生物技术大实验论文
论文题目：双水相萃取技术提取过氧化物酶工艺研究
作者姓名：郑海
指导老师：吴元喜
提交日期：2007年5月
目录
摘要 (Ⅰ)
Abstract (Ⅱ)
1.综述……………………………………………………………………………１1.1开题背景……………………………………………………………………１1.1.1过氧化物酶………………………………………………………………１1.1.2双水相萃取技术…………………………………………………………１
1.2国内外进展…………………………………………………………………２
2.方案论证………………………………………………………………………５
3.过程设计………………………………………………………………………５
3.1实验流程……………………………………………………………………５
4.结果与讨论..............................................................................９4.1预实验.................................................................................９4.2正交实验..............................................................................９4.3梯度实验 (10)
4.4验证实验 (11)
4.5超滤 (11)
4.6凝胶过滤 (12)
4.7电泳 (12)
5.结论与展望 (12)
5.1工艺流程数据分析 (12)
5.2结论及前景展望 (13)
致谢 (13)
参考文献 (13)
摘要
过氧化物酶[Peroxidase, POD, EC1. 11. 1. 7 (x)〕是一类以血红素为辅基的酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能，主要催化H202和有机过氧化物对多种有机物和无机物的氧化作用。它在蛋白质、多肽、激素、病毒、寄生虫、生物降解及神经系统等方面都有应用，具有特异性强，灵敏度高等优点。
本文利用PEG4000/（NH4）2SO4双水相体系配合适当的工艺流程，从萝卜中提取纯化过氧化物酶，使过氧化物酶纯化了18.7倍，得到的过氧化物酶比活为110u/mg，该方法具有反应条件要求温和，不需要低温操作，总酶活回收率高，及整个流程可以实现循环等优点，具有较好的工业化前景
关键词：过氧化物酶；双水相；超滤；凝胶过滤
Abstract:
Peroxidase[POD，EC1.11.1.7 C x ) ] is a kind of redox enzyme with hemoglobinas prostheric group, which widely exists in organism and has many differentbiological functions. It mainly catalyzes the oxidation of hydrogen peroxide andorganic peroxide with many inorganic and organic substances. For the high specificityend sensitivity, it is widely applied in protein, polypeptide, hormone, virus, parasite,lignification, biology degradation and neuro-system etc. PEG4000/（NH4）2SO4 double aqueous phase system and appropriate process were used to extract POD from radish. It made POD Purification 18.7 times,the POD’s activity was 110u/mg. this method have many advantages such as the reaction conditions is moderate and didn’t need Low temperature operation , high recovery and a cycle Process, So it has good Industrialization prospects!
Key words: POD；double aqueous phase system；ultrafiltration；gel filtration
1.综述
1.1开题背景
1.1.1过氧化物酶
1.1.1.1过氧化物酶（peroxidase）是一种分解生物体某些代谢产物是分解生物体某些代谢物需氧脱氢后所产生的对机体有害物质的一种酶。当有底物存在时,该酶能催化过氧化氢分解,使之不能在体内过多地积累而产生伤害,因而它具有保护生物体的作用。同时,该酶又是一类以铁卟啉为辅基的酶,广布于动、植物组织,在细胞代谢过程中起重要作用。除此之外,它还是植物生长及抗病重要生理生化指标。更为重要的是该酶又是酶作用机制中“中间产物学说的直接证据[1]。
1.1.1.2过氧化物酶（peroxidase）是最早发现的酶之一，广泛存在于生物界中，也是被广泛研究的一类酶[2]。大部分过氧化物酶都含有血红素，在催化过程中起到基础性作用[3,4],能催化H2O2或相关化合物如O2和有机、无机化合物的氧化反应等[5,6]，所以过氧化物酶在食品、医药、环保和化工等行业中已得到广泛的应用，是需求量较大的工业用酶，如过氧化物酶在工业上可与过氧化氢共同用于橡胶成型、塑料及多泡沫性粘合剂的合成及纤维的漂白，并可以用于食品加工业的杀菌等等[7]
1.1.1.3传统的过氧化物酶的提取方法主要是盐析法，其纯化效果好，酶比活稍高，但存在操作复杂，生产时间长，且大多时间都要求低温操作，丢失的酶量多，提取率低，不适宜工业化生产。[8]。
1.1.2双水相萃取技术
1.1.
2.1双水相萃取与水- 有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于物质在两相的浓度比,各种物质的K 值不同(例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100 或小于0. 01 ,酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0. 1～10 之间,而小分子盐的分配系数在1. 0 左右) ,因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。[9]
1.1.
2.2早在1896年,Beijerinck观察到,明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时,得到一种不透明的混合溶液,静置后可分为两相,上相中含有大部分的明胶, 下相中含有大部分琼脂(或淀粉) ,这种现象被称为聚合物的不相容性,从而产生了双水相。例如将2. 2 % (质量分数)的葡聚糖水溶液与0. 72 %的甲基纤维素的水溶液等体积混合静置后,可以得到两个液层,下层含有71. 8 %的葡聚糖,上层含有90.
3 %的甲基纤维素,两相的主要成分都是水[10]。由于双水相萃取条件较为温和,不会导致被分离物质的失活,该技术已应用于生物大分子的分离和纯化,并且在生物小分子的分离、抗生素提取、中药中有效成分提取分离、稀有金属/贵金属分离等方面的应用也取得了进展。在双水相体系中,常见的水溶性高聚物有:聚乙二醇( PEG) 、聚丙二醇、甲基纤维素、聚丙烯乙二醇、吐温、聚氧乙烯类表面活性剂等;聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐是常用的双水相体系,由于葡聚糖格昂贵,聚乙二醇/无机盐体系应用更为广泛。[11]
1.1.
