表达鸡毒支原体ＴＭ１蛋白基因重组新城疫病毒的构建
及其免疫原性研究
冯秋霖1，刘茂军2，祁
芳1，陈
曦1，邵国青2，葛金英1*，步志高1*
(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，
黑龙江哈尔滨150001；2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京210095)
摘要：为研制安全、有效的新型鸡毒支原体(MG)疫苗，本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota 弱毒疫苗株
反向遗传操作系统，构建出表达MG TM1蛋白的重组病毒rLa-TM1，并对其生物学特性进行鉴定，评估其作为MG 活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光试验表明TM1蛋白获得正确表达；经测定，重组病毒平均鸡胚致死时间(MDT)为132h ，脑内致死指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0，保持了LaSota 亲本株的低致病性；rLa-TM1接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID 50以上，证明重组病毒保持了LaSota 亲本株高滴度鸡胚生长特性；重组病毒rLa-TM1接种1周龄的雏鸡后，可以诱导显著的MG 抗体反应；攻毒保护试验证明其保护率可以达90%，而对照组全部发病(10/10)。本研究表明重组病毒rLa-TM1可以作为MG 重组病毒活载体疫苗的候选疫苗。
关键词：鸡毒支原体；反向遗传操作系统；重组新城疫病毒中图分类号：S852.62
文献标识码：A
文章编号：1008-0589(2013)10-0779-04
Construction of recombinant Newcastle disease virus expressing TM1gene of Mycoplasma gallisepticum and
its immune response in chickens
FENG Qiu-lin 1,LIU Mao-jun 2,QI Fang 1,CHEN Xi 1,SHAO Guo-qing 2,GE Jin-ying 1*,BU Zhi-gao 1*
(1.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Harbin 150001,China;2.Veterinary Research Institute,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210095,China)
Abstract :In order to develop a safe and efficient recombinant Mycoplasma gallisepticum (MG)vaccine based on Newcastle disease virus (NDV)LaSota vaccine strain as viral vector,we constructed and rescued a recombinant NDV (rLa-TM1)which expressed TM1protein of MG by reverse genetic techniques.The expression of MG TM1protein from recombinant virus was confirmed in the infected BHK cells by indirect immunofluorescence assay.Pathogenic test shown that the rLa-TM1retained NDV high-titer growth property and low pathogenicity in embryonated chicken eggs.Moreover,the rLa-TM1induced high titer of antibody against MG in one week post vaccination in chickens which provided up to 90%of protection against MG challenge.These results demonstrated that the rLa-TM1had the potential of being used as a novel MG vaccine.
Key words :Mycoplasma gallisepticum ;reverse genetic system;recombinant NDV
收稿日期：2012-08-14
基金项目：国家自然科学基金(30800816)
作者简介：冯秋霖(1987-)，男，山东烟台人，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究.*通信作者：E-mail ：zgb@https://www.doczj.com/doc/3817260137.html,
中国预防兽医学报
Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine
第35卷第10期2013年10月
Vol.35，No.10Oct.2013
doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.01
*Corresponding author
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)主要引起鸡慢性呼吸道疾病，降低机体免疫力，导致其它病原的继发感染，属于危害养鸡业的重要疾病之一[1]。
MG是一种缺乏细胞壁的革兰氏阴性菌。呈高度多形性，以二分裂法或芽生方式增殖。在MG基因组DNA中TM1基因编码一个分子量为29ku的外膜保护性抗原蛋白，在鸡体内能诱导产生保护性抗体[2]。将该纯化的蛋白接种鸡后，通过攻毒实验证明可保护80%的免疫鸡免受MG感染。
