目录
第1章SIRT1/2在周期性张应变诱导血管平滑肌细胞表型分化中的作用及其机制....- 1 -
1.1引言................................................................................................................................- 1 -
1.1.1VSMCs表型分化的影响因素及调控机制.....................................................- 2 -
1.1.2SIRT1/2蛋白的生物学功能及研究现状........................................................- 4 -
1.1.3 本研究的主要内容和意义................................................................................- 9 - 1.2实验材料及仪器..........................................................................................................- 10 -
1.2.1实验仪器..........................................................................................................- 10 -
1.2.2试剂..................................................................................................................- 10 -
1.2.3主要溶液成分及配制......................................................................................- 11 - 1.3实验方法......................................................................................................................- 12 -
1.3.1原代VSMCs培养.........................................................................................- 12 -
1.3.2α-actin免疫细胞化学实验............................................................................- 13 -
1.3.3细胞张应变加载系统......................................................................................- 13 -
1.3.4实验分组..........................................................................................................- 15 -
1.3.5蛋白提取..........................................................................................................- 15 -
1.3.6蛋白免疫印迹检测..........................................................................................- 15 -
1.3.7加药处理实验..................................................................................................- 16 -
1.3.8RNA的提取（TRIzol法）.........................................................................- 17 -
1.3.9基因芯片实验..................................................................................................- 17 -
1.3.10统计学方法....................................................................................................- 18 - 1.4实验结果......................................................................................................................- 18 -
1.4.1周期性张应变促进VSMCs表型分化.........................................................- 18 -
1.4.2周期性张应变诱导VSMCs的SIRT1与SIRT2表达.............................- 19 -
1.4.3Salermide抑制张应变诱导的VSMCs表型转化.......................................- 20 -
1.4.4Salermide抑制张应变诱导的VSMCs表型转化机制研究.......................- 22 - 1.5讨论..............................................................................................................................- 24 -
第2章SIRT1/2在转化生长因子-β1调控的血管平滑肌细胞表型分化和细胞外基质表达中的作用及其机制................................................................................................................- 27 -
2.1引言..............................................................................................................................- 27 -
2.1.1TGF-β1调控VSMCs表型转化...................................................................- 28 -
2.1.2TGF-β1调控VSMCs细胞外基质...............................................................- 29 -
2.1.3 本研究的主要内容和意义............................................................................- 31 - 2.2实验材料及仪器..........................................................................................................- 32 -
2.2.1实验仪器..........................................................................................................- 32 -
2.2.2试剂..................................................................................................................- 32 -
2.2.3主要溶液成分及配制......................................................................................- 32 - 2.3实验方法......................................................................................................................- 33 -
2.3.1实验分组..........................................................................................................- 33 -
2.3.2RNA干扰实验...............................................................................................- 33 -
2.3.3加药处理实验..................................................................................................- 34 -
2.3.4蛋白免疫印迹检测..........................................................................................- 34 - 2.4结果..........................................................................................................................- 35 -
2.4.1TGF-β1促进VSMCs的收缩型分化标志表达............................................- 35 -
2.4.2TGF-β1促进VSMCs的SIRT1和SIRT2表达........................................- 36 -
2.4.3Salermide抑制TGF-β1诱导的VSMCs表型转化..................................- 37 -
2.4.4SIRT1和SIRT2 RNA干扰抑制TGF-β1诱导的VSMCs表型转化....- 40 -
2.4.5Salermide调节TGF-β1诱导的VSMCs ECM变化................................- 42 - 2.5讨论..............................................................................................................................- 44 - 全文小结................................................................................................................................- 47 - 参考文献................................................................................................................................- 48 - 致谢....................................................................................................................................- 52 - 攻读硕士学位期间已完成或发表的学术论文.....................................................................- 53 -
图表目录
图1 血管壁细胞的受力模式图
图2 Sirtuins 催化蛋白去乙酰化与ADP-核糖转移反应过程
图3 SIRT1 调节信号蛋白活性或沉默基因表达机制
图4 resveratrol 和 Salermide分子结构
图5 Flexcell细胞张应变加载系统及工作原理图
图6 周期性张应变促进VSMCs 收缩表型标志表达
图7 10%-1.25Hz 的张应变促进 VSMCs SIRT1与SIRT2蛋白表达
图8 Salermide 抑制张应变诱导的VSMCs SIRT1与SIRT2蛋白表达
图9 Salermide 抑制张应变诱导的VSMCs 收缩型分化标志表达
图10 差异表达基因功能分类分析
图11 TGF-β1 时间依赖刺激VSMCs SM22α表达
图12 TGF-β1 时间依赖刺激VSMCs calponin表达
图13 TGF-β1 促进了VSMCs SIRT1 和SIRT2 表达
图14 Salermide 浓度依赖抑制TGF-β1 诱导的VSMCs SM22α和calponin 表达
图15 Salermide 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs SIRT1与SIRT2蛋白表达
图16 Salermide 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs p-smad5 与p-Akt 蛋白表达
图17 SIRT1 和 SIRT2 RNAi 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs SIRT1 和SIRT2 表达图18 SIRT1 和 SIRT2 RNAi 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs calponin 和 SM22α表达图19 Salermide 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs collagen I 和elastin 蛋白表达
图20 Salermide 抑制TGF-β1 诱导的VSMCs p-ERK 蛋白表达
表1 基因芯片检测的差异表达基因（部分结果，n=3）
表2 针对大鼠 SIRT1 和SIRT2 mRNA 序列设计合成的 siRNA 序列
英文缩略语
缩略词 英文全称 中文
SD Sprague-Dawley rat斯普拉格-道利鼠VSMCs Vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞
ECs Endothelial cells内皮细胞
MHC Myosin Heavy Chain肌球蛋白重链
Akt/PKB Protein kinase B蛋白激酶B
Ang II Angiotensin II血管紧张素II
AT1Angiotensin II receptor 1血管紧张素II 受体1 PCR Polymerase chain reaction多聚酶链反应
cDNA Complementary DNA互补DNA
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium杜氏改良Eagle培养基EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸
ECM Extracellular matrix细胞外基质
F-actin Filamentous actin肌动蛋白微丝
eNOS endothelial nitric oxide synthase 一氧化氮合成酶
FAs Focal adhesions粘着斑
BCS Bovine calf serum小牛血清
IGF Insulin-like growth factor胰岛素样生长因子PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
Blotting 蛋白免疫印迹法
WB Western
phosphatase 碱性磷酸酶
AP alkaline