第八章蛋白质的酶促降解
生物体内的各种蛋白质经常处于动态更新之中，蛋白质的更新包括蛋白质的分解代谢和蛋白质的合成代谢；前者是指蛋白质分解为氨基酸及氨基酸继续分解为含氮的代谢产物、二氧化碳和水并释放出能量的过程。构成蛋白质的氨基酸共有20种，其共同点是均含氨基和羧基，不同点是它们的碳骨架各不相同，因此，脱去氨基后各个氨基酸的碳骨架的分解途径有所不同，这就是个别氨基酸的代谢，也可称之为氨基酸的特殊代谢。以上这些内容均属蛋白质分解代谢的范畴，并且由于这一过程是以氨基酸代谢为中心，故称为蛋白质分解和氨基酸代谢。这是本章的中心内容。此外，蛋白质的营养问题与饮食卫生和临床实践关系密切，亦在本章讨论。
第一节蛋白质的生理功能和营养作用
一、蛋白质和氨基酸的主要生理功能
维持组织的生长、更新和修补，此功能为蛋白质所特有，不能由糖或脂类代替。产生一些生理活性物质，包括胺类、神经递质、激素、嘌呤、嘧啶等。某些蛋白质具有特殊的生理功能，如血红蛋白运输氧，血浆中多种凝血因子参加血液凝固，肌肉中的肌动球蛋白与肌肉收缩有关。此外，酶、抗体、受体都是蛋白质。供给能量，每克蛋白质在体内氧化分解产生17．19kJ(4．1千卡)的能量，蛋白质的这种生理功能可由糖及脂类代替。一般情况下，蛋白质供给的能量占食物总供热量的10％～15％。
二、氮平衡（nitrogen balance）和蛋白质的需要量
体内蛋白质的代谢情况可以根据该实验来评价。蛋白质中氮的平均含量为16%, 食物中的含氮物质主要是蛋白质。故通过测定食物中氮的含量可以推算出其中的蛋白质含量。蛋白质在体内代谢后产生的含氮物质主要经尿、粪、汗排出。因此，测定每天从食物摄入的氮含量和每天排泄物(包括尿、粪、汗等)中的氮含量，可评价蛋白质在体内的代谢情况。
氮的总平衡：摄入氮 = 排出氮，见于正常成人。
氮的正平衡：摄入氮 > 排出氮，表示体内蛋白质的合成大于蛋白质的分解，见于儿童、孕妇及病后恢复期。
氮的负平衡：摄入氮 < 排出氮，常见于蛋白质摄入量不能满足需要时，如长期饥饿、消耗性疾病等。
我国营养学会推荐的蛋白质营养标准成年人为70g／d，相当于每天1～1.2g／kg 体重。婴幼儿与儿童因生长发育需要，应增至每天2～4g／kg体重。
三、必需氨基酸(essential amino acids)与蛋白质的生理价值
必需氨基酸是指体内需要，但人体本身不能合成或合成速度不足以满足需要，必须由食物蛋白质提供的氨基酸，共有8种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫(蛋)氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。此外，组氨酸和精氨酸在婴幼儿和儿童时期因其体内合成量常不能满足生长发育的需要，也必须由食物提供，可称为半必需氨基酸。
非必需氨基酸(non-essential amino acids)是指体内需要，而人体本身可以合成，不必由食物供给的氨基酸，除上述8种必需氨基酸以外的其它组成蛋白质的氨基酸均为非必需氨基酸。
摄入细胞内的氨基酸不可能全部用于合成蛋白质，这是因为食物蛋白质中所含的各种氨基酸在其含量的比例方面与机体本身的蛋白质存在着差异。因此，总有一部分氨基酸不被用来合成机体蛋白质，最后在体内分解。这样，不同的食物蛋白质的利用率就存在差别。利用率愈高的蛋白质对人体的营养价值愈高。衡量某种蛋白质的营养价值的高低，或者说在体内的利用率的高低，最常用的一个指标是“生理价值”。可用正在生长期的幼小动物做实验，测定其体内氮的保留量和吸收量以求得某食物蛋白质的生理价值。
(氮的吸收量 = 食入氮食入氮 - 粪中氮 - 尿中氮)
从食物蛋白质的氨基酸组成来讲，若所含必需氨基酸的种类和数量与人体蛋白质相接近，则易于被机体利用，也就是说氮的保留量高，因此其生理价值亦高。一般讲，动物蛋白质的生理价值较植物蛋白质高。
四、蛋白质的互补作用
若将几种生理价值较低的蛋白质混合食用，可使其所含必需氨基酸成分相互
补充，于是生理价值得以提高。这对增进膳食中蛋白质的营养效果是一个很好的措施。
五、临床上静脉补液用的氨基酸制剂
临床上在治疗因各种原因如烧伤、摄食困难、严重腹泻或外科手术等引起的低蛋白质血症时，常可经静脉补充氨基酸制剂。例如14氨基酸-800，其含有8种必需氨基酸及组、精、甘、丙、丝、脯等共14种氨基酸，总量为8.0g／100ml，其中芳香族氨基酸含量极低，适用于肝硬化等；6氨基酸-520含较高浓度的支链氨基酸(亮、异亮、缬)和鸟氨酸循环(尿素合成)中的氨基酸包括鸟、谷、天冬等共6种，总量5.2g／100m1，适用于重症肝炎等。
第二节蛋白质的消化、吸收与腐败
一、消化
蛋白质的消化部位是胃和小肠(主要在小肠)，受多种蛋白水解酶的催化而水解成氨基酸和少量小肽，然后再吸收。
胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶都是内肽酶，亦即水解肽链内部的肽键；而羧基肽酶A、B和氨基肽酶是外肽酶，其作用是从肽链的最外端开始，前者从C端开始，后者从N端开始。胃蛋白酶的最适pH在1．5～2．5，适于胃内环境，其活性中心含天冬氨酸，属天冬氨酸蛋白酶类。胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶的最适pH在7．0左右，适于小肠环境，其活性中心含丝氨酸，属丝氨酸蛋白酶类。
二、吸收
蛋白质消化的终产物为氨基酸和小肽(主要为二肽、三肽)，可被小肠粘膜所吸收。但小肽吸收进入小肠粘膜细胞后，即被胞质中的肽酶(二肽酶、三肽酶)水解成游离氨基酸，然后离开细胞进入血循环，因此门静脉血中几乎找不到小肽。
氨基酸的吸收机制：
1、通过耗能需Na+的主动转运吸收
肠黏膜上皮细胞的黏膜面的细胞膜上有若干种特殊的运载蛋白(载体)，能与某些氨基酸和Na+在不同位置上同时结合，结合后可使运载蛋白的构象发生改变，从而把膜外(肠腔内)氨基酸和Na+都转运入肠黏膜上皮细胞内。Na+则被钠泵打出至胞外，造成黏膜面内外的Na+梯度，有利于肠腔中的Na+继续通过运载蛋白进入
细胞内，同时带动氨基酸进入。因此肠黏膜上氨基酸的吸收是间接消耗ATP，而直接的推动力是肠腔和肠黏膜细胞内Na+梯度的电位势。氨基酸的不断进入使得小肠黏膜上皮细胞内的氨基酸浓度高于毛细血管内，于是氨基酸通过浆膜面其相应的载体而转运至毛细血管血液内。黏膜面的氨基酸载体是Na+依赖的，而浆膜面的氨基酸载体则不依赖Na+。现已证实前者至少有6种，各对某些氨基酸起转运作用：①中性氨基酸，短侧链或极性侧链(丝、苏、丙) 载体。②中性氨基酸，芳香族或疏水侧链(苯丙、酪、甲硫、缬、亮、异亮) 载体。③亚氨基酸(脯、羟脯) 载体。④β-氨基酸(β-丙氨酸、牛磺酸) 载体。⑤碱性氨基酸和胱氨酸(赖、精、胱) 载体。⑥酸性氨基酸(天、谷) 载体。
肾小管对氨基酸的重吸收也是通过上述机制进行的。
2、通过γ-谷氨酰基循环吸收
1969年Meister发现；小肠黏膜和肾小管还可通过γ-谷氨酰基循环吸收氨基酸。谷胱甘肽在这一循环中起着重要作用。这也是一个主动运送氨基酸通过细胞膜的过程，氨基酸在进入细胞之前先在细胞膜上转肽酶的催化下，与细胞内的谷胱甘肽作用生成γ-谷氨酰氨基酸并进入细胞浆内，然后再经其它酶催化将氨基酸释放出来，同时使谷氨酸重新合成谷胱甘肽，进行下一次转运氨基酸的过程，因为氨基酸不能自由通透过细胞质膜。
三、腐败
未被吸收的氨基酸和小肽及未被消化的蛋白质，在大肠下部受大肠杆菌的作用，发生一些化学变化的过程称腐败。未被消化的蛋白质先被肠菌中的蛋白酶水解为氨基酸，然后再继续受肠菌中的其它酶类的催化。
腐败作用主要的化学反应有脱羧基作用和还原脱氨基作用。
