白血病相关融合基因的检测及意义
白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。
白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、
PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。
BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。
Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年O`Riordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley发现缺失下来的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。
BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码P230的e19a2。其中b3a2和b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制剂（TKI）伊马替尼就是是通过结合抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶结构域来抑制其在细胞周期中的影响，从而发挥抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼和尼洛替尼也是在这个基础上进行改进，以以减少因伊马替尼使用而带来的抗药性。对费城染色体和BCR-ABL融合基因的检测，对于正确区分CML类型，指导临床治疗和判断预后情况具有重要的指导作用。
RUNX1（Runt-related transcription factor 1）基因也被称为AML1（acute myeloid leukemia 1）基因或CBFA2（core-binding factor subunit alpha-2）基因，RUNX1基因编码的RUNX1
蛋白是调控造血干细胞分化为成熟血细胞的转录因子，是RUNX（Runt-related transcription factor）家族或CBFα（core binding factor-α）的成员，能够与CBFβ蛋白形成异质二聚体复合物，增强DNA结合和复合物的稳定性。人的RUNX1基因全长260kb，在21号染色体
（21q22.12）上，有两个选择性转录启动子，能够通过选择性剪接形成多种转录异构体。全长的RUNX1蛋白由12个外显子编码形成，在这些外显子中，包含有两个结构域，分别被命名为RHD（runt homology domain）和TAD（transactivations domain），前者由2,、3、4号外显子编码形成，后者由6号外显子编码形成。RUNX1蛋白分别通过这些结构域来介导DNA结合和蛋白间相互作用。RUNX1的转录过程受两个增强子的调节，这些组织特异性的增强子能够结合淋系或红系调控蛋白，促进RUNX1基因在造血系统中的高度活化。
RUNX1在胚胎发育的造血过程中发挥着至关重要的作用，在所有的造血部位都有表达，能促进造血干细胞和造血祖细胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通过结合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受体c-Mpl的启动子，募集转录活化子或抑制子，进而促进造血干细胞的生成或向其他造血细胞方向分化。RUNX1还能够通过上调Smad6的表达来促进蛋白体降解。ETO基因又称RUNX1T1基因，编码的蛋白是一种锌指结构转录因子和癌蛋白。
AML1-ETO融合基因主要见于急性髓系白血病（AML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色体易位导致21号染色体的原癌基因AML1基因和8号染色体的ETO基因融合，形成
AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通过聚合酶链式反应（PCR）检测到，一般被认为其表达量极低或由于降解导致表达不稳定。AML1-ETO融合基因表达的蛋白全长含有752个氨基酸，其N端为RUNX1（runt-related transcription factor 1），也称AML1区；C端是8号染色体编码的RUNX1T1[runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin
D-related)]，也称ETO。
AML1-ETO融合基因主要发生在M2型AML患者中（约40%），在M2b的阳性率达90%，因而可以作为M2b分型诊断的重要分子标志，少见于M4和M1，极少数骨髓增生异常综合症（myelodysplastic syndrome, MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。临床上将
AML1-ETO融合基因作为分子分型诊断和预后观察的一个重要依据，AML1-ETO融合基因阳性的患者预后较好。AML1-ETO阳性的白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化为较成熟的嗜中性粒细胞核嗜酸性粒细胞，对化疗反应较为敏感，因而AML1-ETO融合基因阳性的患者采用大剂量的阿糖胞苷治疗，完全缓解率高达98%，5年存活率达到67%，预后较除M3外的其他亚型好。因而对初诊患者的AML1-ETO融合基因检测，对预后判断和治疗方案的制定具有重要意义。
PML（Promyelocytic leukemia）基因编码的PML蛋白，属于TRIM（tripartite motif）家族的成员，定位在核小体上，具有转录因子和肿瘤抑制蛋白的功能。PML的表达与细胞周期有关，能够调节p53对致癌信号的反应。RARα（Retinoic acid receptor alpha，维甲酸α受体）也叫NR1B1（nuclear receptor subfamily 1，group B，member 1）基因，能编码细胞核受体蛋白。维甲酸信号由两种细胞核受体家族转导，分别是RAR（retinoic acid receptor）和RXR (retinoid X receptor)，两者能够结合形成RXR/RAR异质二聚体。在没有配体存在的情况下，DNA结合的RXR/RAR复合物通过募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和组蛋白脱乙酰基酶来抑制转录过程的进行；当配体结合到复合物时，就能够诱导构像发生改变，允许募集共活化物、组蛋白乙酰基转移酶，使转录过程进行下去。
PML-RARα融合基因是急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的特异性分子标志，见于98%的APL患者中。APL患者的特异性细胞遗传学异常t（15；17）（q22；q21），导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因（PML）和17号染色体上的维甲
酸受体α（RARα）形成PML-RARα融合基因。正常的RARα等位基因编码野生型维甲酸受体，与维甲酸结合可以调节多个靶基因的转录。PML是POD（PML oncogenic domain）多蛋白复合体的核心组分，通过转录共激活作用，可以抑制肿瘤生长，在多种凋亡途径中起重要作用。形成PML-RARα融合基因后，维甲酸核受体基因表达受抑制，使维甲酸对靶基因的转录调节功能丧失；PML-RARα融合蛋白通过负显性抑制作用抑制早幼粒细胞分化成熟；PML去定位使POD的结构破坏，形成上百个细小颗粒分布在核及胞质中，正常的抑制增殖和促凋亡功能发生障碍，导致细胞大量增殖，凋亡减少，这些导致了APL的发生。形成PML-RARα融合基因的RARα部分断裂位点位于2号内含子上，而PML部分的断裂位点有三种，因此将
PML-RARα融合基因分为三类：1）PML断裂位点在6号内含子上的BCR1型（L型），占APL 患者的55%；2）PML断裂位点在6号外显子上的BCR2型（V型），占APL患者的5%；3）PML 断裂位点在3号内含子上的BCR3型（S型），占APL患者的40%。由于PML-RARα融合基因与APL发生的重要相关性，临床上已经将PML-RARα融合基因作为动态评估患者病情及预后的重要依据。
