扫描电镜样品制备技术
一．样品的初步处理
(一) 取材
取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，可参考第十四章超薄切片技术中所提的要求。但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。
(二) 样品的清洗
用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察。因此，在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。清洗的方法有以下几种：
1．用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；
2．用5%的苏打水清洗；
3．用超声震荡或酶消化的方法进行处理。例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法：
清洗液配方：透明质酸酶300 μg α-糜蛋白酶,10 ml生理盐水,100 ml清洗液的pH为5.5～6。清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水洗3次。无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品。
(三) 固定
固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。
(四) 脱水
样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。
二．样品的干燥
扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中
都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种：
(一) 空气干燥法
空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用
于表面较为坚硬的样品。
(二) 临界点干燥法
临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3小
时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。但用此法，需要特殊仪器设备。
临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：
1．固定、脱水：按常规方法进行。如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮置换15～20分钟。
2．转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15～30分钟。3．移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品室内，盖上盖并拧紧以防漏气。
4．用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31℃ , 72.8大气压)后，将温度再升高10℃，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。
(三) 冷冻干燥法
冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干
燥和样品脱水后冷冻干燥。
1．含水样品直接冷冻干燥法
1.1 取材固定：按常规方法进行。
1.2 置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。
1.3 骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(C的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。
1.4 干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。
2．样品脱水后冷冻干燥
样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。和前一种方法比较，本方法的优点是不会产生冰晶损伤，
且干燥时间短。不足之处是有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥的方法。其操作步骤如下：
(1). 固定、水洗：按常规方法进行。
(2). 乙腈置换：使用50%、70%、80%、90%的乙腈水溶液置换，最后用100%乙腈代替，每步骤15～20分钟。
(3). 干燥：至纯乙腈时，放入真空镀膜台抽真空，乙腈和样品在真空中很快致冷而被冻结(冻结的温度为-45℃)，变成冰状固体。然后继续抽真空，使冻结的乙腈升华，约需30分钟，样品即达干燥。
样品干燥后要粘在样品台上。对于不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固；对于要镀膜的样品，则可以用胶水或万能胶来代替，微细的样品如粉末、纤维等也可用双面胶纸来粘贴。
三．样品的导电处理
生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电
镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种：
(一) 金属镀膜法
金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。
1．真空镀膜法
真空镀膜法是利用真空膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热，当加热到熔点以上时，会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，在样品表面形成一层金属膜，使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒，有用铂或用金—钯、铂—钯合金的。金属膜的厚度一般为10nm～20nm。真空镀膜法所形成的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，目前已经较少使用。
2．离子溅射镀膜法
在低真空(0.1～0.01乇)状态下，在阳极与阴极两个电极之间加上几百至上千伏的直流电压时，电极之间会产生辉光放电。在放电的过程中，气体分子被电离成带正电的阳离子和带负电的电子，并在电场的作用下，阳离子被加速跑向阴极，而电子被加速跑向阳极。如果阴极用金属作为电极(常称靶极)，那么在阳离子冲击其表面时，就会将其表面的金属粒子打出，这种现象称为溅射。此时被溅射的金属粒子是中性，即不受电场的作用，而靠重力作用下落。如果将样品置于下面，被溅射的金属粒子就会落到样品表面，形成一层金属膜，用这种方法给样品表面镀膜，称为离子溅射镀膜法。和真空镀膜法比较，离子溅射镀膜法具有以下优点：
(1)由于从阴极上飞溅出来的金属粒子的方向是不一致的，因而金属粒子能够进入到样品表面的缝隙和凹陷处，使样品表面均匀地镀上一层金属膜，对于表面凹凸不平的样品，也能形成很好的金属膜，且颗粒较细。
(2)受辐射热影响较小，对样品的损伤小。
(3)消耗金属少。
(4)所需真空度低，节省时间。
(二) 组织导电法
用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属溶液对生物样品中的蛋白质?脂类和醣类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。此法的基本处理过程是将经过固定、清洗的样品，用特殊的试剂处理后即可观察。由于不经过金属镀膜，所以不仅能节省时间，而且可以提高分辨率，还具有坚韧组织，加强固定效果的作用。
组织导电法主要有碘化钾导电染色法、碘化钾--醋酸铅导电法、丹宁酸—锇酸导电法等。比较常用的是丹宁酸—锇酸导电法，其具体操作方法如下：
(1)．样品处理：按常规方法取材、清洗及用戊二醛固定。
(2)．导电染色：将样品放入2%～4%丹宁酸溶液中浸泡。如果观察表面结构，浸泡时间为30分钟；如果观察内部结构，浸泡时间为8小时，即可过夜。在浸泡过程中，可更换一次溶液。
(3)．清洗及再固定：用磷酸缓冲液充分清洗，然后放入1%锇酸中固定2～4小时，再用磷酸缓冲液清洗。
(4)．脱水和干燥：按常规方法。
(5)．扫描电镜观察。
四．几种特殊的样品制备技术
(一) 细胞内部结构冷冻割断法
1972年，日本学者田中敬一采用冷冻树脂割断法将细胞打开，用扫描电镜观察细胞的内部结构。后来他又以二甲基亚砜代替树脂进行冷冻割断取得成功，该方法简便，结构清晰，已得到广泛应用。其操作方法如下：
1．取材和固定：为了使细胞结构清晰，不被过多的血细胞污染，可在取材前用灌注法冲洗。即先将动物麻醉，经腹主动脉注入生理盐水或低分子量的右,切开下腔静脉放血，至无血色为止。然后迅速取材，将样品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%锇酸溶液中固定1小时，用1/15M磷酸缓冲液 (pH7.4)清洗两次，每次10分钟。
2．二甲基亚砜浸泡：将样品依次放入25%、50%二甲基亚砜溶液中，各浸泡30分钟。
3．割断：用TF—1型冷冻割断装置进行割断。然后将割断后的样品放到50%二甲基亚砜中，等融化后再用1/15M磷酸缓冲液浸洗，每次10分钟，换液5次。4．软化及后固定：将样品放入0.1%锇酸中软化，温度20℃，时间48～72小时。然后用1%锇酸后固定1小时，双蒸水浸洗1小时，换液几次，需彻底清洗干净。5．导电染色：将样品放入2%丹宁酸中2小时(或过夜)，以双蒸水清洗1小时，换液几次。再以1%1%锇酸后固定30～60分钟，双蒸水清洗1小时。
6．脱水、干燥及镀膜：按常规方法进行。
(二) 铸型技术
为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。如果是研究血管系统，称为血管铸型。用铸型技术制作的标本，经过镀膜后，就可进行扫描电镜观察。
常用的铸型剂有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被认为是比较理想的铸型剂。下面简单介绍用ABS制作血管铸型标本的方法：
1．灌流和注入铸型剂
首先将准备灌注的器官取下或保持自然位置，找到动脉，插入玻璃管或静脉穿刺针，并以粗丝线结扎之，用普通流水或温盐水将血管中的血液冲洗干净。然后灌注铸型剂ABS丁酮溶液，浓度为5%～30%，注入的压力为100mmHg。注入铸型剂的脏器，可以放在50℃～60℃的温水中浸泡6小时左右，这样既能保持脏器的原形，也有助于铸型剂的硬化。
2．腐蚀和清洗