(一) 脱羧基生成胺
(二) 还原脱氨基及生成其它有毒物质
肠道中氨的除上述腐败作用产生外，尚有另一个来源，即血液中的尿素约有25％可渗透进入肠道，受大肠杆菌的尿素酶的作用水解生成氨，被重吸收进入体内，再到达肝脏合成尿素，这就是尿素的肠肝循环。平均每天约有7g尿素渗入肠道，而粪便中几乎不含尿素，这是由于渗入肠道的尿素全部被大肠杆菌分解成氨而吸收，这部分氨的量约为4g。
自肠道吸收入体内的氨，是体内血氨的重要来源之一，正常人可将氨在肝脏合成尿素后排出，食用普通膳食的正常人每天排尿素约20g。严重肝脏疾病患者因其处理血氨的能力下降，常可引起肝昏迷，因此，临床上常给予肠道抑菌药物以减少肠道中氨的产生。
腐败作用产生的有毒物质除了胺和氨以外、还包括苯酚、吲哚、甲烷、CO
、
2有机酸和硫化氢等，这些物质大部分随粪便排出，小部分可被肠道吸收，进入肝脏予以处理。
第三节氨基酸的一般代谢
食物蛋白质经消化吸收，以氨基酸形式进入血液循环及全身各组织，组织蛋白质又经常降解为氨基酸，这两种来源的氨基酸(外源性和内源性)混合在一起，存在于细胞内液、血液和其它体液中，总称为氨基酸代谢库。
血浆中氨基酸的浓度取决于内源性蛋白质的分解释放与各种组织利用之间的稳态平衡．人体每天更新机体总蛋白质的1％-2％，其中主要是肌肉蛋白质，其释放的游离氨基酸占体内氨基酸库中氨基酸总量的一半以上。氨基酸的分解代谢过程主要在肝脏进行，肝脏在处理氨基酸代谢过程中生成的氨起着至关重要的作用，这是由于肝脏中存在合成尿素的酶，因此肌肉和肝脏对维持血液循环中氨基酸水平起重要的作用。
氨基酸的主要功能是构成体内各种蛋白质和其它某些生物分子，与糖或脂肪不同，氨基酸的供给量若超过所需时，过多部分并不能储存或排出体外，而是作为燃料或转变为糖或脂肪。此时它的α-氨基必须先脱去(脱氨基作用)，剩下的碳骨架则转变为代谢中间产物如乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A、丙酮酸或三羧酸循环中的某个中间产物。人体每天更新机体总蛋白的1％-2％，一般讲，组织蛋白质分解生成的内源性氨基酸中约85％可被再利用以合成组织蛋白质。
一、氨基酸的脱氨基作用(deamination)
（一）L-谷氨酸氧化脱氨基作用(oxidative deamination of L-glutamate) 线粒体基质中存在L-谷氨酸脱氢酶，该酶催化L-谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸，反应可逆。L-谷氨酸脱氢酶属不需氧脱氢酶，辅酶是NAD+或NADP+，特异性强，分布广泛，肝脏中含量最为丰富，其次是肾、脑，心、肺等，骨骼肌中最少。L-谷氨酸脱氢酶是别构酶；由六个相同的亚基组成，分子质量为330,000。
ATP、GTP是其别构抑制剂，而ADP、GDP是别构激活剂。一般情况下，反应偏向于谷氨酸的合成，但当谷氨酸浓度高，氨浓度低时，则有利于α-酮戊二酸的生成，即催化L-谷氨酸氧化脱氨。
(二)转氨基作用（transamination）
转氨基作用是在转氨酶的催化下，α-氨基酸的氨基转移到α-酮酸的酮基上，生成相应的氨基酸，原来的氨基酸则转变为α-酮酸。
转氨酶分布广泛，除赖、苏、脯、羟脯氨酸外（例如，由于相应于赖氨酸的α-酮酸不稳定，所以赖氨酸不能通过转氨作用生成），体内大多数氨基酸都可以经转氨基作用生成。转氨基作用的平衡常数接近1.0，为可逆反应，因此也是体内合成非必需氨基酸的重要途径。
AST和ALT都是细胞内酶，正常人血清中含量甚微，若因疾病造成组织细胞破损或细胞膜通透性增加，则它们在血清中的浓度大大增高，例如，心肌梗死患者血清AST常升高，传染性肝炎患者可表现为血清ALT升高，所以，临床上两者可分别作为判断这两个组织功能正常与否的辅助指标。
)，起着传递氨基的作用。
转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛(含维生素B
6
经转氨基作用，α—酮戊二酸可以接收许多氨基酸中的氨基形成谷氨酸。(三) 联合脱氨基作用（combined deamination）
上述转氨基作用虽然是体内普遍存在的一种脱氨基方式，但它仅仅是将氨基转移到α-酮酸分子上生成另一分子氨基酸，从整体上看，氨基并未脱去。而氧化脱氨基作用仅限于L-谷氨酸，其它氨基酸并不能直接经这一途径脱去氨基。事实上，体内绝大多数氨基酸的脱氨基作用，是上述两种方式联合的结果，即氨基酸的脱氨基既经转氨基作用，又通过L-谷氨酸氧化脱氨基作用，是转氨基作用和谷氨酸氧化脱氨基作用偶联的过程，这种方式称为联合脱氨基作用。这是体内主要的脱氨基方式，反应可逆，也是体内合成非必需氨基酸的重要途径。(四) 嘌吟核苷酸循环（purine nucleotide cycle）
骨骼肌中谷氨酸脱氢酶活性很低，氨基酸可通过嘌呤核苷酸循环而脱去氨基，这可能是骨骼肌中的氨基酸主要的脱氨基方式。
氨基酸通过转氨基作用生成的天冬氨酸，后者再和次黄嘌呤核苷酸(IMP)反应生成腺苷酸代琥珀酸，然后裂解出延胡索酸，同时生成腺嘌呤核苷酸(AMP)，
AMP又在腺苷酸脱氨酶催化下脱去氨基，最终完成了氨基酸的脱氨基作用。IMP 可以再参加循环。由此可见，嘌吟核苷酸循环实际上也可以看成是另一种形式的联合脱氨基作用。
（五）非氧化脱氨基作用（non-oxidative deamination）
1．脱水脱氨基，主要是指一些含羟基的氨基酸。
2．直接脱氨基
二、氨的代谢(metabolism of ammonia)
氨有毒且能渗透进细胞膜与血脑屏障，对细胞尤其是中枢神经系统来说是有害物质，故氨在体内不能积聚；必须加以处理。通常情况下，细胞内氨浓度很低。正常人血氨浓度< 0.1mg／100m1。严重肝病时，可引起血氨浓度升高，是导致肝昏迷的主要原因。氨既是有毒的废物，又是生物合成某些含氮物质所需的氮源，在体内氨可经历不同的途径进行代谢。
(一)体内氨的来源(source of ammonia)
1.体内各组织中氨基酸的脱氨作用
氨基酸经脱氨基后产生氨和α-酮酸。此外，氨基酸脱羧基后所产生的胺，经胺氧化酶作用，也可分解产生氨。
2.肾小管上皮细胞分泌的氨
肾小管上皮细胞中的谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下水解成谷氨酸和氨，这些氨不释放进血液，而是分泌到肾小管管腔中与尿液中H+结合后再以铵盐形式随尿排出。代谢性酸中毒时，肾脏增加了其对谷氨酰胺的分解，加速氨的排出，以缓解酸中毒。
3．肠道吸收的氨①腐败作用产生的氨(见第二节)。②血液中尿素扩散渗透进入肠道，在大肠杆菌的脲酶(尿素酶)的作用下生成的氨。
(二) 氨在体内的运输(transportation of ammonia)
氨是有毒物质，机体最主要的处理氨的措施是在肝脏中转变成无毒的尿素再经肾脏排出体外。但各组织产生的氨是不能以游离氨的形式经血液运输至肝脏的，而是以谷氨酰胺和丙氨酸两种形式运输的。
1．谷氨酰胺转运氨(glutamine transporting ammonia)
在脑、肌肉等组织中，谷氨酰胺合成酶的活性较高，它催化氨与谷氨酸反应
生成谷氨酰胺，反应需要消耗ATP，谷氨酰胺由血液运送至肝或肾，再经谷氨酰胺酶催化，水解释放出氨。谷氨酰胺的合成和分解是由不同的酶催化的不可逆反应。由谷氨酰胺分解生成的氨可在肝脏中合成尿素，或在肾脏中生成铵盐后随尿排出，少量的谷氨酰胺在各组织中也可被直接利用，例如，参与嘌呤核苷酸合成。由此可见，谷氨酰胺既是氨的解毒产物，又是氨的暂时储存及运输形式，故正常情况下，谷氨酰胺在血液中浓度远远高于其它氨基酸。在脑组织中，谷氨酰胺在固定氨和转运氨方面均起着重要作用。因此，临床上对氨中毒患者也可通过补充谷氨酸盐来降低氨浓度。