2.3基于双水相的以下一些特点，其在生物高分子的分离中的应用越来越广泛。
（1)含水量高(70 %～90 % ) ,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;
(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质,还能不经过破碎直接提取细胞内酶,省略了破碎或过滤等步骤;
(3)分相时间短,自然分相时间一般为5 min～15 min;
( 4)界面张力小( 10 - 7 ～10- 4mN /m) ,有助于两相之间的质量传递,界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;
(5)不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发物质,对人体无害;
(6)大量杂质可与固体物质一同除去;
(7)易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊处理;
(8)操作条件温和,整个操作过程在常温常压下进行;
(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
1.2国内外进展：
1.2.1.1目前国内外对过氧化物酶的提取主要的方法都以盐析作为最重要的步骤，其原理是利用过氧化物酶可溶于水,溶解度约为5 %(W/ V) ,且在0. 58 饱和度以下的硫酸铵溶液中可溶,而在0.62 饱和度以上不溶,可据此用分步盐析的方法,再用有机溶剂丙酮进行分步沉淀可制备出较高活力的过氧化物酶制剂。
其具体流程分为以下几步：
1．初酶液的制备；
2．加入226g/L（NH4）2SO4盐析，收集上清；
3．加入258g/L（NH4）2SO4盐析，收集沉淀；
4．蒸馏水溶解，透析除盐；
5．丙酮分级沉淀，收集沉淀，
6．加入少量蒸馏水溶解，透析除丙酮。
经上述几个步骤就可以得到纯度较高的过氧化物酶。[8]
近年来，有不少的工艺流程中采用了离子交换树脂层析、凝胶过滤等一些步骤来进一步提高过氧化物酶的纯度，但是盐析仍旧是整个工艺流程中必不可少的一步。盐析步骤的存在使得整个流程对温度要求比较苛刻，温度过高则容易导致酶的失活，同时盐析步骤的回收率较低，且无法实现循环操作，这样导致目前过氧化物酶的市场价格一直较高。
1.2.2.1双水相萃取由于其独特的优势，目前在分离和提纯生物物质中得到了充分的使用。主要分为以下几个方面。
①分离和提取各种蛋白质(酶)
双水相萃取技术成功地用于分离和提纯蛋白质。牛血清蛋白(BSA) 在聚乙二醇/ 硫酸盐的双水相系中的分配表明,一般情况下,BSA 适宜于分配在下相;pH 值的变化对分配系数影响不大;外加NaCl 对BSA 在两相中的分配产生很大的影响,由通常的BSA 宜分配于下相转变成宜分配于上相及上相表层;通过改变
起始BSA 在溶液中的总浓度,得到平衡时上、下相BSA 浓度随起始BSA 总浓度变化的曲线方程,上相宜用“饱和型”方程表示,下相适合用线性方程表示,将上、下相BSA 浓度之比得到的平衡常数K 的表达式与实验数据拟合较好.
真菌脂肪酶在PEG/ 硫酸铵双水相体系中的分配中, PEG 分子量、PEG 浓度、(NH4 ) 2SO4浓度、NaCl 等因素对脂肪酶和总蛋白分配系数、酶活回收率、相体积比均有影响,实际表明用14 %～ 16 % (W/ W) PEG1000 和12 %～ 14 %（W/ W) (NH4) 2SO4 、NaCl 为零所组成的双水相体系,在室温下对脂肪酶的提取率可达71 % ,分配系数可达1. 7 ,提纯倍数为1. 5 。以PEG/ 硫酸铵双水相体系,经一次萃取从α一淀粉酶发酵液中分离提取α一淀粉酶和蛋白酶。萃取最适宜的条件为15 % PEG1000 、20 % (NH4)2SO4, pH = 8 ,α一淀粉粉酶收率90 % ,分配系数为19. 6 ;与蛋白酶的分离系数高达15. 1 ,比活率为原发酶液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60 %。该法与传统的提取法相比,可直接处理发酵粗滤液,提高工效,降低能耗和酶活损失。[12]
Ménica等利用聚乙二醇( PEG) /磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶,确定最佳体系是22 % PEG6000, 10 % K2 HPO4和12 %NaCl,活性酶的产率可达98 %[13]。除此以外,在近几年的报道中双水相萃取已用于多种蛋白质和生物酶的分离,如牛血清蛋白(BSA) 、牛酪蛋白、β - 乳球蛋白、血清蛋白;α - 淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶( PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 、葡糖淀粉酶、L - 天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离。
②提取抗生素和分离生物粒子
用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离后进行提取,可实现全发酶液萃取操作。采用PEG/ Na2HPO4 体系,最佳萃取条件是PH = 8. 0～8. 5 ,PEG2000 (14 %) / Na2HPO4(18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %。PEG不同相对分子量对双水相提取丙酰螺旋酶素的影响不同,适当选择小的相对分子质量的PEG有得于减小高聚物分子间的排斥作用,并能降低体系粘度,有利于抗生素的分离[14]。
③双水相电泳分离氨基酸
近几年来,随着生物技术的迅速发展,制备型电泳技术的研究受到了广泛的重视。Morre研究了用双水相和自由流动电泳对核内体的分配,提出只用制备型自由流动电泳就可以溶解核内体,而不需要相分离的方法[15]。
④表面活性剂双水相的应用
由头基较大的一种季铵盐型阳离子表面活性剂与另一种阴离子表面活性剂按一定比例和浓度混合而成的新颖双水相体系。作为一种液———液萃取体系用于低浓度、痕量成份的分离检测,其操作简便、快捷。该体系由于仅含有很稀
浓度的表面活性剂(总表面活性浓度低于1 %(W/ W) ) ,生物活性物质在其中分配不易失活变性。因此,在对生物活性物质在其中分离、纯化等方面表现出来了特有的应用价值。
1.2.2.2用于生物分离的双水相高分子聚合物体系常见的有PEG-Dextran和PEG- Dextran硫酸盐体系，高聚物/无机盐体系有PEG-硫酸盐和PEG-磷酸盐体系。
2.方案论证：
过氧化物酶的分子量大约为40KD，属于具有生物活性的蛋白质，从原理上可以利用双水相来进行提取和纯化。考虑到成本，采用PEG4000-硫酸铵双水相体系来进行实验。
2.1为了与传统的盐析法进行对比，进一步了解盐析法和双水相萃取的优劣之处，在实验的第一步进行对比实验。