E2A基因编码蛋白能够与NeuroD形成二聚体复合物，调控多种基因的转录过程。PBX1（Pre-B-cell leukemia transcription factor 1）基因编码的转录因子PBX1能够与HOXB1、MEIS1和HOXB7等蛋白相互作用，形成复合物，结合到DNA上，促进转录过程的进行。临床中发现的E2A-PBX1融合基因是由t（1；19）（q23；p13）易位形成的，编码的融合蛋白中E2A氨基端转录活化域结合到PBX1同源结构域蛋白的DNA结合域上，是急性淋巴细胞白血病（ALL）中常见的染色体畸变，见于3-5%的儿童ALL患者和3%左右的成人前B-ALL患者中，在儿童前体B细胞ALL（precursor-B ALL）患者中20-~25%可以检测到E2A-PBX1融合基因阳性。E2A基因13号外显子和PBX1的2号外显子断裂后相连接，形成E2A-PBX1融合基因，同时在5-10%的E2A-PBX1融合基因阳性患者中发现连接点处有27个核苷酸的突变，编码出两种不同的蛋白P85和fy77，两者只在PBX1部分的羧基端存在差异，并都具有转化特性，属于癌蛋白。近年来随着化疗方案的改进，对于E2A-PBX1融合基因阳性的ALL儿童采用更强烈的化疗方案，可以改善其预后，5年无病生存率（EFS）已达89.5%。E2A-PBX1融合基因阳性和预后关系不明显，但是可以作为ALL和微小残留病变（MRD）诊断分子标志。
DEK癌基因编码的蛋白具有一个SAP结构域，该蛋白能够结合到十字形和超螺旋DNA 上，诱导闭环DNA出现超螺旋结构，并且与mRNA形成中剪接位点的选择密切相关。该区域的染色体异常会增加DEK基因的表达，产生针对DEK蛋白的抗体，引起多种疾病。CAN 基因又称为Nup214（Nuclear pore complex，核孔复合物）基因，它编码的核孔复合物蛋白是延伸通过核膜的主要结构，形成一个能够调节大分子在细胞核与细胞质之间流通的通道。CAN基因编码的蛋白定位在核孔复合物的细胞质一面，是细胞周期和核质转运正常运行的必要调节。
DEK-CAN融合基因是由V on Lindern等人在1990年研究发现的t（6；9）（p23；q34）易位，导致6号染色体上的DEK基因和9号染色体上的CAN基因融合形成的。CAN基因的3’部分和DEK基因的5’部分发生融合，在6号染色体短臂上产生DEK-CAN融合基因，转录形成一个异常的5.5kb的mRNA。DEK-CAN融合基因主要见于急性髓系白血病（AML）的M2型和M4型中，也见于M1型，且常常是唯一存在的核型，发生率为0.5%~4%，这种异常也存在于MDS的难治性贫血伴原始细胞增多症（RAEB）中。伴有这种染色体异常的患者的年龄一般比较轻，且预后较差。对于DEK-CAN融合基因的检测，有助于辅助诊断分型和判断预后。
SIL-TAL1融合基因仅见于急性T淋巴细胞白血病中（T-ALL），约占26%，由1p32的部分缺失形成，是T-ALL的特异性克隆标志，是儿童T-ALL患者中最为常见的一类染色体异常，在儿童患者中出现的频率要远高于成人患者。由TAL1基因的5’端丢失，与SIL基因的5’端融合，形成SIL-TAL1融合基因，TAL1编码序列在SIL启动子的调控下在T细胞中表达。SIL基
因转录产生的mRNA存在于整个细胞周期中，其编码的含有1283个氨基酸的胞质蛋白，在细胞进入G2期时积累，在细胞周期完成时降解。而SIL-TAL1融合基因的形成，引起了细胞周期调控的异常，导致白血病的发生。临床上SIL-TAL1融合基因的检测可以辅助分型诊断和MRD的监测。
CBFβ（Core-binding factor subunit beta）基因编码的蛋白是二聚体核结合转录因子的beta 亚基，属于PEBP2/CBF转录因子家族，基因特异性的调控造血过程和成骨作用的进行。CBF β蛋白亚基是一个非DNA结合亚基，它通过别构作用增强DNA和alpha亚基的结合，并使结合后的复合物结合到多种增强子和启动子的核心区。CBFβ基因能够选择性剪接形成两种mRNA，每种编码不同的羧基末端。MYH11基因编码的myosin-11蛋白是一种平滑肌肌球蛋白，属于肌球蛋白重链家族，是一个包含2条重链亚基和2对轻链亚基的六聚体蛋白亚基，能够通过A TP的水解来将化学能量转换为动能。
CBFβ-MYH11融合基因是在多为AML-M4伴嗜酸性细胞增多症，但亦可见于其他类型，如M1、M2、M4、M5、M7和慢性髓系白血病(CML)急变，是由inv（16）（p13；q22）导致16号染色体长臂的核心结合因子（CBF）β链基因和短臂的MYH11基因发生融合形成的，见于8-9%的初诊AML患者中。它具有CBFβ-MYH11和MYH11-CBFβ两种形式的融合基因，其中前者对M4EO的致病可能具有重要作用。研究显示CBFβ基因的断裂位点靠近3’端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，能形成10种以上的不同剪接体重排，同时这些重排仍然保持着融合基因转录本的开放阅读框，常见的三种剪接体为A型，D型和E型。85%的CBFβ-MYH11融合基因阳性患者为A型，D型和E型各占5%。
CBFβ-MYH11融合基因的产生能够促进白血病的发生，但是含有CBFβ-MYH11融合基因的M4EO白血病患者预后较好。研究表明CBFβ-MYH11融合基因在患者治疗缓解后可以消失，所以该基因可以用于MRD的检测和预后判断。
MLL（Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia）基因编码转录共激活物，是一种组蛋白甲基转移酶，能够正调控基因转录过程，对早期发育过程的基因表达和造血功能具有不可缺少的作用。虽然ML的功能仍有很多未能研究清楚，但是已有报道表明MLL在发育过程的细胞分裂中起着核心作用。同时MLL还是HOX基因上游转录调控因子，HOX基因在造血生成中发挥关键的作用，当MLL蛋白功能异常时，HOX基因表达下调，进而影响正常造血功能。
混合谱系白血病（Mixed Lineage Leukemia，MLL）基因重排发生在11号染色体2区3带，MLL蛋白包括三个功能区，分别是转录抑制区、转录激活区和DNA结合区。MLL基因重排使得AT钩区和锌指结构之间的序列发生断裂，在DNA修复时与其他基因发生融合。MLL基因重排涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合基因，常见的MLL重排形成的融合基因有MLL-AF4、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-F10、MLL-ENL、MLL-ELL等。
MLL-AF4融合基因由t（4；11）（q21；q23）易位形成，是前B-ALL中最为常见的11q23易位，由MLL和AF4基因融合形成，具有6种不同的剪接体，分别为e9e5、e9e4、e10e5、e10e4、e11e5、e11e4。MLL-AF4融合基因在不同年龄段的发生率不同，婴儿ALL中最多见，发生率为40-60%，在儿童和成人中较低，约为5%。在婴儿ALL中检测出MLL-AF4提示预后良好，而相反若在成人ALL中检测出MLL-AF4则提示预后较差。在小儿ALL中出现MLL-AF4时，年龄的不同预后并不一致。MLL-AF6 融合基因由t(6;11)(q27;q23)易位形成，主要发生在AML的M4和M5a分型中，在儿童AML患者中的比例为2-5%，成人患者中较少出现。
MLL-AF9融合基因由t(9;11)(p22;q23)易位形成，是11q23异常中最常见的易位形式，主要出现在AML的M5a患者中，在儿童AML患者中发生率为8-10%，在成人中为1-2%，总的预后良好，但是患者的年龄等各种指标的差别也决定预后的差异。根据报道，含有MLL-AF9的小鼠能够导致AML的发生，但单纯的MLL基因异常不会导致白血病发生，表明MLL重排形
成融合基因或有伙伴染色体基因的参与是白血病发生的必需条件。MLL-AF10融合基因由
t(10;11)(p13;q23)易位形成，主要见于儿童AML-M5患者中，预后不良，且变异复杂易位更常见。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成，在AML患者中的发生率较低，已有报道显示其主要在M5a分型中出现，以成年人为主，预后不良，2年无病生存率50%。MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可见于前B-ALL、前T-ALL、M4、M5、M1、M2多种白血病中，以婴幼儿患者为主，发生率较低。因此对MLL重排形成的这些融合基因的检测，对临床的分型诊断、治疗及预后判断都具有重要价值。
