解剖科学进展 Progress of Anatomical Sciences 2010 Mar,16(2):131~134
慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达
*
崔万鹏，刘晓湘，方秀斌（中国医科大学 基础医学院神经生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001）
【摘要】 目的 研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法 构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体，PC12细胞按照不同的转染条件分为 正常组（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率，采用Real-time PCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果 病8毒滴度为1 × 10 TU/ml，MOI为100时，PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高，转染试剂polybrene对转染效率无明显影响，沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论 慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段，可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。
【关键词】 PC12细胞；慢病毒；RNA干扰；髓样分化因子初次应答基因88
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-2947（2010）02-0131-04
Lentivirus mediated RNA interference knockdowns the expression of MyD88 in PC12 cells
【Abstract】 Objective To investigate the transfection efficiency of lentivirus and silencing efficiency of MyD88 by lentivirus mediated RNA interference in PC12 cell line. Methods Recombinant lentivirus vectors with shRNA targeting rat myeloid differentiation primary response gene 88(MyD88) were constructed and transfected into pheochromocytoma cells (PC12) in vitro, the tranfection efficiency was observed under fluorescence microscope and the expression of MyD88 was 8determined by Real-time PCR and Western Blot respectively. Results The viral titer of lentivirus was 1×10 TU/ml and the MOI(multiplicity of infection) was 100, PC12 cells exhibited the highest transfection efficiency in enhanced infection solution(EN.iS), with no remarkable effect on the transfection efficiency in the presence of the transfection reagent polybrene. According to the result of Real-time PCR and Western Blot, the most efficient targeting sequence was 5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'. Conclusion Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silence gene expression in PC12 cells，which can generate stable transfected PC12 cell line with MyD88 expression knocking down.
【Key words 】 Pc12 cell line; lentivirus; RNA interference; myeloid differentiation primary response gene88
*
CUI Wan-peng，LIU Xiao-xiang，FANG Xiu-bin （Department of Neurobiology, China Medical University, Liaoning Shenyang 110001 China）
[1]Lentivirus 是逆转录病毒的一种，可将自身携带作用。近来研究发现，MyD88 基因敲除的小鼠在肾的基因整合如宿主基因组。利用Lentivirus 构建的脏和心肌缺血再灌注中，能够大大减少炎症反应导[1]shRNA表达载体，与化学合成和基于瞬时表达载体致的组织损伤和功能紊乱。我们通过RNA干扰抑制构建的shRNA相比，一方面可以替代瞬时表达载体PC12 细胞中Myd88的表达，建立稳定表达shRNA细使用，另一方面，可用于转染依靠传统转染试剂难胞株，研究氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation）于转染的原代细胞、悬浮细胞等，并且可以整合到导致的TLR4介导的MyD88依赖的信号通路的激活导被感染的细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。致的细胞损伤的体外模型。MyD88作为 Toll-like receptor4（TLR4）的主要胞内接头蛋白，在TLR4激活引起的炎症反应中起到关键
