 饮用水一般规定：1毫升自来水中总菌数不得超过100个；1000毫升自来水肠菌群数不得超过3个。 三、实验材料 培养基及器皿、牛肉膏蛋白胨培养基、乳糖蛋白胨发酵管（倒置小管）、三倍乳糖蛋白胨发酵管（倒置小管）、伊红美蓝琼脂培养基、无菌空瓶、无菌水、无菌培养皿、移液管、试管。 四、实验客 (一)采取水样 1、自来水：从学校各生活区取样。先将自来水龙头用火焰灭菌,再开放水龙头使水流1—2分钟后，用无菌空瓶接取水样。 2、池水、湖水或河水：用无菌空瓶取距水面 10—15厘米深层水样。水样采取后应立即检验，不得超过4小时。 (二）水中细菌总数测定 l、自来水： 稀释水样：原水样和10-1 水样，用无菌移液管分别吸取l毫升原水样和10-1水样，分别注入二个无菌培养皿中。每皿各加13--15毫升已融化并冷却到4 5-- 50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，轻轻旋转，使培养基与水样充分混匀，待凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱，培养24小时进行菌落计数。 制作培养基方法、消毒灭菌、接种、计数皆参照参微生物学实验指导，具体如下：培养基制作：实验五、培养基的制备 培养基配方：附录二、常用培养基之一 培养基灭菌：实验六、灭菌与消毒 水样接种：实验七、土壤微生物的分离与测数 细菌总数测定：实验七、土壤微生物的分离与测数 2、池水、湖水或河水等。 稀释水样：稀释倍数视水样污浊程度而定，使水样培养后每个平板中的菌落数在30--300之间的的稀释度最为合适。例如：取湖水稀释成10-1、10-2、10-3。每个稀释度作两个培养皿，并依上法倾入培养基制成平板，培养，计数。 菌落计数方法： （1）先计算同一稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不应采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一