TEL基因又称为ETV6基因，定位在12号染色体短臂上，能够编码ETS家族转录因子，编码的蛋白包含两个功能结构域：能够与其他蛋白相结合的PNT结构域和C末端DNA结合结构域。对小鼠的TEL基因进行Knockout实验，研究结果发现该基因对造血能力和血管网络发生的维持必不可少。TEL-AML1融合基因是儿童白血病常见的融合基因，由t（12；21）（p13；q22）易位，导致12号染色体上的TEL基因与21号染色体上的AML1基因融合形成，见于25%的前体B细胞ALL，在儿童的普通ALL中也有较高的表达（10~20%），未见于成熟的B-ALL 和T-ALL中。TEL和AML1编码对正常造血功能具有关键作用的核酸转录因子，融合基因的形成扰乱了TEL的正常功能，并形成转录抑制子抑制AML1靶基因的表达，最终导致白血病的发生。目前已报道的转录亚型有两种：较多的是TEL的5号外显子与AML1的2号外显子结合（90%），较少的是TEL的5号外显子与AML1的3号外显子结合（10%）。对于TEL-AML1阳性的ALL患者的预后情况现在仍然存有争议，但是有报道认为TEL-AML1融合基因对患者的4年无病生存率相关，是预后良好的重要指标。因而临床中对TEL-AML1的检测，主要用于对辅助ALL分型，监测MRD和预后情况。
目前，临床或实验室用于白血病相关融合基因检测的方法有多种，常见的包括如荧光原位杂交（FISH）、巢式RT-PCR、实时定量RT-PCR、多重RT-PCR+寡核苷酸芯片等。
荧光原位杂交（FISH）技术是通过标记荧光素的单链DNA（特异性探针）和与其互补的DNA（标本）杂交，通过荧光信号的数量和位置反应标本相应特异性基因的情况。用于白血病相关融合基因的检测中，FISH定量准确、形象直观、特异性较强，但是对操作要求较高，成本较高，灵敏度最高达10-2，不能满足临床对于白血病和MRD检测水平的要求，应用受到限制。
实时定量RT-PCR（Real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）技术检测白血病融合基因的方法，是在实时定量PCR的基础上，增加逆转录过程，可用来检测融合基因的mRNA水平。
实时定量PCR技术是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，并使它们发出的荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长，通过荧光探测仪实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果，可以直接检测目的基因的起始数量。实时定量PCR技术中SYBR Green法和Taqman探针法两种最为常用：前者采用SYBR Green染料来监测扩增过程，随着扩增反应的进行，游离状态不发荧光的SYBR Green染料非特异性结合到DNA双链中产生荧光；后者采用Taqman探针，该探针能被Taq酶水解，探针的5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团，当两个基团靠近的时候报告基团不发出荧光，随着扩增反应的进行，5’端的报告基因由于探针被水解而脱离下来而产生荧光。SYBR Green法价格便宜，能够和任意的模板引物搭配，但容易受到非特异性扩增的影响；Taqman 探针法更为准确，但是必须设计特异性的探针与引物模板配合，价格较贵。
实时定量RT-PCR技术将逆转录过程和PCR过程结合起来，无需开盖，一步法操作，减少污染机会；操作简便、特异性强、灵敏度高；扩增过程中闭管操作，实时数据监测，降低了污染机会，减少假阳性结果；无需电泳，大大缩短了操作时间，减少了操作的繁琐；通过定量内参基因来评价操作质量，减少了假阴性结果。该方法成本也较低，适合在临床应用中
开展。
巢式RT-PCR是一种变异PCR，使用两对PCR引物扩增同一个片段。第一对PCR引物扩增和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，引物它们结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增片段。巢式PCR特异性强，如果第一次扩增出错，则第二次继续进行扩增的概率极低，但是最后的结果需要用电泳实验观察，总体流程繁琐，无法准确定量检测白血病融合基因。
多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片检测方法，是在巢式RT-PCR的基础上，在两轮PCR中都平行设置针对多组融合基因的引物，同时检测多种融合基因的剪接体，所有基因的第二轮上游引物在合成时用荧光素在5’端进行荧光标记，所有分型探针再3’端进行氨基修士。这样经过多重巢式PCR，一次可以扩增出多种可能存在的融合基因，再与所有分型探针在芯片上杂交，鉴定具体的融合基因类型。该方法灵敏度较高，能够同时检测多种融合基因，但成本较高，操作较为复杂。
2008年WHO关于白血病分型的标准中将BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO融合基因等一些常见的染色体异常归纳入白血病基本诊断标准，更说明了对这些融合基因的检测，对于白血病的诊断和治疗具有重要的意义：检测结果不仅可以为白血病诊断分型和预后判断提供重要依据，减少人为主观的判断，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化，同时也是白血病微小残留病变（MRD）检测的基础，对白血病的临床个性化治疗的开展具有重要的推动作用。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910118948.X (22)申请日 2019.02.18 (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南 路1023号-1063号 (72)发明人 李玉华 胡宇行 常宁 贺艳杰 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 范盈 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 不同位点白血病MEF2D-BCL9融合基因寡核 苷酸的检测方法及检测试剂盒 (57)摘要 本发明是一种用于检测不同位点白血病 MEF2D -BCL9融合基因检测方法及试剂盒，包括检 测体系PCR反应液、引物对、探针、阳性对照品和 阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针 技术检测患者体内MEF2D -BCL9融合基因的表达 情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴 定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特 点。 权利要求书2页 说明书7页序列表3页 附图2页CN 109593861 A 2019.04.09 C N 109593861 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109593861 A 1.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的检验试剂盒，所述检验试剂盒中包括检测用引物、探针，其特征在于： 检测目的基因用上下游引物分别为：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中， 序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 221-1055-F:GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.10 221-1055-R：ACCTGAAATTCGAGGATTCTGTGT SEQ ID No.11 221-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCCCTGTTGGAA-BHQ1 SEQ ID No.12 ABL1-F:GTGAGTGACATAGCCTCATGTTC SEQ ID No.13 ABL1-R:GCAGGCGTGCTCGTGAAAT SEQ ID No.14 ABL1-Probe:Quasar670-TCAGGGAGGGTTAGGAAAACCAC-BHQ-plus SEQ ID No.15。 2.根据权利要求1所述的检验试剂盒，所述检验试剂盒中还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照品为含有MEF2D-BCL9 Variant 1，MEF2D-BCL9 Variant 2，MEF2D-BCL9 Variant 3，MEF2D-BCL9 Variant 4；所述阴性对照品为去离子水。 3.