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
DMEM高糖培养基购自GIBCO，胎牛血清和马血
【收稿日期】2009-11-17
【基金项目】辽宁省高等学校科研项目（No.2008813） *通讯作者（To whom correspondence should be addressed）
·132·解剖科学进展2010年第16卷第2期
清购自杭州四季青公司。PC12和293T细胞购自上海CAAGGGTTGGTAT-3'，扩增条件为95℃（30s），中科院细胞所。Real-time PCR试剂盒SYBR Primscrip 40 cycles of 95℃（5s），60℃（34 s）and dissociation TM RT-PCR kit购自Takara公司。兔抗大鼠MyD88多stage 95℃（15s），60℃（1 min），95℃（15s）。克隆抗体购自美国Santa Cruz。Lipofectamine 2000和Western blot 按照《分子克隆指南》相关操作进行，Trizol 购自invitrogen公司。PGL SIL-GFP 重组载体，显色后照相。
pHelper 1.0和 pHelper 2.0 慢病毒包装质粒购自上海
吉凯基因公司。2 结果
1.2 慢病毒载体的构建
2.1 慢病毒滴度和最佳转染条件
设计针对大鼠MyD88cDNA的三个靶点（Table
经扩增和纯化后，检测针对三个靶点的病毒的1），分别为合成含有茎环结构的DNA双链互补序列
滴度分别为1.5E+9 TU/ml，2E+9 TU/ml，2E+9 TU/ml ，19-mer sequence 5'-TTCTCC GAACGTGTCACG-3'作
阴性对照病毒滴度为5E+9 TU/ml。转染96h后检测转为阴性对照，将合成的序列在90℃水浴退火15min。
染效率发现，MOI为100时，在EN.iS组转染12h获得用限制性内切酶Age I和EcoR I 消化PGL SIL-GFP 重
较高的转染效率，超过85%（图1C），因此确定MOI 组载体，将合成的DNA片段用T 4连接酶，连入线性
为100，转染培养液为Enhance infection solution，转染化的载体中。然后将该质粒转入感受态的大肠杆菌
试剂polybrene对转染效率没有影响。
中。将已转化的感受态细胞接种到含Apm抗性的
2.2 Real-time PCR和Western blot 结果
LB琼脂培养基上，培养16h后进行阳性克隆的PCR鉴
Real-time PCR结果显示，转染阴性对照病毒定，挑选阳性克隆送测序。测序通过的质粒与
（NC组）的PC12细胞MyD88表达量与对照组（Con pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0 载体共转染进293T慢
组）相比没有变化，转染携带针对靶点5'-CATAC 病毒包装细胞，培养48h后收集细胞培养上清，用离
GCAACCAGCAGAAA-3'的shRNA的慢病毒（RNAi 心超滤装置收集、浓缩病毒，然后进行滴度测试。
组），mRNA的表达被显著下调（90±3）%（ <0.01）1.3 转染预实验
（图2A），其余两个靶点的沉默效率均不理想，PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组
MyD88的下调效率不到70%。因此选用该靶点进行（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、
Western blot检测MyD88在蛋白水平的表达。Western EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入
blot 结果显示，与阴性对照（NC）和对照组polybrene组，分别在MOI（Multiplicity of Infection）
（Control）相比，RNA干扰MyD88组（RNAi组），10，50 和100的情况下进行转染。最佳转染条件和
MyD88的表达量下调了（80±11）%（ <0.01）（图MOI值由慢病毒的最高转染效率来决定。转染完
2B，C）。整体上通过RNA干扰，MyD88的表达被成12h将转染培养液换成DMEM高糖（含10%胎牛血
功下调。
清。5%的马血清）的完全培养液。96h的时候在荧
光显微镜下观察GFP在细胞中的表达情况，确定转
染效率。
1.4 Real-time PCR 和Western blot
Real-time PCR 按照Takara SYBR PrimscripTM
RT-PCR kit说明书进行，采用双标准曲线的半定量
方法检测MyD88在各组的表达情况。GAPDH作为内
参，引物的序列如下：GAPDH Sense： 5'-GGCACA
GTCAAGGCTGAGAATG-3', Antisense: 5'-ATGGTGG
TGAAGACGCCAGTA-3'; MyD88 Sense：5'-GCGAGC
TCATTGAGAAAAGG-3', Antisense：5'-CTTGGTG
Table 1. pSC target sequence of rat
target pSC-1 pSC-2 pSC-3
gene
Myd88
Myd88
Myd88
TargetSeq (5'-3')
GGACTGCCAGAAATACATA
GGACTTTCCTAGTATCCTA
CATACGCAACCAGCAGAAA
GC%
42.10%
42.10%
47.36%
Fig 2. (A) RNAi knocking down the expression of MyD88 mRNA
in PC12 cells (B) Western blot of MyD88 protein in RNAi,
