MTT法( MTT Assay)检测细胞活力与细胞密度的关系

MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。

三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。

2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。

（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。

）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。

mtt法实验条件的研究
MTT 法（噻唑蓝比色法）是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用噻唑蓝（MTT）被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝色甲瓒（formazan），而死细胞则不能还原 MTT。

通过检测甲瓒的生成量，可以间接反映细胞的活力。

以下是一些 MTT 法实验条件的研究方向：
1. 细胞类型和密度：不同类型的细胞对 MTT 法的响应可能不同，因此需要针对不同的细胞类型进行优化。

细胞密度也会影响 MTT 法的结果，通常需要根据实验目的选择适当的细胞密度。

2. MTT 的浓度和孵育时间：MTT 的浓度和孵育时间会影响甲瓒的生成量。

一般来说，MTT 的浓度在 0.5-1mg/mL 之间，孵育时间在 2-4 小时之间。

需要根据细胞类型和实验条件进行优化。

3. 溶剂和缓冲液：MTT 法常用的溶剂是 PBS（磷酸盐缓冲液），但不同的缓冲液可能会影响 MTT 的溶解性和细胞的活力。

因此，需要选择适当的溶剂和缓冲液。

4. 细胞培养条件：细胞的培养条件，如培养基的成分、温度、湿度和二氧化碳浓度等，也会影响 MTT 法的结果。

需要根据细胞类型和实验目的选择适当的培养条件。

5. 甲瓒的溶解和检测：甲瓒的溶解和检测方法也会影响 MTT 法的结果。

常用的甲瓒溶解液是 DMSO（二甲基亚砜），但不同的溶解液可能会影响甲瓒的溶解性和稳定性。

检测方法可以使用酶标仪或分光光度计等。

MTT 法实验条件的研究需要综合考虑细胞类型、MTT 浓度、孵育时间、溶剂和缓冲液、细胞培养条件以及甲瓒的溶解和检测等因素，以获得准确可靠的结果。

细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，它的特点是灵敏度高、经济。

学术术语来源---Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化文章亮点：1 实验先采用全骨髓血培养法培养犬骨髓间充质干细胞，继而采用贴壁筛选纯化，方法简便，所获细胞数量及纯度满意，并在体外成功诱导分化出软骨细胞。

2 实验所采用的细胞支架材料为瑞士Geistlich公司生产Bio-gide胶原膜，这是一种由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成复合材料，分为致密层和疏松层，种子细胞接种在胶原膜的较为粗糙的疏松层，而光滑的致密层在体内实验中朝向关节腔，有利于骨髓间充质干细胞的黏附、生长及向软骨细胞的分化，三维立体培养有助于诱导生成的软骨细胞维持表型。

3 实验显示Bio-gide胶原膜与骨髓间充质干细胞复合培养有良好的生物相容性，但能否体内构建组织工程软骨组织，促进软骨细胞的生长，缺损的软骨组织得到完整的修复，尚待进一步研究。

关键词：生物材料；组织工程软骨材料；膜生物材料；骨髓间充质干细胞；Bio-gide胶原膜；组织工程；股骨头坏死；软骨缺损；种子细胞；国家科学自然基金摘要背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。

目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。

方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞，观察细胞形态学变化，以细胞表面抗原进行鉴定。

MTT细胞计数及活力测定MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。

在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。

台盼兰用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。

利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计），青霉素小瓶2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMSO3、材料：细胞悬液三、操作步骤（一）细胞计数1、细胞用胰酶消化后，加入DMEM终止，彻底重悬，室温静置5min，吸取上清至新的15mlEP 管中，1000rpm×10min，弃上清，沉淀用DMEM充分重悬。

2、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

3、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

4、静置3分钟。

5、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

然后按下式计算：细胞数/ml＝（4大格细胞总数/ 4）×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

（二）细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

(methyl thiazolyl tetrazolium) mtt法1. 引言1.1 概述MTT法是一种常用的细胞存活率检测方法，它通过检测细胞对(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT染料的代谢能力来评估细胞的生命活力。

该方法被广泛应用于生物医学研究中，特别是在肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程等领域。

1.2 文章结构本文将首先介绍MTT法的基本原理和在细胞存活率检测中的应用，然后详细阐述MTT法的操作步骤，包括细胞处理及培养条件准备、MTT染色和测量以及数据分析和结果解读。

接下来，本文将分享一些MTT法在生物医学研究中的应用案例，包括肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程及再生医学。

最后，文章将总结并展望MTT法在未来的发展前景。

1.3 目的本文旨在全面介绍MTT法，并突出其在生物医学研究中的重要应用。

通过详细阐述MTT法的原理、操作步骤和应用案例，旨在提供读者对该方法的全面了解和应用指导，进一步促进其在生物医学研究中的广泛应用和发展。

同时，本文也希望能够引起更多研究者对MTT法的关注，并为未来的相关研究提供新思路和启示。

2. MTT法的原理：MTT法（(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT assay）是一种常用的细胞存活率检测方法，通过测量细胞内还原酶催化将无色MTT显色成紫色形azán离子。