一种用于不同位点MEF2D-BCL9融合基因的引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括：202-968-F、202-968-R、221-968-F、221-968-R、202-1055-F、202-1055-R、221-1055-F、221-1055-R，探针为202-968-Probe、221-968-Probe、202-1055-Probe、221-1055-Probe，检测内参基因ABL1用引物为ABL1-F、ABL1-R，探针为ABL1-Probe；其中，序列信息 202-968-F：GCAGCCAGCACTACAGAGGA SEQ ID No.1 202-968-R：CTCTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.2 202-968-Probe：FAM-CCCCACCTCCTACAGCCAGCC-BHQ1 SEQ ID No.3 221-968-F：GTGACCTGAACAGTGCTAACGGA SEQ ID No.4 221-968-R：CTGGAGGCATGGTATAAGGTGT SEQ ID No.5 221-968-Probe：FAM-CCTGCCCCAGCCCTGTTGGTG-BHQ1 SEQ ID No.6 202-1055-F:CAGCCAGCACTACAGAGGAACA SEQ ID No.7 202-1055-R:CTGAGGGTTGGCATCGGAAC SEQ ID No.8 202-1055-Probe：FAM-CTGCCCCAGCGGCCAGCTA-BHQ1 SEQ ID No.9 2
一、Ph染色体相关白血病的检测 Ph染色体最初在慢性粒细胞性白血病（CML）中发现，其发生率达到90%以上，成为慢粒的细胞遗传学标志。该染色体是由于第9号染色体长臂3区4带（9q34）和22号染色体长臂1区1带（22q11）相互易位所致，其后果使位于9q34的原癌基因C-ABL和位于22q11的BCR基因发生融合，形成BCR-ABL融合基因，并表达为BCR-ABL融合mRNA，翻译成融合蛋白质。20世纪70年代以来，在部分急性淋巴细胞白血病（ALL）中也发现有Ph染色体，占ALL的5%（儿童）～25%（成人）。近年来由于PCR技术的不断发展，对Ph染色体阳性白血病的诊断和残留白血病细胞的检测有了很大的进展。 应用筑巢式逆转录酶/多聚酶链反应技术（RT/PCR）检测BCR—ABL融合基因转录本，发现了3种BCR-ABL异构体，这种异构体的形成是由于BCR基因断裂点的位置不同所致。慢粒患者在BCR基因的断裂点主要集中于经典的bcr区域，即M-BCR区域，而伴有Ph染色体急性白血病中，约50%的患者BCR基因断裂点与慢粒患者相同，而另50%患者的断裂点位于BCR 基因的第1个内含子，ABL基因的断裂点主要位于第1或第2个内含子，第22号染色体的断裂点位于M-BCR2内含子，即M-BCR第二外显子与ABL基因第二个外显子相融合（简称b2a2转录本）。如果断裂点于M-BCR第三外显子即形成b3a2转录本，如果BCR基因的断裂点位于基因的第一内含子，则形成e1a2转录本，后者主要见于Ph染色体阳性的急性白血病患者。 二、急性早幼粒细胞性白血病的检测 急性早幼粒细胞白血病（APL）患者中95%以上具有特异的染色体易位t（15；17）（q22；q21），易位的结果使第15号染色体长臂2区2带的早幼粒细胞白血病基因（PML）和第17号染色体长臂2区1带的维A酸受体α（RARα）基因形成PML-RARα融合基因转录本。由于该融合基因对APL具有高度特异性，因此可以作为APL诊断的分子标志。近年来各国科学家有在少数APL患者中陆续发现了变异型染色体易位t（5；7）、t（11；17）、dup（17）形成的NPM-RARα、PLZF-RARα、NμMA-RARα、STATSB-RARα融合基因，这对进一步研究APL的发生机制具有重要意义。同时在APL患者的鉴别诊断和治疗上具有积极的意义。 三、急性粒细胞性白血病（M2b）的检测 急性粒细胞性白血病（M2b）型患者中90%存在特异的t（8；21）（q22；q22）染色体易位，伴该染色体易位的白血病细胞具有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性和嗜酸性细胞，且对化疗反应较敏感。目前已经发现该染色体易位使8号染色体的ETO/MTG基因和21号染色体的AML1基因融合形成AML1-ETO融合基因，从而导致产生AML1-ETO嵌合转录子，这种异常转录因子有可能参与造血系统恶性肿瘤的发生，因此检测该融合基因转录本对急性粒细胞性白血病（M2b）型患者的诊断、微小残留病变监测等具有重要意义。 四、AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv（16）导致CBF-MHY11融合基因的检测 近年来的研究发现在AML-M4伴嗜酸性细胞增多症中inv(16)（p13；q22）的结果使16号染色体长臂的CBF（核心结合因子）β链基因和短臂的MYH11基因发生融合，形成两种形式的融合基因，即CBFβ-MHY11和MHY11-CBFβ融合基因，其中前者对M4Eo的致病可能更为重要。研究结果提示CBFβ基因的断裂点恒定于靠近3′端编码区的17个氨基酸处，而MYH11基因的断裂点存在着至少3种不同的方式，同进这些重排仍然保持融合基因转录本的开放阅读框架。与其他类型的白血病发生的分子机制相似，CBFβ-MYH11融合蛋白的产生将促使白血病的发生。特别有意义的是，本型白血病中的inv（16）与急性粒细胞性白血病（M2b）型中的t（8；21）（q22；q22）染色体易位分别累及CBFα和β链，进一步说明了转录因子异常在白血病发病机制中的特殊地位。 与用PCR检测CBFβ-MYH11融合基因时，必须检测所有可能的CBFβ-MYH11融合基因转录
白血病融合基因Last revision on 21 December 2020
bcr/abl融合基因 慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia,CML）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。在受累的细胞系中可找到Ph标记染色体或（和）bcr/abl基因重排。 基因结构 人abl基因位于9号染色体长臂，有1b、1a和2-11共12个外显子。转录始自1b或1a，形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb，合成的两种蛋白质分子量均约为145，前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。abl主要结构有N 端的肉瘤同源2(srchomology,SH2）、SH1。SH2结合磷酸化的酪氨酸残基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸残基，可结合DNA。abl蛋白参与细胞周期调节。在G0期，abl-Rb蛋白复合物与DNA结合。在G1→S转变过程中，Rb被磷酸化，abl与之分离，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促进转录，细胞进入S期。 bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第1-63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域：主要(major bcr,M-bcr）、次要（minor bcr,m-bcr）和μ（μ-bcr）区域。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。CML的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。bcr基因在ALL中大约2/3为m-BCR位点。Ph1染色体和bcr/abl融合基因是CML的分子基础，并可作为区分典型CML 和非典型CML的诊断指标。
白血病融合基因检测综 述 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