β-actin was used as internal control. (C) Relative
expression level of MyD88 was shown in histograms. Picture
shown is representative of three experiments with similar
results. Data expressed as mean±SD
P
P
·133·2010年第16卷第2期崔万鹏等慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达
Fig 1. Tranfection efficiency of PC12 cell in different condition determined by fluorescence microscope (A1 and A2), in normal DMEM high glucose medium (supplement with 10% fetal bovine serum and 5% horse serum, B1 and B2), in normal DMEM high glucose medium
supplement with polybrene (C1 and C2) in EN.iS , (D1 and D2) in EN.iS supplement with polybrene. Scale Bar= 50 μm
RNA干扰最近成为一种特异和高效的用于沉默哺乳3 讨论
动物细胞中的基因的表达。
RNA 干扰是进化中保守的一种过程，由ds RNA化学合成的siRNA仅能够进行瞬时的研究某基（double strand RNA）引起的在基因的转录后针对含因的功能，要长时间进行研究就需要构建质粒或者
[3，4]
有特异性序列的mRNA进行沉默。Dicer（一种逆转录病毒载体进行稳定转染。然而质粒介导的表RNas-Ⅲ 型的RNA酶）切割dsRNA成21-23bp的小干达shRNA的载体进行稳定转染时，由于转染效率低
[5]下，需要耗费大量的时间和工作，而且在稳定转染扰RNA（siRNA），针对目的mRNA 进行降解。
·134·解剖科学进展2010年第16卷第2期
细胞之后又存在不稳定性例如：细胞冻存或者复苏体，为缺血再灌注中炎症反应寻找治疗手段提供了后存在质粒的丢失现象。因此慢病毒等逆转录病毒依据。
介导的RNA干扰就成为长时间研究基因的功能的最
佳手段。慢病毒载体来源于假型的HIV病毒，其包膜【参考文献】
蛋白被改造，使用水疱性口炎病毒的包膜（VSV
[6][1] Wu H, Chen G, Wyburn KR, et al. TLR4 activation mediates kidney G），大大提高了对各种细胞株的转染效率。尤其
ischemia/reperfusion injury[J]. J Clin Invest, 2007, 117: 2847-2859.是神经元等不分裂的细胞以及其他悬浮细胞的转染
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MyD88是先天免疫系统中的一个关键接头蛋
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nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian 白介素-1受体和Toll-like reseptors（TLRs）衔接到一cells[J]. Nature, 2001, 411: 494-498.
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块的作用。在脑缺血再灌注损伤中，TLR4介导的
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interfering RNAs[J]. Nat Rev Genet, 2002, 3: 737-747.
[8]
因子的表达等等作用。然而，缺血再灌注损伤中的[6] van den Haute C, Eggermont K, Nuttin Y, et al. Lentiviral vector-炎症反应的机制尚未明确，TLR4介导的信号通路的mediated delivery of short hairpin RNA results in persistent
knockdown of gene expression in mouse brain[J]. Hum Gene Ther, 激活过程和激活的配体尚不清楚。因此阻断PC12细
2003, 14: 1799-1807.
胞中TLR4介导的MyD88信号通路，能够有效的明确
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（上接第130页）
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15(4): 1070-80.
基因自由组合定律的计算及解题方法 一、分枝法在解遗传题中的应用 （该法的原理为乘法原理,故常用于解基因自由组合有关的题目） 1、配子的种类、比例：例：写出基因型为AaBBDd的个体形成几种配子？形成的配子及其比例？ 2、后代的基因型种类、比例： 如:亲本的基因型为YyRr,求它自交后代的基因型： 例：写出基因型为AaBBDd的个体与基因型为AaBbdd的个体相交，后代有几种基因型？后代的基因型及其比例？ 如：求AaBb×AaBb子代基因型为AaBb的比例？ 3、后代的表现型种类、比例： 例：写出基因型为YyRRDd（黄色圆粒高茎豌豆）的个体与基因型为YyRrdd（黄色圆粒矮茎豌豆）的个体相交,后代有几种表现型？后代的表现型及其比例？ 例如：求基因型为YyRr的黄色圆粒豌豆自交后代的性状比。 4、雌雄配子结合方式有几种 例：基因型为AaBBDd的个体与基因型为AaBbDd的个体相交，后代雌雄配子结合方式有几种？几对遗传因子组合时规律 练习1、水稻的有芒（A）对无芒（a）为显性，抗病（B）对感病（b）为显性，这两对基因自由组合。