该方法基于细胞代谢活跃度与存活能力密切相关的原理。

2.1 MTT法的基本原理：MTT是一种黄色可溶于生理盐水的四唑类化合物，在细胞实验中被广泛应用。

当MTT进入到细胞内后，由于存在细胞内还原酶（如线粒体呼吸链中的NADH-脱氢酶、二氢四氮杂苯脱氢酶等），MTT会被代谢成可以溶于有机溶剂（如DMSO，二甲基亚砜）的紫色产物——甲基三唑瓣啉蓝(MTT-formazan)。

这个过程为混色反应。

2.2 MTT法在细胞存活率检测中的应用：MTT法主要通过检测MTO-formazan所生成的紫色产物来分析细胞存活率和生长情况。

mtt法检测原理MTT法全称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide法，是一种常用的细胞活力测定方法。

该方法通过将MTT试剂加入实验的细胞培养液中，MTT试剂在细胞内被还原为紫色的可溶性甲硝唑盐形式，在细胞内形成紫色晶体，通过显微镜观察，就能评估细胞的生长情况。

MTT法原理基于细胞的代谢活性与细胞数量成正比的概念。

在细胞活性良好的情况下，细胞能够将MTT试剂还原为晶体形式。

MTT试剂的还原过程是通过线粒体呼吸链中的NAD(P)H氧化还原酶来催化的。

NAD(P)H氧化还原酶会将MTT试剂中的黄色噻唑环氧还原为紫色的甲硝唑盐。

尽管这种反应的确切机制尚不明确，本质上是通过还原剂和线粒体呼吸链之间的相互作用来进行的。

MTT法的操作步骤如下：1.细胞培养：将实验所需的细胞培养在含有营养物的培养基中，一般培养在96孔组细胞培养板中。

2.处理实验：细胞培养达到一定的密度后，将需要测试的样品或实验处理条件加入细胞培养基中。

3. 加入MTT试剂：向细胞培养基中加入MTT试剂，建议浓度为0.5 mg/mL，试剂添加量与实验条件相关。

4.培养细胞：将细胞培养板继续培养一段时间，一般为1-4个小时。

5.细胞裂解：将细胞培养液中的上清液抽去，然后加入适量的溶解液（如DMSO）使细胞溶解。

6.测定吸光度：将溶解后的细胞液移至吸光度检测板中，使用微孔板读数器测量吸光度。

MTT法的优点包括：简单易行、灵敏度较高、耗时短、适用于大规模筛选等。

然而，该方法存在一些限制因素，如只能测量细胞总体活力，无法判断细胞死亡或细胞损伤的原因，需要使用其他实验方法进行验证。

总而言之，MTT法通过测量细胞能够将MTT试剂还原成紫色晶体的能力来评估细胞的代谢活性。

该方法可以用于细胞生长情况的评估和药物筛选等领域，具有广泛的应用前景。

Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:MTT法检测细胞存活率或抑制率●基本原理:MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethyl thiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的formazan结晶可用DMSO（分析纯）来溶解。

利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

●试剂配制：MTT溶液：用pH=7.4的PBS配制成5mg/ml浓度的溶液，避光保存)●MTT法检测细胞存活率或抑制率详细步骤1接种细胞：用含10％胎/小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-105个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200μl.2:培养细胞：同一般培养条件，培养1-2天（原代细胞不同，可根据试验目的和要求决定培养时间，神经元7-10天，心肌细胞8-14天）。

3 吸去原培养基，每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物（原代细胞例外）。

4培养24或48h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用pH=7.4的PBS配制，避光保存)10-20μl.（每孔培养基为100μl，加10μl，每孔培养基为200μl，则加20μl）。

5 37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液）。

6每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

7比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。

mtt法检测细胞活性原理
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理基于细胞内的代谢活性。

以下为实验步骤及原理解释，其中省略了标题：
1. 细胞培养：首先，将需要进行活力检测的细胞进行培养。

常见的细胞培养基包含营养成分和适宜的生长条件，如适温、适湿度和适透气性。

2. 处理样本：将细胞培养至一定密度后，根据实验需要进行不同的处理。

例如，给予药物处理，确保适当时间和浓度。

3. MTT染色液制备：MTT（3-(4,5-二甲基硫酰基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色体内还原剂，可穿透细胞膜并转化为紫色的维甲酸鞘。

将MTT按照实验需要溶解于无菌磷酸盐缓冲液中，制备MTT染色液。

4. 细胞处理：将处理后的细胞溶液均匀地分配到96孔板中。

为了排除干扰，设置空白对照及阳性对照。

5. MTT染色：向细胞孔中加入MTT染色液，使其与细胞内的还原剂反应。

将细胞培养在37°C的细胞培养箱中，一般为4小时。

6. 结晶溶解：将培养液中的MTT染色产物溶解。

加入溶液（如二甲基亚硫酰胺）使产生的紫色颗粒溶解。

7. 光密度测定：使用酶标仪等工具，测量液体的光密度（OD
值）。

OD值正比于细胞活力。

8. 数据分析：根据不同处理组的OD值，计算细胞活力的百分比。

活力高的样本表现出较高的OD值。

MTT法通过测量细胞内活性代谢物的转化，能够准确反映细胞生长状态和代谢活力。

这种方法广泛应用于药物筛选、细胞毒性测试和细胞增殖研究等领域。