白血病相关融合基因的检测及意义 白血病是造血系统的恶性克隆性疾病，由于造血干细胞受损，导致克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞具有自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，患者会出现不同程度的贫血、出血、感染和浸润的临床症状，严重危害生命健康。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，人们已经认识到大部分的白血病中都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，导致原癌基因或抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。现有报道的染色体畸变已有五十种以上，累及更多数目的融合基因，这些异常已经逐渐成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。 白血病相关融合基因的种类多样，常见的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。 BCR（breakpoint cluster region）基因是BCR-ABL融合基因的组成部分，与费城染色体（Philadelphia Chromosome）的形成有关，具有两种转录异构体。正常的BCR基因编码产物的功能还尚未清楚，它编码的蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是编码细胞质和细胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，与细胞分化、细胞分裂、细胞粘附、应激反应等生命活动相关。活化的ABL1蛋白通过SH3结构域受到负调控，SH3结构域的缺失会导致ABL1基因转化为癌基因。CDC2介导的磷酸化能够调节ABL1酪氨酸激酶的DNA结合活化过程，表明ABL1可能在细胞周期中发挥作用。 Nowell及Hungerford于1960年发现在慢性粒细胞性白血病（CML）患者外周血中有一个比G组染色体还小的近端着丝粒染色体，由于首先在美国费城（Philadelphia）发现，故命名为费城染色体。1971年O`Riordon利用荧光显带法确认费城染色体是第22号染色体长臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley 发现缺失下来的那部分通常易位到9号染色体长臂的末端，形成t（9；22） （q34；q11）。1982年Deklein等在费城染色体上首次发现了原来位于9号染色体长臂末端（9q34）的癌基因ABL1，证明费城染色体上有来自9号染色体长臂末端的片端，是22号染色体与9号染色体相互易位的产物。易位使9号染色体长臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22号染色体（22q11）上的BCR基因重新组合成融合基因，因而称为BCR-ABL融合基因。 BCR-ABL融合基因编码的融合蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，扰乱细胞内正常的信号传导途径，使细胞失去了对周围环境的反应性，并抑制凋亡的发生，影响细胞周期调控，导致骨髓造血干细胞过度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常见有四种剪接体mRNA：编码P210融合蛋白的b2a2和b3a2，编码P190的e1a2，编码 P230的e19a2。其中b3a2和 b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴细胞性白血病(ALL)中出现，而出现较少的e19a2根据2008年世界卫生组织（WHO）最新版的血液系统肿瘤分类标准，也应被诊断为CML。90%以上的CML患者血细胞中都发现有费城染色体的存在，主要为P210融合蛋白，因而费城染色体和BCR-ABL融合基因可以作为区分典型CML和非典型CML的诊断指标。同时在费城染色体阳性的ALL患者中，65%的成人和80%的儿童能够检测到P190融合蛋白阳性。由于BCR-ABL融合蛋白能够收到多种小分子化合物的抑制，临床上第一代针对BCR-ABL融
2009年4月第47卷第11期·论著· 急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AM L）是一种以造血干/祖细胞获得性突变为特征的恶性克隆性疾病，大约55%的成人病例在诊断时出现非随机的克隆性染色体异常，儿童病例的检出率更高，但正常核型检出率在AM L中达到40%～47%[1]。染色体畸变能在转录水平干扰造血调控、影响髓系细胞分化，因此快速、简便地获得患者染色体遗传缺陷的信息是临床亟待解决的问题。本研究采用多重RT-PCR方法一次可同时检测29种基因重排，提高了隐匿性染色体易位的检出率，用于初诊时的筛选，对临床分型、预后判断及指导个体化治疗具有重要价值。 1材料与方法 １．１对象 选取2006年1月～2008年11月山西医科大学第二医院及山西省儿童医院血液科门诊或住院AM L初治患者60例，男30例，女30例，年龄1～70岁，中位年龄35岁。所有病例均经临床、形态学、免疫学和组化染色确诊，分别为M1、M2、M3、M4各12例，M5、M6各6例。所有病例均进行了染色体核型分析。 １．２方法 1.2.1试剂和仪器TRIzol试剂盒购自美国Gibco/BRL公司；AM V逆转录酶、RNAsin、TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司。PCR扩增仪为美国Perkin-Elmer公司产品。 1.2.2细胞总RNA的提取和逆转录反应全部病例于初诊化疗开始前采取骨髓标本2～3mL，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，按Trizol一步法提取细胞总RNA，分光光度计测定A260值、A280值，以AM V逆转录酶系合成cDNA。引物序列参照文献[1]方法设计。逆转录广泛表达的转录因子（E2A）mRNA为内对照。1.2.3多重巢式RT-PCR两轮均平行设置8组含有混合引物的多重PCR，同时检测29种染色体易位和畸变所形成的86种剪接形式。每组检测的融合基因包括：第Ⅰ组inv（16）的CBF/M YH11；t（X；11）的M LL/AFX；t（6；11）的M LL/AF6；t（11；19） 正常核型急性髓系白血病患者融合基因的检测 赵瑾1*周永安1△苏丽萍1武坚锐2王恺1解菊芬1马莉1石磊3 （1.山西医科大学第二医院血液科；2.山西省儿童医院检验科；3.山西医科大学第二医院风湿科，太原030001） [摘要]目的探讨急性髓系白血病（AM L）患者染色体畸变所形成的易位相关融合基因的临床和实验的关系。方法采用多重巢式RT-PCR方法和染色体核型分析技术对60例AM L患者的融合基因进行分析。结果18例（30%）正常核型的AM L 患者分别检测出有PM L/RARα、AM L1/ETO、TLS/ERG、CBFβ/M YH11和M LL/AF9等5种融合基因的存在。结论多重巢式RT-PCR技术可用于白血病患者初诊时染色体畸变的筛选，可在核型正常的AM L患者中检出隐匿的染色体易位，对AM L 的诊断分型具有重要帮助，进一步指导临床个体化治疗。 [关键词]急性髓系白血病；融合基因；多重RT-PCR；正常核型 [中图分类号]R733.7[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）11-11-03 Det ect ion of Fusion Genes in Acut e Myeloid Leukemia Pat ient s wit h Nor mal Kar yot ypes ZHAO Jin1ZHOU Yongan1SU Liping1WU Jianrui2WANG Kai1XIE Jufen1MA Li1SHI Lei3 1.Department of Haematology，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University； 2.Children's Hospital of Shanxi； 3.Department of Rheumatism，the Second Teaching Hospital of Shanxi M edical University，Taiyuan030001 [Abst r act]Object ive To investigate the fusion genes derived from chromosome structural aberrations in patients with acute myelocytic leukemia determined by multiplex RT-PCR and explore its potential clinical significance in diagnosis，treatment and prognosis evaluation. Met hods Bone marrow