2.2根据PEG4000-硫酸铵双水相体系的相图，以PEG浓度和硫酸铵浓度为考虑因子，各选择3个适当水平（离分相线有一定距离，但又不至于太远）进行正交实验，确定PEG浓度和硫酸铵浓度这两个因素的相对重要性。
2.3以相对重要的一个因素作为变量，另一个因素使用正交实验的最佳水平，进行单因子实验，得到使过氧化物酶主要分配在上相（PEG相）和下相（硫酸铵相）的最佳浓度值。
2.4采用PEG6000验证双水相效果
2.5根据实验的结果设计适当的流程，以双水相萃取的方法为核心技术对过氧化物酶进行分离和提纯。测定最后的酶活、纯度、回收率。
3.过程设计--实验流程：
试验材料：白萝卜白菜冬瓜胡萝卜
仪器：烧杯试管玻璃棒量筒分液漏斗离心机冷冻离心机电泳仪分光光度计离子交换柱层析仪透析膜
主要试剂：PEG4000、PEG6000、（NH4）2SO4、愈创木酚、过氧化氢、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、HCl、甘氨酸、TEMED、磺基水杨酸、冰乙酸、Sephadex G-75凝胶
3.1采用盐析法和双水相萃方法两种不同的方法，先进行对比试验，以初步了解双水相萃取方法的提纯效果同盐析法相比有何区别。具体流程如下：
3.1.1称取新鲜干净蔬菜各500克，捣碎后分别放入烧杯，定容至1000ml。
3.1.2将烧杯放入-4℃的冰箱中浸提2小时。
3.1.3抽滤，去除沉淀，并量取所得上清的体积，计算提取液与新鲜植株体积重量比（W/V）。
3.1.4取少量测定其酶活和蛋白含量。将其中过氧化物酶酶活最高的一种植物提取液用来做下面步骤的提取纯化工艺研究。
3.1.5传统盐析方法：将一份上清液按226g/L加入（NH4）2SO4盐析，于冰箱中静置1h，5000rpm低温离心10min去除沉淀，上清液再按258g/L加（NH4）2SO4盐析，冰箱中静置过夜。以5000rpm低温离心，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，透析除盐。酶液在搅动下沿着杯壁按1:1加入预冷（－15℃）的丙酮，冰箱中静置30min。低温离心去沉淀。再按上清液与丙酮之比为1:0.8再次加入预冷丙酮，冰箱静置30min后低温离心收集沉淀，加少量水溶解，透析去除丙酮。量取酶液体积，测酶活和蛋白含量。（过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），且在0.58饱和度以下的硫酸铵溶液中可溶，而在0.62饱和度以上不溶，可据此用分步盐析的方法，再用有机溶剂丙酮进行分步沉淀）
3.1.6双水相萃取方法：一份上清液在搅动中缓慢加入试剂使形成12％（W/V）PEG4000-12％（W/V）（NH4）
2SO4体系，充分搅拌至溶解。转移至分液漏斗中静置萃取2h，取下相（盐相），测酶活和蛋白含量。
3.2：根据步骤1所得到的试验结果选择过氧化物酶含量最高的植物为试验材料进行正交实验。具体步骤
如下
3.2.1：制备粗酶液（见3.1.1 3.1.2 3.1.3）并测酶活。
3.2.2：取9份相等量的粗酶液，并记录粗酶液体积，编号1-9。
3.2.3：按表3-1加入相应的试剂,并搅拌至充分溶解。
表3-1
3.2.4：转移至分液漏斗中静置萃取2h，取下相（盐相），测定酶活和蛋白含量。
3.2.5:计算过氧化物酶在两相之间的分配系数，通过数据处理，找出PEG浓度和硫酸铵浓度这两个因素
中的主要因素，并找出通过正交实验得到次要因素的最佳水平。
3.3：对步骤2所得到对过氧化物酶在两相中分配系数影响最大的因子进行单因子多阶实验，以进一步扩
大过氧化物酶在两相中的分配系数。具体流程如下：
3.3.1：制备粗酶液（见3.1.1 3.1.2 3.1.3）并测酶活。
3.3.2：取3份相等量的粗酶液，并记录粗酶液体积，编号1-3。
3.3.3：按表3-2条件加入相应的试剂,并搅拌至充分溶解。
表3-2
（根据表3-1实验结果知硫酸铵浓度为主要影响因素）
3.3.4：转移至分液漏斗中静置萃取2h，取下相（盐相），测定酶活和蛋白浓度。
3.3.5：计算过氧化物酶在两个相中的分配系数，找到在上相的最大分配系数和在下相的最大分配系数所对应的因素水平。
3.4：采用PEG6000验证双水相效果，具体流程如下：
3.4.1：制备粗酶液（见3.1.1 3.1.2 3.1.3）并测酶活。
3.4.2：取3份相等量的粗酶液，并记录粗酶液体积，编号1-3。
3.4.3：按表3-3条件加入相应的试剂,并搅拌至充分溶解。
表3-3
3.4.4
3.4.5：计算过氧化物酶在两个相中的分配系数，找到在上相的最大分配系数和在下相的最大分配系数所对应的因素水平。
3.4根据步骤3的试验结果，配合适当的工艺流程进行实验，具体步骤如下：
3.4.1：制备粗酶液（见3.1.1 3.1.2 3.1.3）并测酶活。
3.4.2：按步骤3.3得到的最佳双水相体系进行双水相萃取。
3.4.3：静止分相后取下相，记录下相体积。
3.4.4：超滤（截留分子量10KD）除去硫酸铵和PEG4000，取浓缩液。
3.4.5：浓缩液过Sephadex G-75凝胶（层析柱为1.6cm*50cm），进一步除去杂质蛋白。采用记录仪记录相应数据。
3.5：电泳分析
将酶的粗提液、双水相萃取下相组分、超滤所得浓缩液、凝胶过滤所得POD溶液四种溶液，采用PAGE进行分析。（分离胶浓度10%、浓缩胶浓度3.75%，分离胶段电流18mA,浓缩胶段电流10mA）
附：酶活、酶蛋白浓度的测定方法
A：酶活的测定
将各酶液适当稀释，利用过氧化物酶在过氧化氢存在下能催化愈创木酚反应形成有色物质的特性，按附表1进行各样品酶活性的测定。
附表1 酶活测定的操作（各试剂加入量单位为ml）
在37℃保温10min。管1作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2和管3，即倒入比色杯中进行470nm光吸收的时间扫描，读取30或60或90秒（直线部分）的O.D.值。按下列公式计算出酶比活及总酶力。
酶比活＝（O.D.470nm×稀释倍数）/（蛋白含量mg×时间min）
酶总活力＝比活×酶蛋白量
B：酶蛋白浓度测定:采用考马斯亮蓝G-250方法和紫外分光法测定酶蛋白浓度。
a：考马斯亮蓝G-250方法既标准曲线法，先在一定的蛋白浓度范围内取一定数目的点，利用考马斯亮蓝G-250与蛋白质反应使之形成蓝色络合物，利用分光光度记测定595nm处吸光度，作出标准曲线。
b：紫外分光法方法如下：将各待测酶液适当稀释在紫外光区进行吸收光谱扫描，读取280nm和260nm 处的O.D.值，用以下公式计算
蛋白浓度（mg/ml）=（1.45A
280－0.74A
260
）×稀释倍数
蛋白含量（mg）＝蛋白浓度×酶液体积
4.结果与讨论
4.1预实验
测得萝卜中过氧化物酶含量为10.89u/g，萝卜中蛋白含量为 1.85mg/g，萝卜中过氧化物酶的比活为5.89u/mg。
通过PEG种类选择预实验发现PEG4000和PEG6000较适合过氧化物酶的提纯且差别不大，由于PEG6000的黏度较PEG4000要大，工艺放大较不方便，故采用PEG4000进行研究。