将标本放入10%～20%氢氧化钠或氢氧化钾溶液中腐蚀，也有放20%～30%盐酸中腐蚀。时间一般为5～7天。若用稀盐酸腐蚀，可加入5%～10%胃蛋白酶，
腐蚀的效果更好。然后用流水将血管铸型周围被腐蚀的组织冲洗干净，时间为24～72小时，冲洗的速度要慢。
3．显微解剖和剥制铸型
为了暴露和切取要观察的部分，需要在解剖显微镜下进行。如果铸型太硬，可将铸型浸入酒精中，加温至40～60℃，能使铸型变软，便于解剖和切取。
4．干燥和镀膜
将切取的铸型用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干后放37℃，温箱中30～60分钟，最后放干燥缸中保存。镀膜可用真空喷镀，也可用离子镀膜，方法同前。镀膜后就可用扫描电镜观察。
(三) 盐酸化学消化法
为了研究被观察细胞的基底面及深层细胞表面，可采用盐酸化学消化法制备样品。1．固定和清洗：同常规方法。
2．盐酸消化：用8mol/L盐酸消化和腐蚀，其温度与时间根据不同组织而异。3．清洁样品：用2%～5%Tween20作用3小时，以清洁样品和稳定其结构。
4．脱水、干燥和镀膜：按常规方法处理。
透射电镜样品制备技术简介
电镜是利用电子束作为成像光源,由于普通透射电镜电子束穿透能力很弱，无法穿透1um厚度的薄片,所以必须把标本切成厚度小于0.1um 以下的薄片才能适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最
常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一、取材的基本要求
组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，容易出现细胞自溶现象；同时,离开机体的组织由于细胞缺血缺氧,导致细胞代谢紊乱而出现膜性结构的损伤,最终导致人为假象的产生。此外，还可能由于组织干燥脱水、微生物污染等使细胞的超微结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生活时的状态，最好是在动物血流未断、呼吸未停之前进行取材,取材时必须要做到快、小、冷、准等四大基本要求：
快：即取材动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入（2.5%—4%）戊二醛固定液中进行固定。
小：所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定,从而影响细胞超微结构的保存。
冷：所用的固定液、操作工具要预先冷藏，操作时环境温度最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
准：取材部位要准确，即各组实验动物必须取材在同一脏器的同一位置，这样才能有较可信的比较。
此外，还要避免机械损伤，解剖器械应锋利，在修小块的时候最好用崭新的剃须刀片，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压，最好采用“双刀拉锯法”，具体操作如下：
准备一块蜡板（蜡板可以用病理切片石蜡融化在培养皿中冷却后即
可使用，同时在蜡板的下方放一些碎冰块或冰袋以适量降低固定液温度。）并在其上滴几滴预冷的固定液，将取出的组织放在固定液中，用两片新的、锋利的刀片（最好是剃须刀片）交叉成“X”形，把组织放在两把刀的交叉口下，一把刀作为固定组织用，另一把刀当切割刀以“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子轻轻地将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用缓冲液或固定液洗几遍，然后再切成小块固定。
二、固定
固定的目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保
持生活时的状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。固定的方法有物理法和化学法两大类。物理的方法系采用冰冻、干燥、微波等手段来保持细胞结构；化学的方法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。现通常使用化学方法进行固定，有时用物理-化学双固定。
常用固定剂
1、四氧化锇 (osmium tetroxide，)是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA 以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇酸常用浓度为1%，固定时间视环境温度而有所不同，一般在夏秋为1小时，冬春为
1.5—
2.0小时。缺点是固定时间过长容易造成组织发脆，不容易切片。 2．戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)，戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周
甚至1～2个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。
组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分预固定和后固定，中间用磷酸缓冲液或相应的缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～2小时，pH7.2～7.4。固