samples from60patients were analyzed with a novel multiplex nested RT-PCR and examination for chromosome karyotype.Result s5types of fusion genes such as PM L/RARα，AM L1/ETO，CBFβ/M YH11，TLS/ERG，M LL/AF9were detected in18（30%）patients with normal karyotypes by multiplex RT-PCR.Conclusion M ultiplex RT-PCR technique can quickly screen chromosome structural aberrations in patients with newly diagnosed leukemia.It is useful in detection of fusion genes in acute myeloid leukemia（AM L）with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis，help us to improve classification of the leukemia types of M ICM and to direct individulized chemotherapy. [Key Words]Acute myeloid leukemia；Fusion gene；M ultiplex RT-PCR；Normal karyotype *山西医科大学硕士研究生在读 △通讯作者 CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生11
PML/RARα融合基因荧光RT-PCR诊断试剂盒 一、试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RARα融合基因的情况, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RARα融合基因。因此检测PML/RARα融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪残余白血病细胞的主要依据。 二、试剂盒组成(20人份) RNA提取液（20ml /瓶）1瓶Taq酶（40μl /管）1管 反应液I （165μl /管）1管定量标准品（50μl /管）8管 反应液II （165μl /管）1管DEPC H2O （500μl /管）1管 反应液Ⅲ（350μl /管）1管去离子水（1100μl /管）1管 逆转录酶（25μl /管）1管 三、检测步骤 1．标本采集 抽取外周血5ml抗凝后密封送检，或3ml新鲜骨髓标本密封送检。 2．标本处理 将5ml抗凝外周血或3ml骨髓加入等体积生理盐水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于离心管中，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入RNA提取液，充分混匀。室温静置5分钟，加入氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4℃静置2-3分钟，4℃12,000rpm离心15分钟，离心后反应管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4℃静置10分钟，然后4℃，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA 沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，加入400μl 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4℃7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10分钟。(注：75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，测A260-A280处的吸光值，并计算RNA含量。 3．逆转录反应：取灭菌离心管, 按以下要求配备逆转录体系 反应液I 逆转录酶模板（RNA）DEPC H2O 总反应体积 μl 1μl 2μg（或5μl）μl 20μl 反应条件：37℃水浴60分钟。 4．第一步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备PCR体系 反应液II Taq酶模板（cDNA）去离子水总反应体积 μl μl 5μl 13μl 25μl 反应条件：94℃→4分钟预变性, 然后按94℃30秒→54℃30秒→72℃60秒, 共做20个循环。 5．第二步PCR扩增：取灭菌PCR反应管, 按以下要求配备实时定量PCR体系 反应液ⅢTaq酶模板（PCR产物）去离子水总反应体积 14μl 1μl 5μl 30μl 50μl 注：每次实验取105、10６、10７、10８一组阳性标准品瞬时离心上机即可 反应条件：93℃→2分钟预变性, 然后按93℃45秒→55℃60秒, 共做40个循环。 6．结果分析条件的设定与判定
白血病经典融合基因检测 （一）bcr/abl融合基因 abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶；bcr基因位于22号染色体q11，正常的bcr基因产物为160kD的胞质磷酸蛋白，由于t（9；22）（q34；q11）的易位，形成bcr/abl融合基因，该易位产生bcr/abl嵌合基因，基因产物为210kD的融合蛋白，它的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，改变了细胞的蛋白酪氨酸水平和肌动蛋白结合能力，扰乱了正常的信号传导途径，抑制了凋亡的发生。 bcr基因断裂点集中在三个区域:主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr-abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。根据bcr基因断裂点的不同，主要有下述几种类型的bcr/abl融合形式:①在典型的CML中，大部分融合基因是在主要断裂点簇集区(M-bcr)内断裂融合而成，由此形成的bcr/abl融合mRNA是由b3a2或b2a2转录而成，其最终产物是相对分子质量210×103的胞浆蛋白P210，这种癌蛋白是绝大多数慢性期CML表型异常的根源所在。②当bcr基因断裂点发生在上游的一段长约54.4 kb的内含子，也称m-bcr区，产生一个e1a2接头的杂合mRNA，编码P190融合蛋白。③bcr断裂点也可在M-bcr区的下游，即μ-bcr，产生e19a2融合，编码P230融合蛋白。【我个人认为P230CML其特征主要是成熟中性粒细胞增生为主，表现为隐匿，良性的临床过程，患者生存期长的特点。】 bcr/abl融合基因存在于95%以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要的分标志，是疾病状态的决定性因素。在一部分成人急性淋巴细胞性白血病（20%－30%）、儿童急性淋巴细胞白血病（2%－10%）和急性粒细胞性白血病的患者中也可表达bcr/abl融合基因。在bcr/abl 阳性B-ALL细胞具有较特殊的表型，更多地表达CD34及CD10等细胞表面抗原，CD38阳性率较低，且IgH 检出率也相对较低，而CD10 /CD34 /CD38-是其独特的免疫表型特点。（二）AML1/ETO融合基因 t(8；21)(q22；q22)主要见于急性粒细胞白血病部分分化型(AML-M2)，亦可发生于急性粒细胞白血病未分化型(AML-M1)、急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)及骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEB-T中。这种染色体易位导致21号体上AML1基因(acute myeloblastic leukemia one gene)与8号染色体的ETO基因(eight twenty one gene，也称为MTG8基因)的融合形成AML1/ETO融合基因。AML1/ETO融合蛋白是一种转录抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变造血祖细胞自我更新及成熟过程，同时也产生启动异常造血细胞增殖的信号，引起白血病细胞生长。 