4.2正交实验确定影响过氧化物酶纯化倍数和回收率的主要因素
考虑PEG4000浓度和（NH4）2SO4浓度两个因素，根据PEG4000/（NH4）2SO4相图选择适当的水平进行两因素三水平的全阶实验，共9组实验（整个双水相体系重20g,其中原酶提取液占5g）。结果见表4-1：（纯化倍数和回收率以双水相下相数据计算）
表4-1
由于要考察多重指标，结合现代生物统计原理和优序计算权重系数法则设定双水相系统萃取整体效果好坏评分依据：
Total score=纯化倍数*回收率
（1）极差分析图（图4-1）：（1为PEG 浓度极差，2为（NH 4）2SO 4浓度极差）
图4-1
（2）方差分析（见表4-2）
表4-2
4）2SO 4浓度占主要因素。 4.3梯度放大实验
固定PEG4000浓度为正交实验最佳浓度（15%
W/W ），取正交最佳（NH 4）2SO 4浓度及上下各一个浓度梯度，将双水相体系由原来的20g 放大到100g 。结果见表3：
表4-3
通过该实验发现12%的（42410%（NH 4）
2
SO 4浓度的高，针对这个问题可以采用二次萃取来解决。
4.4PEG6000梯度实验验证
通过预实验发现过氧化物酶在PEG6000/（NH 4）2SO 4和PEG4000/（NH 4）2SO 4中的分配较为相似，故采用PEG6000/（NH 4）2SO 4体系考察实验结果的可信度。 结果见表4（PEG6000浓度固定为15%）：
表4-4
4.5超滤
利用PEG4000（15% W/W ）/（NH 4）2SO 4（12% W/W ）(双水相体系重量500g 原酶液量125g)双水相萃取所得下相物质进行超滤（截留分子量10000），结果见表5：
表4-5
采用Sephadex G-75凝胶、15mm*50mm 层析柱、1ml/min 的洗脱速度、300min 的洗脱时间进行凝胶过滤，并利用自动记录仪记录实验结果，结果见图4-2：
图4-2
合并过氧化物酶酶的试管，冷冻干燥后用适当蒸馏水稀释测定其酶活。得凝胶过滤步骤过氧化物酶的回收率为92%。 4.7电泳分析
将原酶液、双水相+超滤后浓缩液、凝胶过滤后酶液用PAGE 分析，其结果见图3：
图4-3
5.结论与展望
5.1工艺流程数据分析表（表5-1）
表5-1
5.2结论及前景展望
采用PEG4000（15% W/W）-硫酸铵（12% W/W）双水相体系结合超滤（截留分子量为10000）和凝胶过滤从萝卜提取液中提纯过氧化物酶能使过氧化物酶纯化使18.7倍，得到的过氧化物酶比活为110u/mg，该方法具有反应条件要求温和，不需要低温操作，总酶活回收率高，及整个流程可以实现循环等优点，具有较好的工业化前景。
致谢
本论文是在吴元喜老师的悉心指导下完成的。从论文的选题、文献查阅、实验设计、实验开展到撰写论文的整个过程中，倾注了吴元喜老师大量的心血，使学生倍受鼓舞并表示无限的感激。吴元喜老师渊博的知识、丰富的研究经验、严谨的治学态度和不断创新进取的精神，更使我由衷的钦佩，这将永远激励着学生更加努力的学习和工作。
在一个多月的时间里，实验室的各位老师给予了我许多热情的帮助。在这里特别感谢刘凌老师、刘幸福老师和周爱文老师、谢青老师在实验仪器和药品方面给予我的支持和帮助。同时也要感谢05级的生化实验小老师们在药品方面给予我的帮助，在此一并表示感谢。
最后感谢家人多年来对我一如既往的支持！
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溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
年产5000吨乳酸工厂车间设计 乳酸是世界上应用广泛的三大有机酸之一，目前生产乳酸主要采取的方法有传统发酵工艺以及固定化微生物法、电渗析连续发酵法、萃取发酵法、膜法发酵法、吸附发酵法、同时糖化发酵法等新工艺，在工业生产中多采用微生物发酵法生产L-乳酸。乳酸的提取精制是乳酸生产中非常重要的步骤，工业生产中常用的乳酸提取工艺主要有：钙盐法、锌盐法、离子交换法、溶剂萃取法和电渗析法等。本设计采用德式乳杆菌为菌种，以大米为主要原料，麸 作为乳酸中和剂和发酵液皮为辅助原料经糖化发酵并行式来生产乳酸。在发酵时加入CaCO 3 稳定剂，得到的发酵液经预处理→浓缩→冷却结晶→洗晶→离心分离→乳酸钙结晶→溶晶→酸解→过滤→脱色等一系列步骤得到粗乳酸；粗乳酸先经浓缩再经离子交换法（先通过732阳离子交换柱再通过331阴离子交换柱）得到纯乳酸。 根据上述工艺流程，在进行乳酸工厂提取车间设计时，根据工厂的实际生产工艺和产能采取最优的提取工艺，通过对乳酸生产平衡、设备平衡和能量平衡等的计算，选取相应的生产设备，合理布局设计，使生产操作可靠性、方便性达到生产要求，降低成本，最终使生产效益最大化，并设计出合理的工艺流程图、设备结构和布置图以及全厂平面布置图。 关键词：发酵工艺；乳酸提取车间；工厂设计 1
目录 1 绪论 (1) 1.1 乳酸的概况 (1) 1.1.1 乳酸的理化性质 (1) 1.1.2 乳酸的工业生产 (2) 1.1.3 乳酸的用途及功能 (2) 1.1.4 乳酸的质量检验与储存 (3) 1.2 乳酸的发酵方法 (3) 2 生产工艺 (5) 2.1 发酵工艺 (6) 2.1.1 发酵工艺流程及特点 (6) 2.1.3 发酵工艺操作要点及注意事项 (7) 2.2 提取精制工艺 (8) 2.2.1 提取工艺流程及特点 (8) 2.2.2 提取工艺条件 (8) 2.2.3 提取注意事项以及工艺操作要点 (8) 3 工艺计算及设备选型 (11) 3.1 发酵工段 (11) 3.1.1 物料平衡计算 (11) 3.1.2 设备计算及选型 (12) 3.2 提取工段 (12) 3.2.1 生产平衡计算 (12) 3.2.2 设备平衡计算及选型 (13) 4 车间布置设计 (15) 4.1 设计依据 (16) 4.2 车间布置（厂房平面布置） (16) 4.2.1 车间布置设计原则 (16) 4.2.2 车间平面布置 (17) 4.2.3 车间立面布置 (17) 4.2.4 设备布置 (17) 结论 (17) 2
天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术 酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。