2.葡萄糖—丙氨酸循环(glucose-alanine cycle)
肌肉中的氨是如何运输到肝脏的呢？在骨骼肌中，氨和丙酮酸作用(转氨基或联合脱氨基方式)生成丙氨酸，后者被释放入血，经血液运至肝脏后再经联合脱氨基作用释放出氨用于合成尿素。丙酮酸则在肝脏中经糖异生作用转变成葡萄糖，后者再运至肌肉中，在肌肉收缩时又转变成丙酮酸，加氨再转变为丙氨酸，此即葡萄糖-丙氨酸循环，通过这一循环，可使肌肉中的氨以无毒的丙氨酸形式运输到肝，与此同时，肝脏又为肌肉组织提供了能生成丙酮酸的葡萄糖。所以丙氨酸亦是氨的一种暂时储存和运输的形式。
丙氨酸是糖异生中的关键性氨基酸。在肝脏，从丙氨酸合成葡萄糖的速率远远超过其它氨基酸，直到丙氨酸浓度达到生理水平的20—30倍时，肝脏将丙氨酸异生成葡萄糖的能力才达到饱和。
(三)尿素的合成(formation of urea)——体内氨的主要去路
上述氨用于合成谷氨酰胺或者其它氨基酸，是氨的储存或再利用。若氨作为废物排出体外，不同动物则以不同形式排出。有些可以直接排氨；有些则把氨转变成尿酸排出体外；人类及其他哺乳动物主要以尿素的形式排出氨。
尿素是氨代谢的最终产物，无毒性，水溶性强，可由肾脏经尿排出，从量上讲是氨的主要去路，是氨或蛋白质中的氮的最主要终产物。成人排出氮的80％～90％是尿素中的氮。
尿素主要在肝脏中合成，其他器官如肾及脑等虽也能合成，但其量甚微，动物实验发现，若将犬的肝脏切除，则血液及尿中的尿素含量显著降低；急性肝坏死患者的血液及尿中含尿素亦极低。
尿素在体内的合成全过程称鸟氨酸循环(ornithine cycle)，系1932年Krebs
等提出，他们认为尿素是由1分子CO
2和2分子NH
3
经过此循环而生成的。用核
素标记的15NH
4C1饲犬，则随尿排出的尿素分子中含有15N，若用核素标记的NaH14CO
3
饲犬，则随尿排出的尿素分子中含有14C，这些实验确证尿素可由NH
3及C0
2
合成。
此外，还证实了鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸都参与了尿素的合成，并可循环使用，故称鸟氨酸循环。
根据近代的研究证实，鸟氨酸循环的详细过程比较复杂，现分四步分述于下：
(1) 氨基甲酰磷酸的合成：来自外周组织或肝脏自身代谢所生成的NH
3及C0
2
，
首先在肝细胞内合成氨基甲酰磷酸，此反应由存在于线粒体中的氨基甲酰磷酸合成酶I (carbamoyl-phosphate synthetase I)催化，并需ATP提供能量。氨甲酰磷酸合成酶I是肝线粒体中最丰富的酶之一，占线粒体基质内总蛋白质的20％以上.氨基甲酰磷酸合成酶I是一个别构酶，该酶只有在别构激活剂N-乙酰谷氨酸(N—acetylglutamic acid，AGA)存在时才能被激活，AGA与酶结合可诱导酶的构象改变，进而增加合成酶对ATP的亲和力。氨基甲酰磷酸合酶I的活性是由其别构激活剂AGA的稳态浓度所决定。这种稳态水平又是由乙酰CoA和谷氨酸合成AGA的速率，以及将AGA水解生成乙酸和谷氨酸的速率所决定。由于AGA是乙酰CoA和谷氨酸在N—乙酰谷氨酸合成酶(N—acetylglutamate synthase)的催化下形成的。所以氨基酸分解速度加快可导致谷氨酸浓度的升高，AGA浓度也随之增加。通过AGA对氨甲酰磷酸合成酶I的激活作用可以使鸟氨酸循环的氨甲酰磷酸的量增加。
细胞内有两种氨基甲酰磷酸合成酶，即合成酶I和Ⅱ，它们催化反应所生成的产物都是氨基甲酰磷酸。但两者处于不同的代谢途径中，合成酶I位于肝细胞
线粒体中，以C0
2和NH
3
合成氨基甲酰磷酸，后者参与尿素合成; 合成酶Ⅱ位于
生长迅速的组织细胞的胞质中，它以谷氨酰胺作为氮源，也是催化氨基酰磷酸的合成，但这里生成的氨基酰磷酸与嘧啶合成有关。谷氨酰胺的侧链酰胺是在合成酶II分子中的一个部位内被水解，有趣的是尽管在合成酶I中也存在着同样的部位，但其却未显示出类似于合成酶II的催化活性。在合成酶I中，该部位是和该酶的别构激活剂AGA结合。
(2)瓜氨酸的合成：氨基甲酰磷酸在线粒体内经鸟氨酸氨基甲酰转移酶
(ornithine carbamoyltransferase，OCT)的催化，将氨基甲酰转移至鸟氨酸而合成瓜氨酸(citrulline)。
(3) 精氨酸的合成：瓜氨酸在线粒体内合成后，即被转运到线粒体外，在胞质中经精氨酸代琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase，ASAS)的催化，与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸，后者再受精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASAL)的作用，裂解为精氨酸及延胡索酸。
在上述反应中，天冬氨酸起供给氨基的作用，而其本身又可由草酰乙酸与谷氨酸经转氨基作用再生成。谷氨酸的氨基可来自体内多种氨基酸。由此可见，多种氨基酸的氨基可通过天冬氨酸而参加尿素合成。
在鸟氨酸循环中形成的延胡索酸使鸟氨酸循环和三羧酸循环紧密联系在一起，如（a）在线粒体中,通过草酰乙酸和谷氨酸之间转氨基作用生成的天冬氨酸能转移到胞质，在胞质中，天冬氨酸作为鸟氨酸循环中的氨基供体。（b）精氨酸代琥珀酸裂解生成的延胡索酸可转变为苹果酸，苹果酸进一步氧化生成草酰乙酸，这两个反应与三羧酸循环中的反应相似，但前者是由胞质中的延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶催化的。理论上说，鸟氨酸循环是和三羧酸循环互相连接，这里的草酰乙酸既可进入三羧酸循环，也可经转氨作用再次形成天冬氨酸进入鸟氨酸循环。然而，因每一个循环是独立运转的并且它们之间的联系程度取决于关键性的中间产物，如延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸等在线粒体和胞质之间的转运情况，即：这些中间产物既可在胞质中被进一步代谢，也可转移到线粒体中参与三羧酸循环。
(4)精氨酸水解生成尿素：在胞质中形成的精氨酸受精氨酸酶(arginase)的催化生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸再进入线粒体参与瓜氨酸的合成，通过鸟氨酸循环，如此周而复始地促进尿素的生成。
在上述反应中，鸟氨酸、赖氨酸均可与精氨酸竞争和精氨酸酶结合，是精氨酸酶强有力的抑制剂。
尿素的生物合成是一个循环的过程。在反应开始时消耗的鸟氨酸在反应末又重新生成，整个循环中没有鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸代琥珀酸或精氨酸的净丢失
、ATP和天冬氨酸。
或净增加。只消耗了氨、C0
2
尿素分子中两个氨基，一个来自氨，另一个来自天冬氨酸，而天冬氨酸又可
由其它氨基酸通过转氨基作用生成。由此可见，尿素分子中的两个氨基虽然来源
不同但均直接或间接来自各种氨基酸的氨基。
从以上鸟氨酸循环可以看出，形成一分子尿素可清除两分子氨和一分子C0
2
。
尿素属中性无毒物质，所以尿素的合成不仅可消除氨的毒性，还可减少C0
2
溶于血液所产生的酸性。
机体在将有毒的氨转换成尿素的过程是消耗能量的，合成氨甲酰磷酸时消耗了两分子ATP，而在合成精氨琥珀酸时表面上虽然消耗了一分子ATP，但由于生成了AMP和焦磷酸，这一过程实际上是水解了两个高能磷酸键。所以相当于消耗了两分子ATP，因此生成一分子尿素实际上共消耗四分子ATP.