定完毕，用缓冲液漂洗30分钟后进行脱水。
此外，还可以用福尔马林溶液、高锰酸钾溶液固定。
三、脱水
目前我们使用的包埋介质大多是非亲水性的物质，为了保证包埋
介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱水应缓慢地梯度地进行。下面以丙酮脱水为例：50%丙酮15分钟，70% 丙酮15分钟，80% 丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮20分钟(分二次进行)。游离细胞可适
当缩短脱水时间。过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使细胞皱缩变形、超微结构破坏、同时引起样品发脆，造成切片困难或无法切
片。
四、浸透和包埋
(一) 浸透
浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。环氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂，它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有
2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP-30)、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂，使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)。
包埋操作：常规将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、60℃(36小时或更长)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。
包埋操作中应注意以下几点：(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿应烘干；(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净；（7）操作过程最好在通风柜中进行。
五、超薄切片
(一) 超薄切片前的准备工作
1．修块
一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。
2．半薄切片定位
利用超薄切片机切厚度为1μm-5μm的切片，称半薄切片。将切下的片子用镊子或小毛刷转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蜡切片更能观察到细微结构，效果比石蜡切片要好一些。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶
端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度为0.2mm～0.3mm。
3．制刀
超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀，另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，有一定的规格，厚度为5mm～6.5mm。
玻璃刀用专用制刀机制作。制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有树胶水槽和胶布水槽两种。树胶水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。
4．载网和支持膜
4.1 载网
电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的数目不等，有100、200、300目等多种规格，可根据需要进行选择。
4.2 支持膜的制备
挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结构，并能承受电子束的轰击。常用的支持膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(Formvar 膜)，一般采用后者。
(二) 超薄切片
超薄切片需用超薄切片机进行。根据推进原理不同，将超薄切片
机分为两大类：一类是机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进；另一类是热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进。
超薄切片的步骤包括：(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)调节水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度，切片；(6)将切片捞在有支持膜的载网上。
六．超薄切片的染色
未经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要进行染色处理，以增强样品的反差。一般是用重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附来达到染色的目的。重金属的原子对电子束形成散射，从而提高图象的反差。常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅（pH值在11左右）。染色方法有两种：