植物酯酶提取工艺： （1）酶活测定条件的优化，如pH值，时间，底物浓度，显色剂用量及浓度等。 （2）植物酯酶或胆碱酯酶的溶剂提取条件的确定如：溶液的种类、固液比、温度、时间等。（3）纯化条件如超滤、凝胶、离子交换等条件的确定。 （4）经纯化后的纯酶的酶学性质如：热稳定性、pH稳定性、金属对酶活性的影响。 1、标准曲线的绘制 称取0.0036gα-萘酚（分子量：144.17），溶解于无水乙醇中，定容至100mL，得0.25mmol/L溶液。 分别移取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mLα-萘酚溶液，用磷酸缓冲液稀释至10mL。 在各比色管中分别加入0.5mL0.08%固兰B盐3.6%SDS显色剂，置于30℃恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。 用测得的结果做标准曲线。 1）PH的影响 磷酸缓冲液：6、6.5、7、7.5、8 比较：以缓冲液为空白作基线，固兰B盐+缓冲液扫描，求出A0，比较大小。 不同PH条件下，各最大吸收波长偏移情况，及A值大小。 不同pH条件下，其标准曲线线性 2）固兰B盐的浓度影响 1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.08%、0.02%等，求出A0，以缓冲液为空白作基线 不同浓度下，做标准曲线 将固兰B盐放置，每天测A。，估计能放置保存天数。 3）加入SDS浓度 0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、3.6空白，A0 取一中间浓度的扫描求最大吸收波长，及A 于冰箱及常温下放置，求A、A0 确定最佳浓度及固兰B盐能放置的时间。 取0.5mL稀释酶液，加入4.5mL缓冲液（可定容至5mL），加入0.5mLα- 乙酸萘酯溶液，30度，反应5min，缓冲液定容至10mL，加入0.5mL固兰B盐，置于30℃恒温水浴5min 1)乙酸萘酯乙醇溶液浓度影响 0.04、0.02、0.015、0.0005等测（萘酯+显色剂）A0，及A，最大吸收波长 2）加入乙酸萘酯溶液体积的影响 4）最后恒温水浴时间、温度的选择 5）初始缓冲液pH选择 6）酶液的稀释倍数 于固液比（1：7）水,于35度，150rpm ,振荡30min提取，4度， 1）固液比
2011届本科毕业生毕业论文 题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 作者姓名徐萧苟真汪磊 指导教师刘秀丽 学科专业生物技术 系别生命科学与技术学院 学号2007221121 2007221102 2007221115 提交论文日期2011年6月2日
PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 徐萧苟真汪磊 指导老师：刘秀丽 （陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000） 摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。 关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PH Ph, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme Activity Xuxiao gouzhen wanglei （Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes in Qingyang 745000） Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effect Keywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH; 0引言 溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶
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年处理2000吨板蓝根药材提取车间工艺设计 摘要 板蓝根是我国一味传统中药，是大青叶、菘蓝等的干燥茎、根，始载于《神农本草经》，在我国有着悠久的临床治疗历史。板蓝根中可提取出多种化学成份，如:靛蓝、靛玉红、氨基酸、有机酸等有效物质，能够有效防治流行性乙型肝炎、急慢性肝炎、流行性腮腺炎、骨髓炎等病症，在抗菌、抗病毒、抗免疫系统疾病方面也有着很好疗效。 板蓝根颗粒剂因为其方便有效特点应用较广，本文将结合国家GMP 车间设计相关规定，设计板蓝根提取车间。主要对板蓝根颗粒剂的前处理和提取工艺进行讨论优化：前处理的工艺选择，水提醇沉与醇提水沉的优缺点，用正交试验法优化选出板蓝根提取的最佳工艺，设计提取车间工艺流程。按照设计任务书给出数据进行物料衡算与热量衡算，计算车间的生产处理能力，根据计算结果进行设备选型，使满足车间生产要求。最后进行车间平面布置，车间将按照传统四层设计。车间的辅助设施设计也要符合国家规定，三废排出、安全防护等方面也会根据车间特点进行相应布局。 关键词板蓝根；提取；浓缩；车间设计
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
酶法提取原理 摘要：简要介绍了酶法提取的基本原理、特点及提取速率的影响因素，结合酶法在提取有效成分中的应用实例和与其他技术的联用，对酶法在中药提取领域的前景进行展望。 关键词：酶法；中药提取；综述 中药是中华民族灿烂文明中一朵盛开的奇葩，有着几千年的悠久历史。中药成分复杂且很多贵重有效成分含量很低，因此中药开发中的关键工序即为如何有效地提取中药中的有效成分。传统提取方法如煎煮、回流、浸渍、渗漉法，存在着周期长、工序多、提取率不高等缺点。酶作为一种生物催化剂，在中药提取中，对中草药细胞壁的有效成分进行分解破坏，从而降低传质阻力，提高提取率；可改变中药目标产物的生理生化性能，优化产物效用，并且酶法提取操作简单，条件温和，环保无毒，现已将其用于中药提取过程。本文就酶法的提取技术及其应用进展方面进行综述。 1酶法提取的基本原理 大多数中药为植物性草药，中药材中的有效成分多存在于植物细胞的细胞质中。在中药提取过程中，溶剂需要克服来自细胞壁及细胞间质的传质阻力。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质等物质构成的致密结构，选用合适的酶(如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶)对中药材进行预处理，能分解构成细胞壁的纤维素、半纤维素及果胶，从而破坏细胞壁的结构，产生局部的坍塌、溶解、疏松，减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力，加快有效成分溶出细胞的速率，提高提取效率，缩短提取时间[1]。 而且，在中药提取中酶法可作用于目标产物，改善目标产物的理化性质，提高其在提取溶剂中的溶解度，减少溶剂的用量，降低成本；也可改善目标产物的生理生化功能，从而提高其效用。 2酶法提取的特点 2.1反应条件温和，产物不易变性 酶法提取主要采用酶破坏细胞壁结构，具有反应条件温和、选择性高的特点，而酶的专一性可避免对底物外物质的破坏。在提取热稳定性差或含量较少的化学成分时，优势更为明显。杨云龙等[2]用酶法提取洋葱中黄酮类化合物，采用酶解法来处理洋葱皮，避免了因高温对黄酮类化合物结构的破坏，提高了黄酮类化合物的提取率。 2.2提高提取率，缩短提取时间