尿素合成的总反应可表示如下：
NH
3 + CO
2
+ 天冬氨酸 + 3ATP + 2H
2
O 尿素 + 延胡索酸 + 2ADP + AMP +
4Pi
(四) 尿素合成的调控
1. 食物的影响高蛋白膳食使尿素合成速度加快，排泄的含氮物中尿素占80％～90％，低蛋白膳食使尿素合成速度减慢，排泄的含氮物中尿素可低至60％或更低。动物实验表明，饮食变化大时可以使动物体内鸟氨酸循环中的酶浓度改变达到10倍至20倍，推测人体也可出现相同的情况。例如饥饿时，能引起合成尿素的酶的水平上升，毫无疑问,增高的酶浓度是用以处置因蛋白质分解的增加而伴随的过量氨的生成。
2．氨基甲酰磷酸合成酶I的影响氨基甲酰磷酸为尿素分子中氮的主要来源，它的合成由氨基甲酰磷酸合成酶I所催化，前已述及, AGA是此酶的别构激活剂。AGA由乙酰辅酶A与谷氨酸经AGA合成酶的催化而合成，而精氨酸又是AGA合成酶的激活剂。
3．鸟氨酸循环的中间产物的影响循环的中间产物如鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸的浓度均可影响尿素的合成速度，例如供给充足的精氨酸就可有足够的鸟氨酸以加速循环的进行。
4．鸟氨酸循环中的酶系的影响循环中的各种酶系中以精氨酸代琥珀酸合成酶的活性最低，因此是尿素合成的限速酶。
鸟氨酸循环是处理氨的主要途径。各种因素(包括酶的遗传缺陷等)导致的鸟
氨酸循环障碍，均可使血氨浓度升高，甚至引起肝昏迷，可能和以下因素有关：脑组织仅能合成极少量尿素，故在脑组织中解除氨毒性的主要机制是形成谷氨酰胺。当血氨浓度升高时，原先由机体供给脑组织的血谷氨酸显然就不足以将过量的氨转变成谷氨酰胺，因此，脑组织必须动用α-酮戊二酸来合成谷氨酸。由于谷氨酸脱氢酶催化的反应趋向谷氨酸的生成，这一反应不仅消耗了NADH，也导致了三羧酸循环中α-酮戊二酸量的减少。此外，合成谷氨酰胺时又需要ATP 供能, 故谷氨酸和谷氨酰胺的大量合成严重干扰了脑组织中的能量代谢。总之，过量的有毒的氨明显地减少了脑组织中ATP的含量。谷氨酸水平的降低也影响了γ-氨基丁酸(一种重要的抑制性神经递质，由谷氨酸脱羧形成)的合成，因此，脑组织对氨的敏感性反应不仅包括ATP生成减少，同样涉及神经递质的耗尽。临床上常根据不同的发病原因采取不同的措施,如限制高蛋白的摄入,补充适量的精氨酸及与必需氨基酸相应的α-酮酸等来进行治疗，但肝昏迷发病机制十分复杂，还有其它学说进行解释。
三、α-酮酸的代谢
氨基酸经脱氨基后所生成的α-酮酸可以有以下三条去路：
(一) 合成非必需氨基酸
经还原加氨或转氨作用，α-酮酸可以合成非必需氨基酸。某一种α-酮酸也可在代谢中转变成其他α-酮酸后再经氨基化生成另一种非必需氨基酸。
(二) 转变成糖或脂肪
早期(1920～1940年)营养学的研究已证明氨基酸在体内可以转变成糖类或脂肪(或酮体)。分别用各种氨基酸饲养人工糖尿病犬，某些氨基酸可以增加尿中葡萄糖的排泄量，有的增加尿中酮体的排泄量，也有的既增加葡萄糖同时还增加酮体的排泄量。
各种氨基酸的碳骨架差异很大，所生成的α-酮酸各不相同，其分解代谢途径当然各异，但是最后都可与糖、脂肪的中间代谢产物尤其是三羧酸循环的中间产物相联系，于是转变成糖、脂肪或酮体。
由图可看出某一氨基酸是生糖、生酮或生糖兼生酮，并且还可看出糖、脂肪、蛋白质三类物质之间可以互相转变，而三羧酸循环是三者互变的重要枢纽。
(三) 氧化供能
氨基酸可通过转变成三羧酸循环的中间产物氧化供能。
四、氨基酸的脱羧基作用(decarboxylation)
氨基酸除脱去氨基的分解代谢途径外，也可以脱去羧基产生相应的胺类，催化此反应的酶是氨基酸脱羧酶类(amino acid decarboxylases)，其辅酶为磷酸吡哆醛。
氨基酸的脱羧基作用从量上讲并不占主要地位，但其产物胺类一般都具有重要生理作用，例如：谷氨酸的脱羧基产物γ-氨基丁酸，色氨酸经羟化及脱羧基后的产物5-羟色胺等。
(一) γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)
脑组织中的谷氨酸脱羧酶活性很高，因而该组织中γ-氨基丁酸浓度较高，其作用是抑制突触传导，可能是一种抑制性神经递质。
(二)5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)
5-羟色胺也是一种神经递质，在大脑皮质及神经突触内含量很高。在外周组织，5-羟色胺是一种强血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂。
(三) 牛磺酸
牛磺酸(taurine)是结合胆汁酸的组成成分，由半胱氨酸经氧化、脱羧后生成。
(四) 组胺
组胺(histamine)为组氨酸脱去羧基后的产物，在体内分布广泛，主要存在于胃黏膜、肝脏和肌肉等组织中。组胺具有很强的扩血管作用，并能使毛细血管通透性增加。在机体的炎症及创伤部位常有组胺释放。组胺还具有促进平滑肌收缩及分泌胃酸的作用。
(五) 多胺
多胺(polyamines)是指一类具有3个或3个以上氨基的化合物，主要有精脒(spermidine)和精胺(spermine)，均为鸟氨酸的代谢产物。
精脒和精胺能促进核酸和蛋白质的生物合成，故其最重要的生理功能是与细胞增殖及生长相关，这是因为多胺带有多个正电荷，能吸引DNA和RNA之类的多聚阴离子，从而刺激DNA和RNA合成。已有的研究表明；在一些生长旺盛的组织和肿瘤组织中，和多胺合成有关的鸟氨酸脱羧酶活性很高，多胺含量也很高。
第九章蛋白质的酶促降解和氨基酸代谢 一、填空题： 1、氨的同化途径有和。 2、尿素分子中的两个N原子，一个来自，另一个来自。 3、尿素循环中产生的两种氨基酸和不参与生物体内蛋白质的合成。 4、谷氨酸族氨基酸的共同碳架来源是途径的中间产物。 5、芳香族氨基酸生物合成途径叫途径，其碳架来源于糖酵解的中间产 物和磷酸戊糖途径的中间产物。 6、在尿素循环中，水解产生尿素和鸟氨酸，故此循环又称鸟氨酸循环。 7、氨基酸共有的代谢途径有和。 8、人类对氨基代谢的终产物是，鸟类对氨基代谢的终产物是。 9、由尿素合成过程中产生的两种氨基酸和不参与人体内蛋白质合成。 二、选择题(只有一个最佳答案)： 1、成人体内氨的最主要代谢去路为（） A、合成非必需氨基酸 B、合成必需氨基酸 C、合成NH4+随尿排出 D、合成尿素 2、鸟氨酸循环中，合成尿素的第二分子氨来源于（） A、游离氨 B、谷氨酰胺 C、天冬酰胺 D、天冬氨酸 3、下列哪一种氨基酸经过转氨作用可生成草酰乙酸？（） A、谷氨酸 B、丙氨酸 C、苏氨酸 D、天冬氨酸 4、能直接转变为α-酮戊二酸的氨基酸为（） A、天冬氨酸 B、丙氨酸 C、谷氨酸 D、谷氨酰胺 5、在尿素循环中，下列哪一项反应需要ATP（） A、精氨酸→鸟氨酸+ 尿素 B、鸟氨酸+ 氨甲酰磷酸→瓜氨酸 C、瓜氨酸+ 天冬氨酸→精氨酸+ 延胡索酸 D、延胡索酸→苹果酸 6、下列氨基酸经转氨作用可生成丙酮酸的（） A、Glu B、Ala C、Lys D、Ser 7、关于谷氨酸脱氢酶的表述哪项是正确的（） A、它是植物体内合成氨基酸的主要途径 B、它所需要的供氢体是NADH C、它可以催化由谷氨酸形成α-酮戊二酸反应 D、它和谷氨酰胺合成酶一样，需要ATP供能 8、经转氨作用可生成草酰乙酸的氨基酸是（） A、Ala B、Asp C、Glu D、Thr 9、除哪一种氨基酸外，其余氨基酸具有共同的碳架来源（） A、Asp B、Met C、Lys D、Arg 10、所有的转氨酶均含有共同的辅因子（）
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
蛋白质的降解