1．组织块染色
在脱水至70%乙醇或丙酮时，将组织块放在用70%乙醇或丙酮配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。
2．切片染色
预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上，用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10～20分钟。载网从染液中取出后，必须尽快用双蒸馏水清洗干净。在染色过程中，铅染液容易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅颗粒，而污染切片。因此，在保存和使用
染液时，要尽量减少与空气的接触。为防止铅沉淀污染，可在培养皿内放置少许氢氧化钠，以吸收空气中的二氧化碳。
七、电镜观察、拍片、记录等。
每个电镜观察者必须首先准备好相应资料，熟悉所要观察组织细胞的超微结构和超微病理变化特点。观察时做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容，最好在电脑中作好备案工作。如果使用CCD系统，则遵照CCD操作程序进行，并在观察后作好图片的拷贝或刻录工作。
下面简单介绍电镜样品制作流程，供大家参考：
1、透射电镜样品制作操作流程：取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左右)——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 oC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37oC烘箱过夜；纯包埋液45oC烘箱2小时）——包埋聚合（45oC烘箱3小时，65oC烘箱48小时）。
2、扫描电镜样品制备操作流程：取材（做好样品观察面的标志）——漂洗（生理盐水或缓冲液）——固定（2.5%戊二醛2小时以上）——漂洗（0.1M磷酸缓冲液，3次，45分钟）——后固定（1%锇酸，2小时）——脱水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟，换醋酸异戊酯15分
钟或叔丁醇15分钟）——干燥（零界点干燥或冷冻干燥）——镀膜（真空镀膜仪或离子溅射仪）
第二课溶液的配制 化学试剂的等级标准 般溶液的配制 配制这类溶液一般使用分析纯试剂，配制时试剂的质量由托盘天平称量， 体积用量用量筒或量杯量取。 配制这类溶液的关键是正确地计算应该称量溶质的质量或应该量取液体溶 质的体积。 1、物质的量浓度（又叫摩尔浓度，mol/L）:单位体积溶液中含溶质的摩尔数，用C表示。 C=Q B N（n=m/M, m= p *V） 2、质量百分浓度（m/m%）:溶质克数/溶液克数X 100% 亦即B的质量与混合物的质量之比。 3、体积百分浓度（m/v%） : 100mL溶剂中所含溶质的克数表示的浓度。 4、体积百分浓度（v/v%）:溶质为液体时，溶质的体积与混合物体积的比。 5、质量体积浓度（mg/mL）:单位体积溶剂中所含溶质的质量表示的浓度,金属分析用的标准溶液浓度表示方式。 6 比例浓度
（1）容量比：液体试剂相互混合或用溶剂（大多为水）稀释时的表示方法。如 HCI( 1: 5), 就是1体积的HCI和5体积的水混合而成。 (2) 质量比浓度：两种固体物质相互混合的表示方法。如(1+100)钙指示剂- 氯化钠混合指示剂，表示1个单位质量的钙指示剂与100个单位质量的氯化钠相互混合。 7、滴定度(g/mL) (1) Ts/x: 1ml 标准溶液相当于被测物的质量。 Ts/x= C B*Mx/1000 (2) Ts: 1ml 标准溶液中所含滴定剂的质量(g)。 三、标准溶液的配制与标定 标准溶液的配制方法有直接法和标定法两种。 1、直接法：准确称取一定量基准化学试剂溶解后，移入一定体积的量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。然后由试剂质量和体积计算出所配标准溶液的准确浓度。 能用于直接配制标准溶液的物质，必须具备几个条件： (1) 纯度高，要求杂质含量在万分之一以下，即纯度为3个9以上的，一般可用基准试剂或优级纯试剂； (2) 组成与化学式相符，若含有结晶水，其含量也应与化学式相符。如NaB0.10H20,结晶水应恒定为10个。 (3) 性质稳定，干燥时不分解，称量时不吸潮，不吸收二氧化碳，不被空气氧化，放置时不变质； (4) 容易溶解，最好具有较大的摩尔质量，降低称量误差。能同时满足以上几个条件的物质至少为基准级别或以上物质。
取样程序 1、仓库人员收取材料后，应按批及时报检，并填写《进货物资报 检单》，每张报检单对应一个报检编号。 2、材料质检员收到仓库报检单后，应对报检材料进行外观尺寸检 验，外观尺寸合格则填写《钢材试样加工委托单》交给取样人员进行取样，不合格的无需取样。 3、《钢材试样加工委托单》如下表：（参考） 4、取样人员根据试样加工委托单进行取样加工，取样过程应在每 件样品上用油性笔标明该样品的报检编号、规格、材质。在试样交接及加工过程中也应留意试样标识是否清晰，若不清晰应及时标识好。 5、取样数量。原则上一个炉号取一个拉伸试样、一个弯曲试样。 若第一个检验结果不合格或有疑问，则在此批材料上进行加倍取样（2个拉伸试样、2 个弯曲试样），化学成分分析，可用拉断后的试样进行钻取分析用铁屑或直接进行光谱分析。 6、取样尺寸。取样可采用烧割法或冷剪切法。用烧割法切取试样 时，应该留有足够的加工佘量，一般不小于钢产品的厚度或直径，但最少不能少于20mm。当采用冷剪切取试样时，加工佘量按下表取。