t(8；21)(q22；q22)阳性是预后好的标志，其完全缓解(CR)率可达90%，5年长期无病生存率(event-free survival，EFS)可达50%-70%，AML1/ETO融合基因的存在是白血病预后良好的标志。经化疗或BMT后大部分病人可在短期内转为阴性，但仍有转阳性的可能，及时治疗可再次转阴性。RT-PCR结果由阴性转阳性或持续阳性可能预示复发。 （三）CBFβ/MYH11融合基因 M4Eo是M4型白血病中的一种特殊类型，约占急性粒细胞白血病的10%。患者骨髓中粒系和单核系原始细胞同时恶性增生，嗜酸粒细胞占5%～30%。含有CBFβ-MYH11融合基因的M4Eo患者预后较好。 Inv(16) /t(16；16)(p13；q22)为急性髓系白血病(AML)-M4Eo的非随机染色体异常，16q22断裂区受累基因CBFβ编码CBF的β亚单位，inv（16）/t(16；16)导致形成CBFβ/MYH11融合基因。inv(16)/t(16；16)(p13；q22)的结果是16号染色体长臂的CBFβ基因与短臂的平滑肌肌球蛋白重链1(MYH11)基因发生重排，形成CBFβ-MYH11和MYH11-CBFβ两种融合基因，其中CBFβ-MYH11融合基因易促使白血病发病。CBFβ链不直接结合DNA，而是通过与CBF
Long-Template DNA Polymerase Chain Reaction for the Detection of the bcr/abl Translocation in Patients with Chronic Myelogenous Leukemia1 Cornelius F.Waller,Gereon Dennebaum, Christoph Feldmann,and Winand Lange2 Department of Internal Medicine I,Hematology/Oncology,Albert Ludwigs University Freiburg Medical Center,D-79106Freiburg, Germany ABSTRACT In most patients with chronic myelogenous leukemia (CML)primitive hematopoietic progenitors carry the ac-quired reciprocal bcr/abl gene rearrangement t(9;22)(q34.1; q11.21).However,not all of the progenitor cells express the bcr/abl hybrid mRNA or the p210fusion protein.These cells, therefore,might escape detection by techniques that are based on expression of the fusion gene.To circumvent this problem,we established a new detection method for the rearrangement at the DNA level.Because breakpoints might occur in a very large genomic region(>200kb),we devel-oped a long-template DNA-PCR(LT-DNA-PCR).In22of59 CML patients,fragments of up to19kb could be amplified. Furthermore,6of7leukapheresis products of three bcr/abl-positive patients which were collected after mobilization chemotherapy and had been shown to be negative for the bcr/abl rearrangement by FISH and by RT-PCR were clearly positive by https://www.doczj.com/doc/3f17343738.html,ing a specific pair of primers,it is possible to detect the presence of,and to characterize,the individual gene rearrangement.This ap-proach could serve for diagnostic purposes as well as detec-tion of minimal residual disease under cytotoxic therapy or after purging regimens,being independent of expression of the bcr/abl hybrid mRNA or the fusion protein. INTRODUCTION CML3is a clonal hematological stem cell malignancy. Usually,a typical peripheral blood count leads to the diagnosis.In95%of patients the Philadelphia chromosome(Ph)is present (1,2).This is the result of an acquired reciprocal translocation t(9;22)(q34.1;q11.21)of the c-abl oncogene from chromosome 9to the bcr on chromosome22(3).Due to this positioning effect a patient-specific chimeric fusion gene https://www.doczj.com/doc/3f17343738.html,ually, fusion gene products of two slightly different sized mRNAs of approximately8.5kb are expressed,b2a2and b3a2.Both of them encode for a M r 210,000fusion protein(p210bcr/abl),a protein with increased tyrosine kinase activity(4,5). In the bcr,the translocation occurs somewhere in an intron within a5.8-kb genomic region(6,7).In abl,the chromosomal breakpoints are dispersed over an intron region as large as about 200kb(8).Complete intron sequence is available only for the bcr introns,whereas in abl,approximately95kb of the200kb are yet unknown(Fig.1A). Two research groups independently reported that primitive CML progenitors carry the rearrangement but do not necessarily express the bcr/abl hybrid mRNA or the p210fusion protein(9, 10).Because of this,these cells might escape detection by techniques that are based on expression of the fusion gene. Therefore,we intended to establish a method for detection of patient-specific rearrangements at the DNA level.Unfortu-nately,the breakpoints in CML are dispersed over such a large genomic region that at present,it is not possible to cover them by conventional PCR methods.In1994,Cheng et al.