现有纯合有芒感病株与纯合无芒抗病株杂交，得到F1代，再将此F1与无芒的杂合抗病株杂交，子代的四种表现型为有芒抗病，有芒感病，无芒抗病，无芒感病，其比例依次为（） A、9：3：3：1 B、3：1：3：1 C、1：1：1：1 D、1：3：1：3 2、基因型为AaBBCcDd的个体与基因型为AaBbccDd的个体杂交，按自由组合定律遗传，则杂交后代中： (1)有多少种基因型？ (2)若完全显性，后代中表现型有多少种？ (3)后代中纯合体和杂合体所占的比例分别为多少？ (4)后代中基因型为aaBbCcDd个体所占的比例是多少？ (5)后代中表现型不同于两个亲本表现型个体所占的比例是多少？ (6)后代中基因型不同于两个亲本基因型的个体所占的比例是多少？ 二、先分后合法：（分三步） 如：确定具有多对相对性状的亲本的基因型 1、把相对性状一对对地分开，并分别判断性状的显隐性 2、根据后代情况分别确定控制每对性状的基因型 3、根据亲本的性状对应地把基因合起来 例：根据桃树的果皮的两对相对性状的杂交情况回答问题： A、白肉有毛个体与黄肉无毛个体杂交，后代有黄肉有毛12株，白肉有毛10株。 B、黄肉无毛个体与黄肉无毛个体杂交，后代15株全是黄肉无毛。 C、白肉有毛个体与黄肉无毛个体杂交，后代14株全是黄肉有毛。 （1）显性性状分别是 （2）分别写出亲本的基因型 练习1、现有子代基因型及比值如下：1YYRR,1YYrr,1YyRR,1Yyrr,2YYRr, 2YYRr,2YyRr,已知上述结果是按自由组合定律产生的，则双亲的基因型是？ 2、人类中，并指是受显性基因A控制的，患者常为杂合子，显性纯合子全不能成活。先天性聋哑是受隐性基因b控制的，这两对性状独立遗传。现有一对夫妇，男方是并指患者，女方正常，第一胎生了一个聋哑病孩。请回答： （1）这对夫妇的基因型是： （2）第二胎生育一个表现型正常的男孩的可能性占多少？ （3）生育一个只患并指的男孩的可能性是多少？ 3、（1992年高考题）人类多指基因（T）对正常（t）为显性，白化基因(a)对正常(A)为隐性，都在常色体上，且都独立遗传。一个家庭中，父亲多指，母亲正常，他们有1个白化病手指正常的孩子，则下一个孩子只有一种病和有两种病的几率分别是。 4、在完全显性的条件下，AaBbcc与aaBbCc的个体杂交（符合独立分配规律），其中子代表现型不同于双亲的个体占子代多少？ 5、(1997年上海高考题)基因型分别为ddEeFF和DdEeff的2种豌豆杂交，在3对等位基因各自独立遗传的条件下，其个体表现型不同于2个亲本的个体数占全部子代的多少？
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin
细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体
生物信息前沿研究进展讲座结课论文 ——基因表达调控网络研究文献综述 物理学院张玉萍 10304830 摘要 近些年来，基因序列测序的完成、大规模测定基因表达水平的基因芯片（Microarray）技术的出现和高性能计算机的使用使得用模拟计算的方法大规模的研究基因表达调控成为可能，一些研究者已经开始绘制控制整个活细胞基因表达的调控网络。例如λ噬菌体的溶原/裂解活性的调控网络的数学模型已经构建出来。用数学模型的方法预测网络结构是目前研究的热点。本文对表达转录调控网络的研究现状进行综述。 基因表达调控网络 Wyrick(2002)[1] 中给出了一个基因表达调控网络的定义：一组调控因子如何调控一套基因表达的过程称为基因表达调控网络。基因表达调控网络是基因调控网络的一个重要部分。参与基因表达调控网络的元素主要包括cDNA、mRNA、蛋白、小分子等。从元素间相互联系的角度来看，基因表达调控网络是一个由节点（调控元素）、边（调控作用）组成的一个有向图结构。如图1 图1：简单基因网络结构示意图 图中每一个圆圈代表一个节点，也就是调控网络的元素，如基因。有向箭头表示表达增强作用，末端断线表示表达抑制作用。在基因网络中，存在基因对自身表达的自调控的现象。 总的来说表达调控网络有如下特点：
A：网络结构复杂 网络中节点和边的数目庞大。在人体中总共有3万到4万左右的基因，而且真核生物中大多数的基因会同时被两个和两个以上的基因调控，这就使网络形成了一个非常高维的结构。 B：网络结构变化 生物学的实验表明，相同的基因在人和动物的细胞周期中可以参加不同的生理过程，实现不同的生理功能。还有一些基因只在某些时刻和特定的外界条件下是有相互作用的，在其他条件下不会发生作用。简单的说就是两个基因间的那条边是否存在、作用的方向在不同时期是可能不一样的。 C：相互作用类型多变 在生物体中，基因间相互作用可以有很多类型（如图1），包括了很多作用的特征：两个基因间谁影响谁、影响的方式、增强的作用还是抑制的作用、影响产生的条件、影响的强弱量级、被调控基因的表达量和调控基因的表达量直接的关系等。目前的研究表明，基因间的相互作用可能是一种非线形的作用关系。在多因子调控模式中还要考虑不同的调控因子对同一个目标调控基因产生作用时的某种逻辑关系，这种逻辑关系是由调控模式中各调控因子的相互关系决定。 D：节点类型多样 网络节点的元素可以是DNA、mRNA、蛋白、分子、大分子、外界环境等等。 E：节点状态变化 在细胞周期过程中，每一个基因的表达量不是固定的，会随着条件的变化而变化、蛋白质在不断的合成，同时也在不断的被降解。在不同的调控模式下，蛋白合成和降解的比率会发生变化，从而会使蛋白处在不同的水平上。基因的表达量的变化会影响到相互作用的变化，会引起网络结构的变化。 F：有向循环结构 在生物体中各种生理上的周期现象，我们很容易理解生物体中的相互作用存在周期性。至少在网络的局部上是循环的。在已经研究的比较多的低等生物E.coli的表达调控网络[2]中已经发现了循环的结构。 表达转录调控网络的研究现状 目前关于基因调控的绝大部分问题还没有解决。除了生物学家努力通过新的实验技术和生物理论来研究问题外，近几年，利用数学、统计学、神经网络、人工智能等方法在计算机上分析模拟表达调控机理，是计算分子生物学方面一个飞速发展的方向。由于分析模型的不同和采用的数据类型的差异，目前研究主要分为两个方面：基于基因芯片数据的关系推断模型和基于基因序列信息的调控因子结合位点推断模型。 下面分别就这两个方面的一些方法做一个简要介绍。 （一）基于基因芯片数据的关系推断方法 基因芯片的数据形式为：