凝血酶的提取 凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，它由两条肽链组成，多肽链之间由二硫键连接。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在一定条件下凝血酶被激活并转化为有活性的一种蛋白质水解酶。分子量335800，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。 目前国内主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶，在经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物，顾深受广大用户的欢迎，将广泛应用于临床。由于临床使用该药日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，因此生产前景看好，只要原料有保证，技术过关，就可获得产品。 （一）原料及试剂： 1、动物血液：须选用新鲜的动物血液，防止混入其它杂志。盛血液的器具一定要干净。 2、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）：又名枸橼酸钠。无色晶体或粒状粉末。相对密度1.875。150℃时失去结晶水，温度再高则分解。溶于水，难溶于乙醇。本工艺中主要作抗凝血剂用，防止血液凝固。选用化学纯试剂。 3、醋酸：学名乙酸。无色澄清液体，有刺激气味。相对密度1.049，沸点118℃。溶于水、乙醇和乙醚。用于调节pH值。选用化学纯试剂。 4、氯化钠：白色立方晶体或细小结晶粉末。相对密度2.165，熔点801℃。味咸，中性。有杂质时易潮解。溶于水和甘油，难溶于乙醇。选用一级工业品。 5、氯化钙：白色立方晶体，易潮解，相对密度2.15，熔点782℃，沸点大于1600℃，溶于水、乙醇。本工艺中用作激活剂，选用分析纯试剂。 6、丙酮：无色易挥发、易燃液体。有微香气味。相对密度0.7893，沸点56.5℃。于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、树脂和橡胶。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物，化学性质活泼。本工艺中用作沉淀剂，选用化学纯试剂。 7、乙醇：又称酒精，无色透明易挥发、易燃的液体。有酒味和刺激辛辣滋味。相对密度0.789。沸点78.4℃。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸湿性，能与水形成共沸混合物。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物。本工艺中用来洗涤凝血酶，选用工业乙醇。 8、乙醚：又称二乙醚。是易流动的无色透明液体。有令人爽快的特殊气味，其蒸汽能使人失去知觉，甚至死亡。相对密度0.7135，沸点34.5℃。难溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶剂，极易挥发和着火。本工艺主要用于洗涤凝血酶，选用化学纯试剂。使用时，操作人员应注意防护，避免吸入，周围应杜绝明火并保持空气流通。 9、草酸钾：又名乙二酸钾。这里用于测定凝血酶活性，选用分析纯试剂。 10、标准纤维蛋白原：这里用于测定凝血酶效价，选购药检部门提供的标准品。 （二）凝血酶的提取工艺： 1、工艺流程：
中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法（如煎煮法。回流法、浸渍法。渗漉法等）在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多。提取率不高等缺点。近10年来，在中药提取方面出现了许多新技术、新方法，这些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。本文就这方面作一综述。 1. 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取（简称SC FEFE）是一种以超临界流体（简称SCF）代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行革取和分离的新型技术，其原理是利用流体（溶剂）在临界点附近某区域（超临界区）内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种SCF作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。常用的SCF为CO。，因为CO。无毒，不易燃易爆，价廉，有较低的临界压力和温度，易于安全地从混合物中分离出来。超临界CO。萃取法与传统提取方法相比，最大的优点是可以在近常温的条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能。 廖周坤等用不同浓度的乙醇作夹带剂，对藏药雪灵芝进行了总皂苷粗品及多糖的苹取试验，与传统溶剂萃取工艺相比较，收率分别提高至旧．9倍和 1．62倍。何春茂、梁忠云利用超临界CO。卒取技术从黄花蒿中革取所得的萃取物中杂质（蜡状物）含量低，青蒿素提纯精制简单，收率高产品质量好。雷正杰等利用超临界CO。流体萃取技术，对厚朴的有效成分进行萃取和分离，革取物为淡黄色膏状物，经分析该萃取物由厚朴酚等11个化学成分组成，其中厚朴酚和厚朴酚的相对含量高达46．81％和45．00％。葛发欢等探讨了从黄山药中萃取薯预皂素的最佳条件，同时进行了中试放大，证明应用超临界CO。萃取薯预皂素进行工业化生产是可行的，与传统的汽油法相比较，收率提高15倍，生产周期大大缩短，避免使用汽油有易燃易爆的危险。葛发欢等研究了超临界CO。萃取柴胡挥发油和皂苷的工艺，STh－CO。法提取柴胡挥发油，与传统水蒸气蒸馏法相比较，能大大提高收率，缩短提取时间，而挥发油组成一致，只是各成分含量有差异。原永芳等通过五因素一四水平正交试 验法，用超临界流体萃取技术对川穹的挥发油萃取条件进行了优化选择，结果最佳萃取条件为压力34．smPa，温度60℃，改性剂乙醇0．3ml，静态苹取时间10min，动态萃取量10ml，以水作为吸收。与水蒸气蒸馏法相比较，该法具有耗时少，提取安全等优点。 SCFE技术对于提取分离挥发性成分、脂溶性物质、高热敏性物质以及贵重药材的有效成分显示出独特的优点，但SCFE设备属高压设备，一次性投资较大，运行成本高，因此这一技术目前在工业生产中还难以普及。 2. 超声提取技术 超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散。击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、
