第４１卷第３期２００７年９月
华一Ｉ?师范大学学报（自然科学Ｉ：匣）
Ｊ（）ＵＲＮＡＩ。ｏＦＨＵＡＺＨｒ）ＮＧＮ（）ＲＭＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｌ。Ｓ扎）
Ｖ０１．４ｌＮｏ．３
ＳｅＤｔ．２００７
文章编号：１０００１１９０（２００７）０３一０４３卜０６
杜氏盐藻光系统Ⅱ反应巾心蛋白Ｄ２
基因的克隆及序列分析
刘红涛，宋建伟，臧卫东，鲁照明，王鹏举，薛乐勋’
（郑州大学医学实验中心，郑州４５００５２）
摘要：根捌策茵衣藻（血如ｍ州咖口触ｓ撑ｉｎ＾ｎ耐ｍ）、０ｒｙｚ口ｍｔｉ御、吼，ＤｒＥｚ缸删咖ｒ妇以及Ｍｅ５０盯擅＂ｍ０ｉｒｉ出等真核生物的加＾Ｄ基因的氨基酸高度保守序列．设计一对简并引物，利用ＴＲＩｚ０Ｉ试剂提取杜氏盐藻（Ｄ删ｆｉｒｆ缸船￡ｚ胍）细胞的总ＲＮＡ，通过ＲｌＰＣＲ，得到杜氏盐藻ｃＤＮＡ片段的长度大约为１０００ｂｐ．该序列的ＰＣＲ产物经Ｔ—Ａ克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列，Ｂｌａｓｔ同源性分析表明所克隆的基因为杜氏盐藻声５６Ｄ幕因，编码杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心Ｄ２蛋白．该序列已递交ＧｃｚｌＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为：【）Ｑ０７４４５０）．编码的彝基酸序列，同源性依次为：（Ｍｋ聊ｖｄｐｍ唧ｊ陀ｉⅡ＾ｎ耐Ｉ＂９ｚ％，ＮＰ肿ｍｓＰ，Ⅲ括ｏｆｉ嘲ｃ∞８８“，Ｐ＂Ⅲｓｍ“”如懈￡ｌ８８％，Ａ卅一６０删如ｆｎ抽ｏｐａｄｎ８８％，（麓ｚｄ剜缸硎ｆ弘Ｈｓ８８％．通过密码子偏爱性分析表明．声５６Ｄ基因存在明显的密码子偏爱性，其（Ａ＋Ｔ）含量明显高于（Ｇ＋ｃ）舍最．
关键词：杜氏盐藻；１）２蛋白；芦５６Ｄ；简并引物；密码于偏爱性
中国分类号：Ｑ７８５文献标识码：Ａ
高等植物，绿藻和蓝藻通过两个光系统反应中心，光系统Ｉ（Ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｌ，ＰｓＩ）和光系统Ⅱ（ＰｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡ，ＰｓⅡ），执行产氧光合作用．ＰｓⅡ由叶绿素Ｐ６８０以及与异二聚体Ｄ１和Ｄ２相关的许多电子受体组成，Ｄ１和Ｄ２分别由ｐｓＭ和口ｓ６Ｄ基因编码…．
ＰＳⅡ的组成极其复杂，捕光色素蛋白可能以１２聚体形式围绕在ＰｓⅡ光化学反应中心周围，它们吸收光能，并以极高的效率传给光化学反应中心．反应中心色素Ｐ６８０被激发，并发生电荷分离，激发的电子通过电子传递链最后传到黄素蛋白，使ＮＡＤＰ＋还原形成高能化合物“．ＰｓⅡ反应中心蛋白不仅提供电荷分离反应的场所，而且会直接影响电子的传递效率，其反应中心蛋白Ｄ１和Ｄ２蛋白组成异二聚体再与ＰｓⅡ反应中心色素一叶绿素Ｐ６８０分子结合，共同构成光系统Ⅱ的光化学反应中心．因此Ｄ１蛋白和Ｄ２蛋自在光合作用中起着十分重要的作用．
由于Ｄ１蛋白还是除草剂的结合位点，所以在它被确认为反应中心蛋白以前，对编码它的ｐｓ硝
收稿日期：２００７—０ｌ一２２．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０６００００６）