7、取样位置。关于每种材料具体的取样位置，可查看 GB/T2975-1998（后面附录）。但应注意一点，由于卷管板的使用需要，经常不能按标准要求进行横向取样，所以，在对卷管板进行取样前，应询问清楚仓库管理人员，具体的取样位置，以免因取样而造成浪费。 8、试样的加工。试样加工应不影响其力学性能，应该通过机加工 方法去除由于剪切或冲切而产生的加工硬化部分。为加工方便，拉伸试样通常可加工成不带头试样。 试样加工宽度，对于角钢、钢板、槽钢、工字钢等型钢，厚度≥4mm时，宽度为30mm。厚度＜4mm时，宽度为20mm。对于无缝管、焊管，试样加工宽度采用下表 试样加工厚度，厚度或直径≤25mm的材料，一般为全厚度或直径，即无需加工，＞25mm的材料，则加工成直径为20mm的圆形试样。（试样的厚度可根据试验机吨位来定） 试样加工长度。试样的长度可根据试验机的不同而不同。原则上可以这样来定。试样长度=试验机上下夹持长度+试样原始标
鞋子样品制做流程 一．备料 1.收到样品材料，先根据来料清单，核对数量/配件是否齐全，有没有在运输途中损坏或者丢 失，再和样鞋仔细对照。 2.材料颜色车线颜色加工方法 大底颜色拉链饰扣松紧织带 包边条喇叭布标印刷网板 3．有些特殊材料不能挤压，不能褶皱，如镜面PU/贴膜金属PU等，存放的时候要注意 二．开料 1. 样品材料要单独存放，不要和大货放在一起，以免用错材料。 2.有些特殊材料不能挤压，不能褶皱，如镜面PU/贴膜金属PU等，裁断的时候要注意 3. 样品材料都比较少，特别是有些特殊材料或小配件，材料可能只有一点点。有些材料是样 品室用剩下的部分，材料会不规则。裁断冲裁的时候不要浪费材料，不规则或有瑕疵的材料要单片冲裁，剩下的样品材料要按指令装好写上标签，方便下次再用。（有瑕疵的材料也不能扔掉） 4. 样品没有刀模的时候要手工开料，手工开料的时候要先比对纸板和样鞋，不要用错纸板， 也不要用错材料 常用纸板名称 开料板和刀模纸板一样大的纸板，包含有折边位置，组合位置，反车位置 实板和折完边的部件一样大，不包含折边位置(比开料板少了一个折边位) 比板有些小部件会有比板，即不包含折边位置，也不包含组合和反车位置（像组合好鞋头剩下的鞋头中片大小，鞋身饰片大小，条带宽度比对等）组合板像凉鞋和有扣带组合的鞋子，一般都会有组合板，用来比对扣带组合的角度翘度板有需要定型的鞋子，用来比对部件定型后的翘度 5.做到鞋头要定型的鞋子，鞋头要先定一片看效果，再定剩下的鞋头。如果是手工开料，要 先剪一片鞋头试定型效果，和翘度板比对，没有问题再开剩下的鞋头，避免有鞋头定型后太小，鞋子做不起来的现象。 三．针车 1.按照样鞋组合位/折边位削皮，削皮要顺薄，不能有痕迹。港薄削10MM宽，顺薄到0.1MM
合同编号：WU-PO-550-62 印刷品制作合同标准样本 In Order T o Protect The Legitimate Rights And Interests Of Each Party, The Cooperative Parties Reach An Agreement Through Common Consultation And Fix The Responsibilities Of Each Party, So As T o Achieve The Effect Of Restricting All Parties 甲方：_________________________ 乙方：_________________________ 时间：________年_____月_____日 A4打印/ 新修订/ 完整/ 内容可编辑
印刷品制作合同标准样本 使用说明：本合同资料适用于协作的当事人为保障各自的合法权益，经过共同协商达成一致意见并把各方所承担的责任固定下来，从而实现制约各方的效果。资料内容可按真实状况进行条款调整，套用时请仔细阅读。 合同编号：________ 甲方：______________（委托方） 地址：__________ 电话：__________ 乙方：______________（承制方） 地址：__________ 电话：__________ 印刷品名称：___________ 成品尺寸：_____________ 印数：__________ 色数：__________
用纸要求：_____________ 后期特殊工艺要求 亮膜□起凸□亚膜□后粘兜□过 UV □模切□ 裱糊□胶订□过油□骑马订□打孔□ 其它：____________。 单价：_______元/______总价：___________元，大写：_______________。 付款方式：（1）看样定稿后预付___________元，大写：___________（2）按质量要求印刷完毕送货到甲方后，余款___________元付清，大写： __________。 交货时间：_______________交货地点： ____________。 本合同一式两份，甲、乙方各持一份。甲、乙双
新药临床试验用样品制备技术指导原则 1997年2月 美国FDA发布 2009年6月 药审中心组织翻译 苏威制药公司翻译 北核协会审核 药审中心最终核准