中药提取车间设计的几点体会 中药提取是中成药生产过程中很重要的一环,它直接影响成品制剂的产量和质量。提取车间的设计除了应当满足现代药品生产的需要外,还应考虑中药所具有的特殊性。提取车间设计的优劣,对整个中药制药厂的生产至关重要。本文从植物药材的提取生产工艺及提取车间特点出发浅谈对中药提取车间设计的几点体会。 1正确的设计构思及规划在提取车间设计前,首先应确定其在厂区总平面中的位置。在总体布局上,应将提取车间原料进口靠近前处理车间,浸膏和半成品出口靠近制剂车间,出渣间门前应留有货流通道,中药提取车间的设计,要根据其投资的多少,来进行综合考虑。设计程序依次为:设计准备、厂区总平面设计、生产工艺的选择与方框流程图的确定、物料衡算、能量计算、生产工艺流程设计、设备设计与选型、设备平面与立面布置设计、非工艺设计、设计说明书编制、概(预)算书编制等[1]。由于许多中药提取是多品种、小批量的生产,而且缺乏提取实验研究报告以及物料、工艺参数,在设计方面存在着许多困难。在当前条件下可以参照以上设计程序,根据中药提取生产的许多共同点及国产提取设备的特点,做能适应当前生产的较粗放设计。中药提取生产包括中药的提取,提取液的分离、纯化、浓缩、干燥等工艺过程,向外散发水、酒精等溶媒蒸汽,影响周围环境,因此,在总图设计时将其尽可能布置在制剂车间的下风向。并且车间有大量的药材运进,又有大量的药渣运出,故将其尽量靠近厂区物流出入口,最好专门设置药渣的运出口。 2提取车间的总体布置提取车间布置要满足GMP规范要求,车间人流物流应满足总图对人流物流的要求,还要满足消防、环保、职业安全卫生的要求,同时要尽量减轻劳动强度。 车间布置应遵循一般工业厂房的布置原则,还要处理好以下问题: (1)提取车间一般有醇提和醇沉,应考虑车间的防爆;(2)提取车间产热产湿岗位较多,应考虑车间排热排湿;(3)提取车间运输量较大,应考虑减轻劳动强度;(4)浓缩液的后处理工艺。由
鸡蛋溶菌酶提取 溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶） 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 性质： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适 pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 作用： 溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。 提取工艺： （一）鸡蛋清中提取溶菌酶 方法一——食盐盐析 一．材料： 原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂） 仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机 二．工艺流程： 原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH 值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
科研训练论文(文献综述) （ 题目：土霉素生产车间提炼工段工艺设计学生姓名：宋世骏 学号：201220515013 学院：化工学院 班级：制药工程专业（2）班 2015年12月
土霉素生产车间提炼工段工艺设计 宋世骏指导教师：陈秋月 内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特，010051 摘要： 土霉素又称为地霉素或氧四环素，英文名称（Oxytetracycline），土霉素属四环素类抗生素，为广谱抑菌剂，许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体对本品敏感。肠球菌属对其耐药。其他如放线菌属、炭疽杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属、弧菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等对本品亦较敏感。土霉素是一种广谱类抗生素，有一定副作用，多年来由于土霉素和四环素类的广泛应用,临床常见病原菌对土霉素素耐药现象严重，包括葡萄球菌等革兰阳性菌及多数革兰阴性杆菌。目前，中国已成为世界上最大的土霉素生产国，尤其对畜用土霉素需求很大。到目前为止，提纯土霉素的方法有很多，在生产工艺中通过酸化、脱色、结晶、重结晶以及应用超滤-纳滤技术都可得到纯度较高的土霉素产品。本次设计为1600t/a土霉素提炼工段工艺设计；本文主要讲述土霉素在工厂车间里生产的过程，着重讲述提炼工段的土霉素工艺设计，以及对各类提炼方法的对比及应用。 关键词： 抗生素；生产工艺；物料流程；提炼 引言： （一）土霉素简介 1、中文名称：土霉素[1]
2、英文名称：Oxytetracycline 3、分子式：C22H24N2O9 4、分子量：460.43 5、结构式： 6、外观性状 土霉素又名氧四环素，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。 （二）土霉素生产与提炼 土霉素生产由发酵工段、酸化过滤、脱色结晶、离心干燥工段工艺组成，因为在土霉素发酵过程中产生大部分有机副产物，如色素、蛋白质等，所以需要对土霉素发酵液进行处理。到目前为止，提纯土霉素的方法有很多，在生产工艺中通过酸化、脱色、结晶、重结晶以及应用超滤-纳滤技术都可得到纯度较高的土霉素产品。土霉素原料药用药广泛，而且价格低廉，因此大量用于畜禽药以及饲料添加剂。为了制备高纯度的土霉素，我们需要研究高纯度土霉素碱[2]的生产工艺。把粗品土霉素碱用盐酸溶解后,加入黄血盐-硫酸锌进一步去除杂质,然后通过超滤去除热原及其他高分子杂质,最后调pH值重结晶得到高纯度的符合注射用标准的土霉素碱产品。在发达国家土霉素基本不再使用，即便是畜牧业也用的是高纯度无菌土霉素。所以我所研究的课题——土霉素车间提炼工段工艺设计变得尤为重要。 1、土霉素常用提纯方法 土霉素是龟裂链丝菌通过发酵合成的广谱抗生素，在发酵过程中,所产生的
第一节溶菌酶的提取 一、简介 1.Lz的结构及组成 溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特 别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四 图5-1 溶菌酶的分子结构 对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 2.Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。 （1）Lz的热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件
