细胞生物学实验
原代培养
一、实验目的
1.理解细胞原代培养原理
2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤
3.了解细胞原代培养的应用
4.独立进行细胞原代培养操作
5. 熟悉无菌操作技术
二、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞
刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生
物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养: 组织直接从机体获取后, 通过组织块长出单层细胞, 或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养, 在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基
置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖
的过程。
三、实验步骤
鸡胚成纤维细胞的原代培养
（1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手, 用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。
（2）关闭已照射超净台台面20 分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。
（3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。
（4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。
（5）按照1%的比例向含10%FCS勺DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为80ml，故加入800卩I的双抗）
（6）取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，用镊子在鸡蛋气室位置（大头处）敲一个小口，然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
（7）换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks 液冲洗鸡胚，重复三次。
（8）用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏，用D-hanks 液充分洗涤躯干部分三次。
9）将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎，剪碎速度要快。
（10）向碎块中加入胎牛血清，用滴管将组织碎块接入培养瓶中，静置一分钟，待组织块微干与瓶壁贴牢后，加入5ml 培养基置于培养箱中培养。将瓶子翻转倒置后在37 度培养箱中放置2-3 小时，再将瓶子翻转过来。
（11）将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。
（12）实验后数小时后去观察组织块中细胞迁移情况，并拍摄照片。
四、实验结果
本次实验在原代培养过夜后观察细胞的迁移情况并拍照。
鸡胚成纤维细胞原代培养（倒置显微镜20%
五、实验结果分析
1、原代培养一天后细胞生长情况观察：
由上图可以观察到显微镜下鸡胚组织块附近有大量细胞迁移，迁移出来的细胞呈纤维状，贴壁生长，且没有污染发生，实验结果比较理想。
2、本实验的材料尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织。
3、使用组织块法进行原代培养时，应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。
4、要注意无菌操作。
六、思考题
1、从细胞增殖及调控角度来看哪种组织和器官适用于原代培养实验？取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
2、如何提高原代细胞培养的成功率？
（1）在选择材料的时候一定要注意选取9-12 日龄的鸡胚，在处理胚胎的时候要干净利落，要将四肢及内脏去除干净。
（2）应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。
（3）操作一定要无菌，不能污染。组织一定要尽量剪得碎一点，且动作要迅速。
3、鸡胚成纤维细胞的应用？
（1）病毒学领域的相关研究：CEF细胞是疫苗生产的一种重要的细胞资源，现在它被用来生产各种鸡的疫苗, 如传染性法氏囊病、马立克病、新城疫疫苗等,也被用来表达一些基因工程产物。
（2）鸡胚成纤维细胞良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。
（3）CEF的原代培养在分子生物学、细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学及细胞工程学等领域,已发展成为一门重要的生物技术, 并取得显着成就。