目录 Ⅰ. 目的 (1) Ⅱ. 简介 (1) Ⅲ. 成份控制 (3) Ⅳ. 生产和工艺控制 (3) Ⅴ. 收率计算 (4) Ⅵ. 设备的识别标志 (4) Ⅶ. 包装和贴签操作 (5) Ⅷ. 留样 (5) Ⅸ. 记录保存 (6)
新药临床试验用样品制备技术指导原则 Ⅰ. 目的 本指导原则适用于新药的研究与开发。目的是帮助相关人员更好的执行现行的药品生产质量规范（GMP）有关章节（联邦法规第21主题，第210和211部分）。 Ⅱ. 简介 本指导原则草案的说明（53FR 5835）指出，本规范将会在§ 10.90(b)(21 CFR 10.90 (b))中发布，作为指导规范以为药品的临床申报提供规程或标准。当局目前也正在考虑是否进一步修订§ 10.90(b)，但还没有做最后决定。 虽然当局决定发布本指导原则，但最后还是以本指导原则的最终版本§ 10.90(b)为准。 即称之为指导原则，它并不对FDA或其他任何人以任何方式产生约束。 当局建议本指导原则最终版本的定位是基于现行的GMP规范。本指导原则应对为临床试验目的而研制的临床新药的有关人员提供帮助。虽然在本指导原则中没有提及其它可替代的方法，但有关人员可以采用不同的方法。如果采用的方法违背或偏离了本指导原则最终版本中所列的操作和程序，希望能与当局进一步讨论以防止花费了更多的资金和人力。但是，也可能在最终决定时未能被FDA所接受。本指导原则不对FDA 产生约束，而且也不对任何个人提供或授予任何权利、任何特权或任何利益。 随着FDA对法规的不断修订和各方提出的意见和对需求，本指导原则可能随时修订。 关于FDA怎样应用CGMP规范审批临床新药制备的问题已经提出过。临床人用的新药制剂定义为：如FDA-1571指出，包括药物制剂（如药物剂型）的临床用新药申请（与“新药豁免临床研究的注意事项通知”一致）通常归类于IND（21 CFR PART 312）。临床用兽用新药的定义为：临床用新药申请应包括药物制剂（如药物剂型），（21 CFR 511.1）。大部分不清楚的地方是随着药物临床试验阶段的进展，研究用新药的产品质量标准和生产方法也应随之而改变。 FDA认识到随着临床试验的推进会导致生产工艺和质量标准发生变更。分析方法可能也需要重新建立，或者在不同阶段要使用不同方法，例如配方的改变可能使过去的分析方法不再适用。所以在临床研究结束时，应更好地建立适当的分析方法，而且操作规程和控制应制定得更具体，因为上述操作规程和控制方法是基于不断得到的科
样 品 制 备 技 术 郭爱和 为得到正确可靠的分析数据，被分析样品的制样技术至关重要，在X射线荧光分析中，制样技术的好坏，将直接影响分析结果的准确度。 一、标准样品（二级标样）的配制 X射线荧光分析与化学分析不同，荧光分析仪是一种相对测量仪器，它是通过测量一定数量已知结果的标准样品，建立相应的正确的数学模型后，才能得到准确的测量结果。也就是说：要达到好的测量效果，一组好标样与一台好仪器同样重要。好仪器由我公司提供，好标样得由用户化验室提供。好标样的标准是：样品具有代表性，细度和均匀度符合标准要求，有一定的梯度范围，有准确的化学分析结果。具体要求如下： z数量：标准样品10-16个，每个标样100-200g。 z代表性：能代表本厂实际生产的样品，是从实际生产线中留取的瞬时样品。 尽量减少人为配制标样，因为人为配制标样的同时会带进人为的因素。不要用国家标样，因为各个厂家原材料不同，配方不同，会得出不同的数学模型。z化学成份的跨度范围： 系列标样中各主要成份应覆盖正常情况下实际生产中各主要成份的变化范围，各主要成份的含量应拉开一定的距离且分布应均匀。以水泥厂生料样品为例：正常生产中，生料中CaO的目标值若为43%左右，则在制备系列标样时，为了使CaO的含量拉开一定距离，CaO含量的最低值应定为39% 左右，CaO含量的最高值应为46% 左右；为使CaO含量均匀分布，系列标样中CaO 含量应大致定为39%（最低值）、40%（次低值）、41%、42%、43%、44%、45%（次高值）、46%（最高值）左右；CaO含量在正常范围内（41．5%-43．5%）的标样可多制备几个。参见表1： 表1为一组生料标样，各主要成分的目标值分别为：
合同编号：WU-PO-195-51 加工制作合同标准样本 In Order T o Protect The Legitimate Rights And Interests Of Each Party, The Cooperative Parties Reach An Agreement Through Common Consultation And Fix The Responsibilities Of Each Party, So As T o Achieve The Effect Of Restricting All Parties 甲方：_________________________ 乙方：_________________________ 时间：________年_____月_____日 A4打印/ 新修订/ 完整/ 内容可编辑
加工制作合同标准样本 使用说明：本合同资料适用于协作的当事人为保障各自的合法权益，经过共同协商达成一致意见并把各方所承担的责任固定下来，从而实现制约各方的效果。资料内容可按真实状况进行条款调整，套用时请仔细阅读。 加工制作合同 合同编号：______________ 订做方（甲方）：____________ 制作方（乙方）：_______科技有限公司 一、品名、规格、单位、数量、单价、金额、交货日期 品名 规格（长*宽*高） 单位 数量 单价（元）