下稳定，在碱性条件下不稳定。 糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 （2）加工过程中的化学变化 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 （3）络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 3.Lz的用途 溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。 由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。 此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。 4.Lz的来源及分布 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类： （1）动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应
用酶法从虎杖中提取白藜芦醇的工艺流程图 45—50℃, PH4.8±0.2,沿壁缓慢 加入HCl调节PH值,轻轻搅拌 加复合酶增加收率原因：一是植物细胞壁被破坏，使内容物溶出率增加；二是白藜芦醇苷在复合酶的作用下被转化成白藜芦醇。 可用复合酶SPE—002、SPE—007醇提前和醇提后的酶解结果与单独进行乙醇提取得率进行比较。
从茶叶中提取茶多酚 过滤 提取物 酶提法优点： ○1可以软化植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出，提高收率；对茶叶进行复合酶法提取, 茶多酚提取率可达98 %以上; 酶解法提取的茶多酚中儿茶素相对含量较沸水提取的高出9 %～10 %。○2酶法提取茶多酚及多糖具有提取率高, 且茶多酚的主要活性成分———儿茶素氧化损失少, 原料茶叶不需粉碎○3节省时间，降低成本；
酶法提取红景天有效成分的工艺流程图 1、酶提法 红景天 SPE —001或007 提取物〈 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法优点： ○1可以使植物细胞壁破裂，使有效成分最大限度溶出，提高收率； ○ 2可替代水提醇沉工艺，节省时间，降低成本； ○ 3可降解红景天中的氨基酸、多肽、多糖、易于滤过。 每次分别为3、2、1小时 粉碎
1、酶提法 菊花 SPE — 007 提取物 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法、醇提法与水提法进行比较 SPE-007：主要用于破除植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出。SPE-006：主要用于提取液的沉清，加快滤过速度，降低成本。 加7倍量水 60℃水浸泡30min 40℃温水，PH ：4.8 活化5—10min 1∶10倍量水溶解酶 用水煎煮3h 温度降至45-52℃，PH ：3.5—4.5,时间1.5h 提取液 用SPE-006（干物 质重量）的40ppm
(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12 C N 103114082 B (21)申请号 201310069093.9 (22)申请日 2013.03.04 C12N 9/36(2006.01) (73)专利权人浙江工业大学 地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武 张岩 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人黄美娟 王兵 CN 1108381 C,2003.05.14, 陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈 阳化工学院院报》.2008, 卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化 学教学》.1995, M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的 方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0 并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获 得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与 滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物 在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解 离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使 其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原 材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、 生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工 业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件 审查员 孙彦珂 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤 1.鸡蛋清样品制备及粗分离 将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。 2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析 1.吸附： 将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。 2.洗涤、洗脱： 待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。 第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品 浓缩 1·透析除盐、去碱性蛋白： 4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀） 2·聚乙二醇浓缩： 盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液； 3·冷冻干燥： 用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。 溶菌酶纯度检测 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ①凝胶板的制备： 用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成； ②溶菌酶的处理： 用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上 ③电泳： 电流为10 mA，时间4 h； ④固定、染色和脱色： 电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