新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗通过鸡胚尿囊腔接种的方式生产，操作简单，易于大规模产业化生产，并且生产成本低。病毒活载体疫苗不需佐剂即可诱导机体产生比较广泛的免疫应答，包括体液免疫和较强的细胞免疫，甚至粘膜免疫，是目前及未来禽病疫苗研制与开发的主要方向之一[3]。
因此，本研究以NDV LaSota弱毒疫苗株为载体，构建表达TM1基因的重组NDV，并在SPF雏鸡中进行免疫原性研究，探索其作为安全、有效和低成本的新型NDV和MG二联活疫苗的可行性。
１材料和方法
１．１主要实验材料表达T7聚合酶重组痘病毒vTF7-3由NIH的Moss博士惠赠；MG H株由江苏省农业科学院兽医研究所提供；重组NDV弱毒疫苗株rLaSota、NDV感染克隆pBRN-FL-PmeⅠ以及辅助核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)和大聚合酶蛋白(pBS-L)重组质粒均由本实验室构建[4-5]；鸡抗NDV、鸡抗MG和鼠抗MG高免血清均由本研究室制备；SPF鸡胚和SPF雏鸡由本研究所SPF实验动物中心提供。
１．２主要试剂T4DNA连接酶及限制性内切酶均购自NEB公司；Prime Star HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司；兔抗鸡IgG-FITC、山羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG-TIRTC购自Sigma公司；RNA提取试剂TRIzol、鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒以及磷酸钙转染试剂盒购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；鸡毒支原体ELISA检测试剂盒购自上海丽臣生物科技有限公司。
１．３ＭＧＴＭ１基因的合成和序列分析根据GenBank中登录的MG-TM1基因的ORF序列(NC_004829.1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。１．４表达ＴＭ１基因的重组感染性克隆的构建将合成的TM1基因经PmeⅠ酶切处理后，回收TM1片段，连接于同样经PmeⅠ酶切去磷酸化的NDV 感染性克隆pBRN-FL-PmeⅠ中[5]，构建表达MG-TM1基因的重组感染性克隆，pBRN-FL-TM1(图1)。
１．５重组病毒的拯救将MOI约为0.01表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3接种于90%的BHK-21细胞单层1h后，利用磷酸钙转染试剂盒，将pBRN-FL-H及辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L分别以每孔5μg、2.5μg、1.25μg、1.25μg共转染BHK-21细胞，具体拯救方法见参考文献[5]。收获血凝(HA)及血凝抑制(HI)检测均为阳性的尿囊液，并按常规方法接种于9～11日龄鸡胚，滴定每毫升病毒液的EID50。将拯救的重组病毒命名为rLa-TM1。１．６重组病毒的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定采用TRIzol法提取rLa-TM1接种鸡胚尿囊液中的总RNA。以MG-TM1-F(5'-GCGAATTCATGAATAAGAAAAGAATCA TCTTAAAGAC-3')和pBRN-8306-R(5'-GACTGCATT CACTGATGAG-3')为引物，进行RT-PCR扩增[6]，对扩增的PCR产物进行测序分析。
１．７ＴＭ１蛋白表达的激光共聚焦检测分别将rLa-TM1和rLaSota按MOI约为1.0感染BHK-21细胞，培养24h后以3%多聚甲醛室温固定20min。以鼠抗MG高免血清(1∶50)和鸡抗NDV高免血清(1∶50)为一抗，山羊抗鼠IgG-TIRTC(1∶200)和兔抗鸡IgG-FITC(1∶200)为二抗，对细胞进行DAPI细胞核染色处理。利用激光共聚焦显微镜进行检测。１．８重组病毒的致病性试验按文献[7]的常规方法对重组病毒rLa-TM1F3代进行平均鸡胚致死时间(MDT)、脑内致死指数(ICPI)及静脉内致病指数(IVPI)等致病性指标测定。
１．９重组病毒对鸡的免疫试验及抗体的测定30只1周龄的SPF雏鸡，随机分为3组，将rLa-TM1、rLaSota病毒液以106EID50的剂量分别以滴鼻点眼途图1表达MG TM1基因的重组型NDV基因
组全长cDNA的构建
Fig.1Construction of genomic cDNA of recombinant NDV
expressing MG TM1
N P M F H L
pBRN-FL-TM1
PmeⅠPmeⅠ
2013年
中国预防兽医学报780
径接种2组SPF 雏鸡，第3组设为对照组。7d 后对雏鸡进行翅下静脉采血，并进行对NDV 和MG 特异的ELISA 抗体检测试验。
免疫3周后，气管内注射MG 菌(0.5×109cfu/0.5mL)进行攻毒。观察雏鸡呼吸道症状，记录雏鸡发病死亡情况。攻毒两周后，剖检观察免疫组和对照组鸡的气囊、气管、肺脏的病变情况。
２
结果
２．１
表达ＴＭ１基因的重组感染性克隆的构建和重
组病毒的拯救
在NDV LaSota 疫苗株反向遗传操
作系统的基础上，利用PCR 在MG-TM1基因两端引入转录调控终止子(GE)、启动子(GS)序列和Pme Ⅰ酶切位点后，插入同样经Pme Ⅰ酶切处理的NDV 感染性克隆pBRN-FL-Pme Ⅰ，构建获得表达TM1基因的重组NDV cDNA 克隆pBRN-FL-TM1。
以pBRN-FL-TM1与表达NDV NP 、P 、L 蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。收获细胞培养上清接种9～11日龄SPF 鸡胚，继续培养5d 后，收获尿囊液进行HA 和HI 试验，结果显示均为阳性。２．２
重组病毒的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定
提取具有血凝活