第六章蛋白质的降解及其生物学意义 ?第一节蛋白质降解的概述 ?第二节参与蛋白质降解的酶类 ?第三节蛋白酶体-泛素系统及其功能 ?第四节蛋白质降解的生物学意义 蛋白质降解是生命的重要过程 ?维持细胞的稳态。 ?清除因突变、热或氧化胁迫造成的错误折叠的蛋白质，防止形成细胞内凝集。 ?及时终止不同生命时期调节蛋白的生物活性。 ?蛋白质的过度降解也是有害的，蛋白质的降解必须受到空间和时间上 蛋白质降解的体系 ?蛋白质消化分解为被机体吸收的营养物质。 ?研究蛋白质结构时，用蛋白酶降解肽链。 ?蛋白质新生肽链生物合成以及新生肽链折叠的过程中，质量的控制都与“次品”的降解有关。 ?蛋白质在行使功能时，很多调节控制都与肽键的断裂有关，如前肽的切除、无活性的前体蛋白质的激活等。 第一节蛋白质降解的概述 蛋白质的寿命 ?细胞内绝大多数蛋白质的降解是服从一级反应动力学。半衰期介于几十秒到百余天，大多数是70～80d。 ?哺乳动物细胞内各种蛋白质的平均周转率为1 ～ 2d。代谢过程中的关键酶以及处于分支点的酶寿命仅几分钟，有利于体内稳态在情况改变后快速建立。 –大鼠肝脏的鸟氨酸脱羧酶半衰期仅11min，是大鼠肝脏中降解最快的蛋白质。 –肌肉肌动蛋白和肌球蛋白的寿命约l～2w。 –血红蛋白的寿命超过一个月。 ?蛋白质的半衰期并不恒定，与细胞的生理状态密切相关。 蛋白质寿命的N端规则 ?N端规则：细胞质中蛋白质的寿命与肽链的N端氨基酸残基的性质有一定的关系。 ?N端的氨基酸残基为D、R、L、K和F的蛋白质，其半衰期只有2~3min。 ?N端的氨基酸残基为A、G、M和V的蛋白质，它们在原核细胞中的半衰期可超过10h，而在真核细胞中甚至可超过20h。 酿酒酵母蛋白质代谢特点 ?酿酒酵母中不稳定蛋白的N端氨基酸残基有12个： Asn（B）、Asp（D）、Glu（E）、Phe （F）、His（H）、Ile（I）、Leu（L）、Lys（K）、Arg（R）、Trp（W）、Tyr（Y）和Gln （Z）。 ?酵母中存在切除N端甲硫氨酸的氨肽酶，它作用的蛋白质底物的N端第二个氨基酸一定是N端规则中的氨基酸残基。 PEST假设 ?PEST（Pro-Glu-Ser-Thr）假设：认为含有序列为PEST肽段的蛋白质，在细胞质中很快被降解，在这个亲水的区域附近常有碱性残基。 ?PEST肽段的缺失，可以延长此突变蛋白质的寿命。 ?在22个快速降解的蛋白质中有20个是含有PEST序列。
读书报告 钙蛋白酶抑制蛋白研究进展 汪超钟正泽杨飞云周晓蓉曹兰 （重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460） 摘要：钙蛋白酶在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度，钙蛋白酶抑制蛋白是在细胞内广泛表达的、高效的、专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质，因此引起了广大研究者的广泛关注。本文阐述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构，生物学作用，营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其活性测定方法。 关键词：钙蛋白酶抑制蛋白结构生物学作用活性测定 Research Progress of Calpastatin W ang chao, Zhong zhengzhe, Y ang feiyun, Zhou xiaorong ,Cao lan (Chongqing Academy of Animal Science,Rongchong 402460 ) Abstact: Calpain make a contribution to Meat Tenderization by degradation of protein in the postmortem meat tenderization process. Calpastatin , a special endogenous inhibitor expressed extensively in cell , has a special inhibition to calpain. Therefore ,This paper review the structure ,biologic function, influenced factors , separation and activity assay of calpastatin. Key words: Calpastatin. Structure , Biologic function, influenced factors , activity assay 钙蛋白酶(Calpain)是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶，分布于所有脊椎动物的肌细胞内部。钙蛋白酶家族包括μ-钙蛋白酶,m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。钙蛋白酶在骨骼肌中通过涉及生肌细胞分化、激发肌原纤维蛋白周转来调控生长，同时在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度。钙蛋白酶被钙离子和钙蛋白酶抑制蛋白调控[1]。钙蛋白酶抑制蛋白是一种有着多种功能的内源抑制剂，它通过抑制钙蛋白酶而发挥作用。本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、生物学作用、营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其分离与活性检测方法等。 1 钙蛋白酶抑制蛋白的结构 肌肉组织中钙蛋白酶抑制蛋白的分子量为77 KDa，斯托克半径为6.8nm，含
动物蛋白酶解研究（I） 北京工商大学宋焕禄 天调食品配料有限公司廖国洪 摘要 本文主要目的是以美拉德（Maillard）反应产物（MRPs）的风味为判断依据，以水解度(DH)为动物蛋白酶解液——Maillard反应底物之一的特征性指标，根据MRPs 的风味确定动物蛋白水解液的最佳DH或DH范围。实验的主要内容包括： 1.以牛肉为酶解底物，对所用的几种蛋白酶进行酶活测定 2.确定各酶的适宜加量和反应时间 3.确定最佳酶组合及其最佳反应条件 4.用最佳反应条件下制得的动物蛋白水解液进行Maillard反应，感官评定产物风味。 关键词动物蛋白水解液水解度（DH）酶解Maillard反应 1．概述 1.1肉味香精研究进展 肉味香精研究及生产中有关肉味形成机理的报道很多。随着肉味香精的需求量日益增加，有关肉味香精的研究也不断深入和扩展。肉味香精中各种香味物质的形成主要是通过Maillard反应产生。参与反应的底物中氨基酸或多肽对风味物质的形成有重要影响。根据已有的研究结果，通常认为，Maillard反应产物中含硫化合物、杂环化合物和羰基化合物对肉味形成有重要影响[1]。这些风味物质的形成机理极其复杂。杂环化合物中以吡咯类、吡嗪类、噻吩类等化合物贡献较大[2]。 对Maillard反应产物的一系列研究表明，它还具有抗氧化、抗诱变等多种性能[3]。 此外，人们还从蛋白质结构及肽键顺序等方面对Maillard反应产物进行分析，以期找到它们与产物风味之间的某种关系[4]。 酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。与已有的生产方法相比，酶解法有很多优点，因此对酶法生产动物蛋白水解液的研究很受重视。人们从酶解机理、酶解原料、酶及酶解液等多方面进行了大量深入研究。G.M.O′Meara和P.A.Munro以米氏方程和兰格缪尔等温吸附模型为基础，研究了瘦肉的酶解动力 [5]，并对酶解反应的影响因素如pH值、温度、时间、酶/底物比及底物浓度分别 进行研究[6]。研究者还试图从不同途径寻找更有效的酶，研究酶的性质、结构、作用特点、反应条件以及单、多酶水解效果的比较、不同底物水解效果的比较,等等[7]。 人们还注意到，由于水解条件的变化，得到的水解液有时会含有苦味，并影响到后面的Maillard反应产物的风味。研究认为，其原因是某种蛋白质含有疏水性氨基酸，它们常隐藏在蛋白质内部中，一旦水解暴露出来就会显出苦味[8,9]。生产动物蛋白水解液的原料由于价格问题，生产成本一直降不下来。近年来人们一
第八章蛋白质的酶促降解 生物体内的各种蛋白质经常处于动态更新之中，蛋白质的更新包括蛋白质的分解代谢和蛋白质的合成代谢；前者是指蛋白质分解为氨基酸及氨基酸继续分解为含氮的代谢产物、二氧化碳和水并释放出能量的过程。构成蛋白质的氨基酸共有20种，其共同点是均含氨基和羧基，不同点是它们的碳骨架各不相同，因此，脱去氨基后各个氨基酸的碳骨架的分解途径有所不同，这就是个别氨基酸的代谢，也可称之为氨基酸的特殊代谢。以上这些内容均属蛋白质分解代谢的范畴，并且由于这一过程是以氨基酸代谢为中心，故称为蛋白质分解和氨基酸代谢。这是本章的中心内容。此外，蛋白质的营养问题与饮食卫生和临床实践关系密切，亦在本章讨论。 第一节蛋白质的生理功能和营养作用 一、蛋白质和氨基酸的主要生理功能 维持组织的生长、更新和修补，此功能为蛋白质所特有，不能由糖或脂类代替。产生一些生理活性物质，包括胺类、神经递质、激素、嘌呤、嘧啶等。某些蛋白质具有特殊的生理功能，如血红蛋白运输氧，血浆中多种凝血因子参加血液凝固，肌肉中的肌动球蛋白与肌肉收缩有关。此外，酶、抗体、受体都是蛋白质。供给能量，每克蛋白质在体内氧化分解产生17．19kJ(4．1千卡)的能量，蛋白质的这种生理功能可由糖及脂类代替。一般情况下，蛋白质供给的能量占食物总供热量的10％～15％。 二、氮平衡（nitrogen balance）和蛋白质的需要量 体内蛋白质的代谢情况可以根据该实验来评价。蛋白质中氮的平均含量为16%, 食物中的含氮物质主要是蛋白质。故通过测定食物中氮的含量可以推算出其中的蛋白质含量。蛋白质在体内代谢后产生的含氮物质主要经尿、粪、汗排出。因此，测定每天从食物摄入的氮含量和每天排泄物(包括尿、粪、汗等)中的氮含量，可评价蛋白质在体内的代谢情况。 氮的总平衡：摄入氮 = 排出氮，见于正常成人。 氮的正平衡：摄入氮 > 排出氮，表示体内蛋白质的合成大于蛋白质的分解，见于儿童、孕妇及病后恢复期。