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2、介导外源基因的转移和表达； 3、对机体不致病。 然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。 基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。 然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型： 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。
一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
三种病毒转染的异同点 一、病毒表达系统简介 病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是目前最常用的基因导入方式之一。通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源目的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。病毒进而侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体表达。 病毒的基因组可分为编码区和非编码区。其中，编码区包含病毒的必需基因和非必需基因，可分别表达产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；非编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作用元件。 由于野生型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使用的病毒恢复成野生型，必须对病毒载体进行一系列的遗传改造。譬如删除病毒基因组的非必需区，将顺式作用元件和反式作用元件分开连接至不同的载体上，或结合利用不同种病毒的必需蛋白等，最大程度地保证实验的安全性。 哺乳动物病毒表达系统常常包含一到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因子的作用下，病毒复制、包装所需的顺式作用元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产生带有外源基因的病毒颗粒。经浓缩和纯化后的病毒液即可用于侵染目标宿主细胞或动物体，实现外源目的基因在宿主体的表达。 二、病毒表达系统的优势 病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。 三、辉骏生物病毒服务简介 辉骏生物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项目包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建立等。 慢病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。 图1 慢病毒感染宿主细胞原理图 ..
慢病毒载体相关知识问答 Q:什么是慢病毒？ A: 慢病毒载体(Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。慢病毒RNA通过逆转录酶转录为DNA。DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体（如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体）不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体（如常规的逆转录病毒）。目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列. Q:慢病毒用于RNAi研究 A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它
实验五质粒的转化及转化子的鉴定（8学时） 实验目的 掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。 实验原理 （1）热激法：大肠杆菌在0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA 等大分子进入。同时DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 试剂与器材 1、试剂质粒，LB液体培养基(Luria-Bertani) ，LB固体培养基，50mg/ml氨苄青霉素(Ampicillin)储存液， 2、器材恒温摇床，台式低温离心机，恒温水浴锅，超净工作台，微量移液枪，eppendorf管。 热激法转化实验步骤 1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA 培养基中加入250μl Amp （100mg/ml ），250μl X-gal (20mg/ml) ，25μl IPTG (200mg/ml) ，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2．取出3 管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3．每100μl 感受态细胞加入约20ng 质粒DNA ，3 管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA （阳性对照）及不加入任何DNA （阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30 分钟； 4．热击：将离心管放置42 ℃水浴，热击90 秒，注意：勿摇动离心管；