金额（元） 合计人民币金额（大写） 整金额（小写）：￥ 元 交货日期：合同签定起日内 其它说明： ____________ 三、验收标准、方法：按样品工艺为检验标准。 四、包装要求及费用负担 ____________ 五、交货方式及地点：乙方负责送到甲方安装地（北京范围内）。 六、结算方式及期限 ____________ 七、违约责任：双方应严格遵守本合同的约定，
培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶12000g离心，4℃，5min。 ⑷将上清转移至另一只EP管中并编号置于冰上检测浓度 ⑸取少量上清进行定量。（上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5 150ul裂解液则可以取1ul） 1.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。 2.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20l25mg/ml蛋白标准，加入980l 稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。 3.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100lBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。 4.各孔加入200u l BCA工作液， 5.加适当体积样品（上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5150ul裂解液则可以取1ul）到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液（实验用超纯水代替）到20ul。 6.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液（实验用超纯水代替）补足到20u l。37℃放置20-30分钟。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度（1.5~3.5ug/ul）保证加样为40ug左右，充分混合沉淀后加5×loading buffer稀释为1×后100℃，5min。直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天。
标准物质的制备、定值及数据处理上海市计量测试技术研究院王根荣 ?标准物质的制备 标准物质重新制备的管理是根据国家级标准物质技术的要求,对用于化学成分、物理化学特性和工程技术特性等国家级标准物质的研制,标准物质的候选物、制备、均匀性检验、稳定性检验、定值、测量值、测量方法、统计处理、标准值与不确定度、贮存与包装等,可以参照如下技术规范执行。 1国家级标准物质如何选择候选物与制备 1.1候选物 (1候选物的选择应满足适用性、代表性以及容易复制的原则。 (2候选物的基体应和使用的要求相一致或尽可能接近。 (3候选物的均匀性、稳定性及待定特性量的量值范围应适合该标准物质的用途。 (4系列化标准物质特性量的量值分布梯度应满足使用要求,以较少品种复盖预期的范围。 (5候选物应有足够的数量,以满足在有效期间的需要。 1.2制备 (1根据候选物的性质,选择合理的制备程序、工艺,并防止污染及待定特性量的量值变化。 (2对待定特性量不易均匀的候选物,在制备过程中,除采取必要的均匀性措施外,还应进行均匀性初检工作。 (3候选物的待定特性量有不易稳定趋向时,在加工过程中注意研究影响稳定性的因素,采取必要的措施改善其稳定性,如辐照灭菌、添加稳定剂等, 选择合适的贮存环境。
(4当候选物制备量大,为便于保存可采取分级分装。最小包装单元应以适当方式编号,并注明制备日期。 (5最小包装单元中标准物质的实际质量或体积与标称的质量或体积应符合规定的要求。 2国家级标准物质如何进行均匀性检验 2.1不论制备过程中是否经过均匀性初检,凡成批制备并分装成最小包装单元的标准物质必须进行均匀性检验。对于分级分装的标准物质,凡由大包装分装成最小包装单元时,都需要进行均匀性检验。 2.2抽取单元数 抽取单元数对样品总体要有足够的代表性。抽取单元数取决于总体样品的单元数和对样品的均匀程度的了解。当总体样品的单元数较多时,抽取单元也应相应增多。当已知总体样品均匀性良好时, 抽取样品单元数可适当减少。抽取单元数以及每个样品的重复测量次数还应适合所采用的统计检验要求。 (1当总体单元数少于500时,抽取单元数不少于15个,当总体单元数大于500时,抽取单元数不少于25个。 (2对于均匀性良好的样品,当总体单元数少于 500时,抽取单元数不少于10个,当总体单元数大于500时,抽取单元数不少于15个。 2.3取样方式 在均匀性检验取样时,应从待定特性量可能出现差异的部位抽取,取样点的分布对于总体样品有足够的代表性,例如对固体粉状物质应在不同部位取样;对园棒状材料可在两端和棒长的1/4、1/2、 3/4部位取样,在同一断面可沿直径取样。对溶液或气体可在分装的初始、中间和终结阶段取样。当引起待定特性量值的差异原因未知或认为不存在差异时,则进行随机取样。 2.4对具有多种待定特性量值的标准物质,应选择有代表性和不容易均匀的待测特性量值进行均匀性检验。