蛋白酶抑制剂选择指南 1 蛋白酶抑制剂选择指南 抑制剂 工作浓度 分子量 抑制蛋白酶种类 稳定性 AEBSF终浓度1mM MW:239.5不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜 蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶. 可溶于水,其pH7的水溶液在4o C可保持稳定1-2个月,在pH>8的情况下会发生缓慢水解 Aprotinins 抑肽酶终浓度2ug/ ml MW:6512 可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽 释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和 Factor Xa。 非常稳定,当pH>12.8时失去活性,可溶于 水(10mg/ml),-20o C下可长期保存 Bestatin终浓度10uM MW:308.4 可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂, 工作液可保存一天,1mM的甲醇贮存液在 -20o C可保存至少一个月 E-64 Protease Inhibitor终浓度10uM MW:357.4 不可逆的半胱氨酸酸蛋白酶抑制剂,抑制半胱氨酸 酸蛋白酶而不会影响其他酶的半胱氨酸残基,与小 分子量的巯基醇如beta-巯基乙醇不会产生反应, 具有高度特异性。工作液在正常pH值下可保持稳定数天,1mM的水溶液在-20o C可保存几个月 EDTA, 4Na终浓度10mM MW:380.2 金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金 属依赖性生物过程。其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5的0.5M 水溶液)在4o C可保存数月 Leupeptin, 半硫酸盐 亮抑酶肽（亮肽素） 终浓度100uM MW:493.6 可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋 白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C内 切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血 酶,Cathepsin B及胰蛋白酶。 工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM 水溶液)在4o C时稳定期为一周,-20o C时 稳定期为一个月 Pepstatin A 终浓度1uM MW:685.9 可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白 酶,Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)及以1mg/ml溶于甲醇,搅拌过夜可以 1mg/ml溶于乙醇,333mg/ml溶于6N的
第六章蛋白质的降解及其生物学意义 ?第一节蛋白质降解的概述 ?第二节参与蛋白质降解的酶类 ?第三节蛋白酶体-泛素系统及其功能 ?第四节蛋白质降解的生物学意义 蛋白质降解是生命的重要过程 ?维持细胞的稳态。 ?清除因突变、热或氧化胁迫造成的错误折叠的蛋白质，防止形成细胞内凝集。 ?及时终止不同生命时期调节蛋白的生物活性。 ?蛋白质的过度降解也是有害的，蛋白质的降解必须受到空间和时间上 蛋白质降解的体系 ?蛋白质消化分解为被机体吸收的营养物质。 ?研究蛋白质结构时，用蛋白酶降解肽链。 ?蛋白质新生肽链生物合成以及新生肽链折叠的过程中，质量的控制都与“次品”的降解有关。 ?蛋白质在行使功能时，很多调节控制都与肽键的断裂有关，如前肽的切除、无活性的前体蛋白质的激活等。 第一节蛋白质降解的概述 蛋白质的寿命 ?细胞内绝大多数蛋白质的降解是服从一级反应动力学。半衰期介于几十秒到百余天，大多数是70～80d。 ?哺乳动物细胞内各种蛋白质的平均周转率为1 ～2d。代谢过程中的关键酶以及处于分支点的酶寿命仅几分钟，有利于体内稳态在情况改变后快速建立。 –大鼠肝脏的鸟氨酸脱羧酶半衰期仅11min，是大鼠肝脏中降解最快的蛋白质。 –肌肉肌动蛋白和肌球蛋白的寿命约l～2w。 –血红蛋白的寿命超过一个月。 ?蛋白质的半衰期并不恒定，与细胞的生理状态密切相关。 蛋白质寿命的N端规则 ?N端规则：细胞质中蛋白质的寿命与肽链的N端氨基酸残基的性质有一定的关系。 ?N端的氨基酸残基为D、R、L、K和F的蛋白质，其半衰期只有2~3min。 ?N端的氨基酸残基为A、G、M和V的蛋白质，它们在原核细胞中的半衰期可超过10h，而在真核细胞中甚至可超过20h。 酿酒酵母蛋白质代谢特点 ?酿酒酵母中不稳定蛋白的N端氨基酸残基有12个：Asn（B）、Asp（D）、Glu（E）、Phe（F）、His（H）、Ile（I）、Leu（L）、Lys（K）、Arg（R）、Trp（W）、Tyr（Y）和Gln（Z）。 ?酵母中存在切除N端甲硫氨酸的氨肽酶，它作用的蛋白质底物的N端第二个氨基酸一定是N端规则中的氨基酸残基。 PEST假设 ?PEST（Pro-Glu-Ser-Thr）假设：认为含有序列为PEST肽段的蛋白质，在细胞质中很快被降解，在这个亲水的区域附近常有碱性残基。 ?PEST肽段的缺失，可以延长此突变蛋白质的寿命。 ?在22个快速降解的蛋白质中有20个是含有PEST序列。 ?在35个慢速降解的蛋白质中有32个不含PEST序列。 分泌到细胞外蛋白质的寿命 ?分泌到细胞外的蛋白质，它们的寿命都比较长，如胶原蛋白、眼睛中的晶体蛋白。
泛素-蛋白酶体通路与癌症关系的研究进展 张海满 （山东农业大学生命科学学院山东泰安201018） 摘要：泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。泛素-蛋白酶体途径（UPP）的异常改变不仅与癌症的病因学有着直接关素，并且与癌症的发展和预后有着密切的关系。本文综述了泛素的构成、泛素链的形成过程、UPP的生理和病理功能及UPP与癌症的关系的研究进展。 关键词：泛素-蛋白酶体通路；UPP；癌症；研究 细胞内蛋白质的产生和降解必须保持着动态平衡，才能维持细胞的稳态和正常功能。泛素-蛋白酶体途径( ubiquitin-pro-teasome pathway, UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。 1.泛素-蛋白酶体途径（UPP）的构成 UPP成分十分复杂，主要包括泛素( ubiquitin, Ub)、泛素活化酶( ubiquitin-activatingenzyme, E1)、泛素连接酶( ubiquitin-conjugatingenzyme, E2)、泛素蛋白连接酶( ubiquitin-protein ligating enzyme, E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶( deubiquitinating enzyme, DUBs)等。UPP存在于所有真核生物的细胞内，是蛋白质选择性降解的主要方式。 1.1泛素( ubiquitin, Ub) 泛素是一种广泛分布在真核细胞中的高度保守的小分子球状蛋白质。1975年由Goldstein首次提出，此后不断出现有关报道[1]。单个泛素分子由76个氨基酸残基组成，相对分子质量约8.5×103，有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止其自身在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的进行。依赖于ATP的酶促反应，E1通过在Ub的羧基末端和E1自身激活位点半胱氨酸之间形成一个硫酯键而激活Ub，激活的Ub被转到E2结合酶上，然后E2在E3作用下共价结合到需要降解的胞质或胞核的蛋白上，使底物蛋白发生泛素化，形成Ub单体，多个Ub单体通过异肽键连接形成多聚Ub链，每个多聚Ub链至少含有4个Ub单体。 1.2泛素活化酶( ubiquitin-activating enzymes, E1) 泛素活化酶是单基因编码的相对分子质量分别为110×103和117×103的2个亚基，存在于细胞核