(11) showed effective amplification of long targets from human genomic DNA using a recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase.In accordance with their approach,we de-signed a set of LT-PCRs with one constant bcr primer and10abl primers at a distance of approximately15kb each.Depending on the translocation site the first abl primer3?of the transloca-tion together with the constant5?bcr primer should be able to amplify the fusion region(Fig.1B). MATERIALS AND METHODS Patient Samples.Peripheral blood from59patients with CML,4healthy volunteers,3control patients and three Ph?cell-lines(BV173,K-562,and LAMA84)were analyzed (Table1).Furthermore,samples from leukapheresis products of three patients with CP-CML collected after mobilization chem-otherapy consisting of idarubicin,cytosine arabinoside,and etoposide were analyzed(Table3).Samples were drawn after informed consent was obtained according to institutional guide-lines. RNA Isolation.Total cellular RNA from1?105to1?106cells from peripheral blood or thawed leukapheresis samples was extracted using a RNeasy Total Kit(Quiagen,Hilden, Germany)according to the manufacturer’s instructions. RT-PCR.RT-PCR amplification using nested primers was performed according to standard protocols as described previously(12). Received5/6/99;revised8/24/99;accepted9/10/99. The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges.This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with18U.S.C.Section1734solely to indicate this fact. 1Supported in part by the W.Sander-Stiftung(C.F.W.,W.L.),the Deutsche Krebshilfe(W61/93/La1),and the Zentrum Klinische For- schung I,Albert Ludwigs University Freiburg(C.F.W.,W.L.). 2To whom requests for reprints should be addressed,at Department of Hematology/Oncology,University of Freiburg,Hugstetter Strasse55, D-79106Freiburg,Germany.Phone:49-761-270-3852;Fax:49-761- 270-3418;E-mail:Lange@https://www.doczj.com/doc/3f17343738.html,l.uni-freiburg.de. 3The abbreviations used are:CML,chronic myelogenous leukemia;CP, chronic phase;Ph,Philadelphia chromosome;bcr,breakpoint cluster region;LT-PCR,long template-PCR;RT-PCR,reverse transcription- PCR;FISH,fluorescence in situ hybridization. 4146Vol.5,4146–4151,December1999Clinical Cancer Research
白血病融合基因检测的意义 白血病（leukemia）属于造血系统的恶性肿瘤，是一组高度异质性的恶性血液病，其特点为白血病细胞呈现异常增生伴分化成熟障碍。临床出现不同程度的贫血、出血、发热及肝脾、淋巴结肿大，可危及生命。 白血病融合基因（fusion gene），是白血病的分子生物学特异性标志。近年来，由于分子生物学技术的发展，对白血病细胞分子遗传学改变的了解也不断深入。迄今报道白血病涉及至少数十种融合基因。已经认识到大部分的白血病中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，导致原癌基因及抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。有些基因是调控细胞增殖、分化和凋亡的转录因子，当基因发生变异，直接影响了下游信号传递途径，导致细胞增殖能力增强、凋亡障碍，分化障碍等，产生白血病表型。 一些典型的白血病融合基因是某种白血病的特异性分子诊断标志，如 BCR-ABL融合基因，可出现在95%以上的慢性粒细胞白血病（CML）。患者预后效果的好坏，与融合基因的类型有一定关系，如急性早幼粒细胞白血病（APL）特有的PML-RARa融合基因，对APL患者用全反式维甲酸（ATRA）诱导缓解治疗，其预后非常好，复发率低。而有些基因，如MLL相关融合基因，预后差，死亡率高。 1.融合基因检测对白血病诊断的意义 通过临床实践发现单纯细胞形态学分型，检测者的主观成分较大，相互间的符合率及正确率有一定限制，随着细胞和分子生物学技术的迅速发展及对白血病发病机制研究的不断深入，认识到白血病发病过程中的基因和表型变化对各类白血病的诊断与治疗具有重要意义，因此提出了白血病MICM分型。近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标志和确定诊断的唯一依据，如急性早幼粒细胞白血病APL：PML/RARA，t(15;17)(q21;q22)；急性髓细胞白血病AML-M4Eo：CBFB/MYH11,inv(16)(p13;q22)；慢性粒细胞白血病CML或部分急性淋巴细胞白血病ALL：BCR/ABL，t (9;22)(q34;q11)；AML-M2：AML1/ETO，t(8;21)(q22;q22)；ALL-L3：MYC/IgH，t(8;14) (q24;q32)；AML-M4/M5：11q23MLL异常等。白血病融合基因可以通过逆转录PCR（RT-PCR）技术加以检出，有助于评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化。2007年卫生部颁布的《医疗机构临床检验项目目录》，其中有要求利用RT-PCR或real-time PCR技术的白血病融合基因检查，主要涉及6种融合基因的检查，包括BCR/ABL、PML/RARA、AML1/MPSI/EVI1、DEK/CAN、AML1/MTG8、E2A/PBX1。 RT-PCR可比传统的细胞学方法及临床症状出现早5～8个月，可检出1×106个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。 2.融合基因检测对白血病治疗和预后判断的意义 细胞遗传学分型与疾病的预后关系密切，对于指导临床个性化治疗方案的选择和判断预后具有十分重要的意义。急性白血病有PML/RARA， CBFB/MYH11，AML1/ETO融合基因预后较好，化疗完全，缓解率高，可长期