性的病毒液RNA,利用RT-PCR 方法扩增出1960bp 的片段(图1)，进一步的序列分析结果显示，重组病毒基因组的预期位点正确插入了MG-TM1基因及所引入的转录调控序列。
２．３ＴＭ１蛋白表达的共聚焦检测将rLa-TM1、亲
本株rLaSota 分别感染BHK-21细胞，培养24h 后固定细胞，以鸡抗NDV 高免血清和鼠抗MG 高免血清为一抗，兔抗鸡IgG-FITC 和山羊抗鼠IgG-TIRTC 为二抗，DAPI 细胞核染色处理制备共聚焦样品。通过激光共聚焦观察到rLaSota 感染的细胞内只有NDV 蛋白表达；在rLa-TM1感染的BHK-21细胞中存在NDV 和MG 两类蛋白，并且TM1所表达的蛋白位于其细胞膜上(图2)。
M:DNA Marker DL2000;1,2:RT-PCR products of TM1gene;
3:Negative control of rLaSota 图1RT-PCR 扩增重组病毒的MG-TM1基因
Fig.1RT-PCR identification of recombinant virus of rLa-TM1
M
1
2
3
2000bp 1000bp
1900bp
图2激光共聚焦观察MG-TM1蛋白在重组病毒感染细胞内的表达Fig.2Immunofluorescence analysis of rLa-TM1protein expression
Anti-NDV
Anti-MG
DAPI
Merge
r L a S o t a r L a -T M 1
２．４重组病毒的致病性分析重组病毒株rLa-TM1F3代的EID 50为108.83/0.1mL ；MDT 为132h ，ICPI 和IVPI 均为0，属于温和或缓发型病毒株。该结果表明重组弱毒株保持了LaSota 亲本疫苗株对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。２．５
重组病毒免疫鸡血清中ＭＧ抗体的检测
将
rLaSota 和rLa-TM1分别接种一周龄SPF 雏鸡。通过间接ElISA 方法对所采集血样的抗体滴度进行检
测。结果显示，rLaSota 免疫组和空白对照组免疫后其体内均未检测到抗MG 的抗体。而免疫rLa-TM1组雏鸡在免疫后一周即可检测到显著的抗MG 抗体，并逐渐升高，在3～4周达到一个平台期。免疫3周后进行攻毒，对照组的抗体略有升高。２．６
重组病毒对ＳＰＦ鸡的免疫攻毒保护试验
免
疫3周后，对3组SPF 鸡气管内进行MG 攻毒，从第9d 开始非免疫对照组和rLaSota 免疫组开始先后
冯秋霖，等.表达鸡毒支原体TM1蛋白基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究第10期781
表现为精神不振，减食，流鼻涕，伸颈呼吸。而rLa-TM1免疫组则未出现明显的临床症状。
攻毒2周后，对试验组和对照组进行剖检。免疫rLaSota 组和对照组气囊明显增厚、浑浊，有黄色粘稠物，部分鸡喉头气管有淤血。rLa-TM1免疫组气囊透、喉头及气管均无病变，保护率为90%(表1)。
３讨论
本研究利用反向遗传操作平台，将TM1基因整合到LaSota 弱毒疫苗株的基因中，构建重组病毒rLa-TM1。将重组病毒感染BHK-21细胞，共聚焦法免疫荧光检测结果表明，大量TM1编码的蛋白表达在细胞膜上。通过ELISA 方法对免疫组和对照组血清进行检测，结果表明免疫组可产生较高水平的抗体。经MG 强毒株进行攻毒保护试验，rLa-MG 免疫组保护率可达到90%以上，而对照组则100%发病。实验结果证明NDV 作为弱毒疫苗载体可以使表达的外源蛋白接近于天然状态，诱导更好的免疫保护反应。
郝永清等构建了TM1基因真核表达质粒，通过肌肉注射途径免疫SPF 雏鸡，然后经ELISA 和流式细胞术对免疫鸡进行体液免疫和细胞免疫评估，结果表明所构建的真核表达重组质粒既可诱导机体产生体液免疫，也可以产生细胞免疫。攻毒试验证明，其免疫保护率达到79.5%[8]
。由于生物安全性
等方面的原因，目前基因疫苗在生产中还未能推广应用。在本研究中，构建的重组NDV 接种鸡胚所收集尿囊液中的病毒滴度可高达每毫升109.5EID 50以上。重组疫苗的MDT ≥130h ，ICPI 和IVPI 均为0，保持了LaSota 弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应性和低致病性，具有很高的安全性。
由于MG 培养条件苛刻，所以制造灭活苗和弱毒苗的成本较高。有时由于培养条件不良还可使MG 某些免疫保护性抗原不能充分表达，造成灭活
苗免疫不确实。另外，近年来研究表明MG 的免疫机制以细胞免疫为主，而灭活苗诱导的免疫以体液免疫为主，所以灭活苗免疫往往无法达到预期效果。弱毒苗虽然既可诱导体液免疫也可诱导细胞免疫，但现行的弱毒苗的效力不够稳定，有时不能产生良好的免疫。本研究通过滴鼻点眼途径免疫鸡，证明NDV 活载体疫苗能引起机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答。此外，NDV 活载体疫苗可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射等多种方式给苗，使用极为方便；NDV 具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低。该项研究为MG 重组活病毒疫苗的进一步研究奠定了基础，有望成为防制NDV 和MG 感染更廉价、安全的新型重组基因工程活载体疫苗。
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(本文编辑：赵晓岩)
表1攻毒后的发病率统计结果
Table 1
The protection of chicks immunized with rLa-TM1
against challenging with MG
Group rLa-TM1rLaSota Negative control Chickens 101010Challenge dose 0.5×109cfu
0.5×109
cfu 0.5×109
cfu Sick chicken 11010Protection rate 90%0
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2013年
中国预防兽医学报782