CAST（钙蛋白酶抑制蛋白酶）功能缺失(LOF)的突变，导致皮肤缺损、白甲病、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关 节垫 一：研究背景 皮肤剥落综合征(PSS)一种皮肤角质层持续的脱落症状，从婴幼儿时发病持续终生，皮肤脱落可伴有红斑、水泡和其它外胚层组织病变，比如脱发、异常指甲。PSS可分为两种临床类型：肢端PSS(APSS)和广泛性PSS(GPSS)。APSS患者发生在手足部位的手掌面、足底、背面，和谷氨酰胺转氨酶-5突变有关。此外，导致常染色隐性遗传病鱼鳞病的半胱氨酸蛋白酶抑制酶-A(CSTA)的基因突变也和APSS有关；GPSS个体和角膜黏连蛋白突变(CDSN)有关；山姆综合征(一种严重皮炎)和桥粒心黏连蛋白-1(GSD1)突变有关;Exampl…….。然而，一些APSS 病人的遗传机制尚不清楚。 CSAT基因突变为常染色隐性遗传，大量APSS患者该突变基因型为纯合子，临床表现白甲、肢体末端点状角质化、口唇炎、指关节垫，疾病缩写“PLACK”。通过显子测序和Sanger测序，证实了在三个互相隔离的家庭成员PLACK患者中，不同的纯合子的CSAT功能缺失。 二：研究目的 验证CSAT在表皮稳态中的作用。
3.1 样本采集：一个28岁的PLACK中国女性患者(individual1)、一个尼泊尔PLACK儿童患者(individual2)、两个欧洲先天性厚甲症患者(individual3、4)的血液和唾液样本； 3.2 Sanger测序：排除其它皮肤炎症遗传病中TGM5, CSTA, CDSN, 和CHST8基因突变； 3.3 individual-1 和individual 2全外显子测序，外显子捕获先通过罗氏NimbleGen SeqCap EZ Library外显子捕获系统富集，然后Illumina HiSeq2000测序； 3.4 individual-1 和individual 2突变通过dbSNP137、1000 G、HapMap和BGI内部数据库过滤； 3.5 RT-PCR对individual 1皮肤中CAST的mRNA表达进行定量，设定阴性对照； 3.6 individual 1胫前皮肤CAST抗体免疫组化染色，individual 2左大腿皮肤
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1
蛋白质降解的泛素—蛋白酶体途径 泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸相连。蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在A TP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段(图8—15A)。此为生物大分子在胞质中降解的泛素—蛋白酶体途径(ubiquitim proteosome pathway)。泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象。例如第一章提到NF-~B激活中抑制成分I-~cB的降解，以及免疫调节一章中将提到细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)对底物的作用，皆涉及这一泛素—蛋白酶体途径。 蛋白质泛素化系统由3个组分构成，一个称为泛素激活酶n，它可利用水解A TP释放的能量以其胱氨酸残基(Cys)的巯基与泛素C端的甘氨酸残基(Gly)形成高能硫酯键。然后连接在殿上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合(图8—15A)。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白赖氨酸残基(Lys)—NH2基团形成异肽键(isopeptidebond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。 内源性抗原在胞内的降解 A．泛素蛋白酶体降解途径；B．泛素化的内源性被28S免疫蛋白酶体降解成肽段。 单个连接的泛素残基尚不足以引起底物降解，活细胞中有一系列的泛素残基可加到前一个泛素赖氨酸残基上，形成泛素聚合链(polyUb)，这一过程受细胞活性的调控。连接到降解蛋白质底物上的多聚泛素链可为蛋白酶体提供识别的信号，也是调控蛋白质降解的环节之一。 内源性抗原肽依据该途径实施降解，具体涉及两个作用环路。其一是泛素与底物结合，然后在分解酶(deconjugatmg enzyme)DUB的作用下重新游离，已如上述；二是结合有调节复合物的28S免疫蛋白酶体，对带有泛素聚合链的内源性抗原肽实施降解，然后再回复到19S 调节复合物及20S蛋白酶体，构成第二个环路。两者共同作用的结果是，泛素化的内源性抗原进入免疫蛋白酶体的孔道后，在蛋白水解酶的作用下降解成为5～15个氨基酸残基的短肽。
蛋白酶催化蛋白质水解 1、酶的重要性 生命的最主要、最基本的特征在于生物体的新陈代谢，具体表现为活体经常由外部摄取所需要的物质，以生物能为动力，经过体内同化、更新、异构化，并排出一些物质，发散热能至外界。机体或单个细胞的所有这些化学反应，基本上是在催化剂作用下完成的。酶是人体内新陈代谢的催化剂，只有酶存在，人体内才能进行各项生化反应。人体内酶越多，越完整，其生命就越健康。当人体内没有了活性酶，生命也就结束。人类的疾病，大多数均与酶缺乏或合成障碍有关。 2、酶的生物学功能 在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能，具体功能如下： （1）信号转导和细胞活动的调控都离不开酶。特别是激酶和磷酸酶的参与。 （2）酶也能产生运动。通过催化肌球蛋白上ATP的水解产生肌肉收缩，并且能够作为细胞骨架的一部分参与运送胞内物质。 （3）参与在动物消化系统的工作。以淀粉酶和蛋白酶为代表的一些酶可以将进入消化道的大分子（淀粉和蛋白质）降解为小分子，以便于肠道吸收。淀粉不能被肠道直接吸收，而酶可以将淀粉水解为麦芽糖或更进一步水解为葡萄糖等肠道可以吸收的小分子。不同的酶分解不同的食物底物。
（4）在代谢途径中，多个酶以特定的顺序发挥功能：前一个酶的产物是后一个酶的底物；每个酶催化反应后，产物被传递到另一个酶。有些情况下，不同的酶可以平行地催化同一个反应，从而允许进行更为复杂的调控：比如一个酶可以以较低的活性持续地催化该反应，而另一个酶在被诱导后可以较高的活性进行催化。酶的存在确定了整个代谢按正确的途径进行；而一旦没有酶的存在，代谢既不能按所需步骤进行，也无法以足够的速度完成合成以满足细胞的需要。实际上如果没有酶，代谢途径，如糖酵解，无法独立进行。例如，葡萄糖可以直接与ATP反应使得其一个或多个碳原子被磷酸化；在没有酶的催化时，这个反应进行得非常缓慢以致可以忽略；而一旦加入己糖激酶，在6位上的碳原子的磷酸化反应获得极大加速，虽然其他碳原子的磷酸化反应也在缓慢进行，但在一段时间后检测可以发现，绝大多数产物为葡萄糖-6-磷酸。于是每个细胞就可以通过这样一套功能性酶来完成代谢途径的整个反应网络。3、酶的分类 酶可分为二类，第一类是所谓的单纯酶，其催化活性仅由酶蛋白提供；第二类称为结合酶，除了蛋白质外，还需含有其他成分才呈现催化活性。这些成分包括无机离子，Fe卄、Zn卄.Mn卄等或有机化合物，如硫胺素焦磷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸等。这些化学组分称为辅助因子，这类化合物称为辅酶。这类酶也称为全酶。 按国际生化会的规定，将现已分离得到的2000多种酶按所催化的反应类型分类，可分为以下六种。
钙蛋白酶系统研究进展 梅承君1,庞辉2,康相涛1*,孙桂荣1(1.河南农业大学,河南郑州450000;2.河南省公安厅,河南郑州450000)摘要阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。 关键词钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;钙蛋白酶激活蛋白;嫩度 中图分类号Q55文献标识码A文章编号0517-6611(2006)22-5774-03 Research Adva nce in C alpain System MEI C heng-jun et al(Hen an Agricul tu ral University,Zhen gzh ou,Henan450000) Abstract This paper revie wed th e classi ficati on and structu re of cal pain sys tem,the general biological function and its affecting factors. Key w ords C alp ain;Cal pas tatin;Calpain activator;Tenderness 钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现,1972年Bush等首先在骨骼肌中确认,1976年Da yton等对其进行纯化。钙蛋白酶被鉴定、纯化后,其名称有钙活化中性蛋白酶(Calcium a ctiva te d ne utra l prote ase,Calcium ac tiva ted ne utral SH prote ase, c alpain)简写为CANP(EC,3,4,22,17)、钙激活酶(Ca2+-a ctiva t-ed enzy me)、钙激活中性蛋白酶(Calcium a ctiv ate d ne utral pro-te ase)等。1983年Go ll等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过程中起关键作用[1]。目前,已证明它广泛地分布于绝大多数动物的细胞中。在一定浓度的钙离子作用下,钙蛋白酶主要作用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶,还参与细胞内的信号传递[2]。 1钙蛋白酶系统 1.1钙蛋白酶的分类Calpain中的Cal代表钙调蛋白(Ca-l moclulin),pain代表木瓜蛋白酶(Pa pain)。Calpain由钙调蛋白和木瓜蛋白酶两者以非共价键结合而成。钙蛋白酶系由多种同工酶构成。根据分布特点可将其分为组织特异性和非组织特异性蛋白酶两大类[3]。目前研究比较深入的是非组织特异性蛋白酶,已知的2种非组织特异性同工酶是Ca-l pain1和Ca lpain2。Ca lpain1可被L mol水平的钙离子激活,又称L-Calpain;Ca lpain2可被mmol水平的钙离子激活,又称m-Calpain。除活化时需要的钙离子浓度不同和结构略有差别以外,这2种同工酶生化和催化的性质几乎完全相同。红细胞内仅含有Calpain1,其余的哺乳动物细胞中均含有2种形式的钙蛋白酶。由于细胞内钙离子的波动在微摩尔(L mol)浓度水平以下,所以Ca lpain1很可能在正常生理条件下发挥功能,而Calpain2则可能在病理情况(细胞内钙超载条件)下才能激活[4]。 1.2钙蛋白酶系统的结构[5] 1.2.1钙蛋白酶的结构。钙蛋白酶系中L-Calpain和m-Ca-l pain由不均一的二聚体蛋白构成,其大、小亚基的分子量分别为80和30kD。Calpain3、8a、9、11、12和13也都分别由大、小2个亚基构成。大亚基具有催化活性,L-Ca lpain和m-Ca-l pain的大亚基分别由CANP1和CAN P2基因编码;小亚基具有调节功能。尽管L-Calpain和m-Calpain大亚基氨基酸 基金项目国家/8630计划资助项目(2002AA242021);河南省重大科技攻关项目(022*******,0322010600);河南省高校杰出科研人才 创新工程项目(2000KY CX005)。 作者简介梅承君(1979-),女,河南焦作人,硕士研究生,研究方向:家禽育种。*通讯作者。 收稿日期2006-08-09序列有明显差异,但是其高级结构基本相同,都由4个结构域组成,从N端起分别命名为?、ò、ó、?结构域。在大亚基中,结构域?由1~80位氨基酸残基组成,约占全部分子的10%,在蛋白酶激活的情况下很容易发生自溶,由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用,L-Calpain和m-Ca lpain仅在结构域?中不同;结构域ò含有81~330位氨基酸残基,约占全部分子的35%,是表现钙蛋白酶水解活性的关键部位,在未被激活的条件下含有2个次级区域[6];结构域ó由331~560位氨基酸残基组成,约占全部分子的35%,其功能为结合钙离子和磷脂,与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白有关;结构域?由561~705位氨基酸残基组成,占全部分子的20%,是结合钙离子的部位,含有4个钙结合蛋白所特有的EF-手型结构(1个EF-手型结构包含2个与钙离子结合环相连的氨基酸螺旋)[7]。L-Ca lpain、m-Calpain、Ca lpain9的小亚基含有2个结构域,这2个结构域由一段富含脯氨酸的序列相连,其中结构域ò与大亚基的结构域?相同,含有4个可以结合钙的EF-手型结构,故也具有结合钙的活性[8]。在其他钙蛋白酶中,如Calpain3、8a、11、12、13,尽管其大亚基也有结构域?,但其大、小亚基之间并没有相互联系。Ca lpain5、6、7、8b、10、15为非典型的钙蛋白酶,其部分结构域缺失或被取代,没有结构域?,因此推测其大、小亚基间也不存在联系。 1.2.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构。钙蛋白酶抑制蛋白(Ca-l pastatin)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。通过抑制钙蛋白酶活性,可抑制肌肉内蛋白质降解,参与肌肉生长过程中蛋白质的更新。在屠宰后的动物体内,它可抑制钙蛋白酶的活性,从而明显影响肉的嫩度。它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化,并与之特异性结合。钙蛋白酶抑制蛋白通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用,且该抑制作用不受pH值的影响。钙蛋白酶抑制蛋白共由5个部分(?、ò、ó、?、?)组成,其中4个是钙蛋白酶抑制蛋白的活性中心。当钙蛋白酶被钙离子激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,则将迅速与之结合而抑制蛋白酶活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。 目前对钙蛋白酶抑制蛋白的生化性质了解的还不十分清楚。根据钙蛋白酶抑制蛋白在SDS电泳中的行为,可将其分为70和110kD两种类型。70kD类型主要存在于红细胞中,110kD类型存在于肝、心脏和其他组织中。虽然这2种钙蛋白酶抑制蛋白分子大小不同,但它们的功能性质相似。 安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2006,34(22):5774-5776责任编辑刘月娟责任校对孙能森
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2． 0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3． 0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4． 2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5． pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 编号012345678 012345678标准酪氨酸溶液 (mL)[100 g/mL] 水 (mL)1098765432 稀释酪氨酸溶液浓度 (g/mL)01020304050607080 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。