＊通讯联系人．Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｅｌｘ＠３７１．ｎｅｔ．基因已有很多研究．相比之下，对声ｓ６Ｄ基因的研究和报道则很少．最近，ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ等人发现在豌豆ｐｓ６Ｄ基因的５’上游距转录起始位点ｌｌＯｏｂｐ区域存在一个类似真核基因增强子的序列，此序列与该基因表达的光调控性质有关。］．所以不论对光合作用机理研究还是叶绿体基因表达调控的研究，声ｓ６Ｄ基目的克隆和体外表达研究都有重要价值．杜氏盐藻（Ｄ“ｎｄｆｉｆｚ缸ｍｚｉＨｎ）是一种光合自氧的无细胞擘的单细胞绿藻，是一种抗逆性很强的单细胞真核绿藻，能在Ｏ．０５～５ｍｏｌ的盐水中生长．繁殖“］．杜氏盐藻的突出优点在于培养条件简单，光合自养，抗逆性极佳．这些特性为利用其进行实验提供了便利．本研究通过比较现有已知物种的户ｓ６Ｄ基因的核酸和氨基酸序列设计一对简并引物，采用ＲＴ－ＰｃＲ的方法从杜氏盐藻中克隆了ｐｓ一＾Ｄ基因的ｃＤＮＡ片段，本实验为研究杜氏盐藻ＰｓⅡ的Ｄ２蛋白基因上游启动子序列提供的必要的信息．为下一步研究该基因的表达调控打下基础，而且还有利于阐明杜氏盐藻生长过程中叶绿体转录调控及其光合作用的机理．
华中师范大学学报（自然科学版）第４ｌ卷
ｌ材料与方法
１．１藻株和菌株
杜氏盐藻（Ｄ“ｍｎｆｉＦｆ缸ｓｄ“ｎ４．Ｕ丁ＥＸ１６４４＿『跚０）购自美国德州大学（ＴｈｅｕｎｉｖｅｆｓｌｔｙｏｆＴｅｘ－ａｓ，ｕｓＡ）．大肠杆菌ＪＭｌ０９为本实验室保存．
１．２主要试剂
ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＡＭｖＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓＫｊｔ购白上海生物工程公司；限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶和ｐＭＤ】８一Ｔ载体均购自宝生物工程（大连）有限公司（ＴａＫａＲａ）；凝胶回收试剂盒和质粒ＤＮＡ提取试剂盒购自杭州维特洁公司．１．３杜氏盐藻细胞的培养
按照５×１０５细胞／ｍＬ的接种量接种于ＰＫｓ液体培养摹ｏ］，于２７℃光照条件下培养，光照强度为４５００Ｉ，ｘ，明暗周期为１２ｈ；１２ｈ．
１．４简并引物的设计
从ＧｅｎＢａｎｋ上搜索莱茵衣藻（（Ｍｚｎｍｙ矗。一卅ｏｎｄｓ坩抽＾Ｈ州嘶）、ｏｒｙｚⅡ５ｎｆｉ抛、Ｃ＾ｆｏ糟Ｚｋ讹Ｚ一耳ｎｒ如以及Ｍ邸ｏｓｆ噜ｍｎ“ｒｆｄ８等真核生物的ｐｈｏｔ—ｏｓｙｓｌｅｍⅡｐｒｏｔｅｉｎＤ２（声５６Ｄ）基因的氨基酸序列＋通过氨基酸序列比对，找出ｐｓ６Ｄ保守序列分别为ＭＴＩＡＩＧ和ＦＶＦＶＧｗ．然后按照对应的密码子翻译成核苷酸序列，设计两对简并引物（涉及密码子简并性的分别用Ｎ、Ｒ、Ｙ及Ｘ代替）如下：
ＰｓｂＤＰｌ５一ＡＴＧＡＣＮＡＴＸ（；ＣＮＡＴＸＧＧ３
Ｐｓｈｒ）Ｐ２５一ＹＴＧＮＧＣＮＧｅｅＡｌ‘ＣＣＡＮＧＣ３
其中：Ｙ＝ＣｙＴ，Ｒ—Ｇ／Ａ，Ｘ一１、／Ｃ／Ａ，Ｎ—Ａ／Ｔ／ｃ／Ｇ．上述引物由大连宝生物工程有限公司合成．１．５杜氏盐藻总ＲＮＡ的提取
取接种４ｄ左右的盐藻细胞。记数，调整至大约１×１０６细胞／ｍＬ，取１ｍＬ，用ＴＲＩｚｏｌ试剂提取杜氏盐藻细胞的总ＲＮＡ，判断提取的总ＲＮＡ的质量．具体见文献［６］．
１．６ＲＴ－ＰｃＲ扩增杜氏盐藻耶扫Ｄ基因的ｃＤＮ＾片段以提取的杜氏盐藻总ＲＮＡ为模板，根据ＡＭＶＦｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ的说明，用ＡＭＶ反转录酶合成ｃ【）ＮＡ第一链，以此为模板．用合成的简并引物，进行Ｒ个ＰｃＲ扩增ｐ如Ｄ基因ｃＤＮＡ片段．反应体系如下：１０×ＰｃＲＢｕｆｆｅｒ５ｐＬ、引物各１ｐＩ。（５０ｐｍ。ｌ／ｐＬ）、ｎｑ酶０．５弘Ｌ（５Ｕ／ｐＩ。）、ｄＮ７ｒＰ４肛Ｌ（１０ｍｏｌ／卢Ｉ＾模板ｃｃｌＮＡｌ“Ｌ、Ｈ２０３７．５弘Ｌ，总反应体积５０“Ｌ反应程序为９５℃预变性１ｍｉｎ，然后按下列循环参数进行扩增反应：９４℃３０ｓ，５０．ｃ３０ｓ，７２℃９０ｓ，经３０个循环后，７２℃１０ｍｉｎ，以确保新生链延伸完全．反应结束后，经１％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物．
１．７杜氏盐藻ｐｓ如ｌ基因ｃＤＮＡ片段的酶切鉴定，测序分析及序列比对
ＲＴＰｃＲ产物利用Ｔ—Ａ克隆方法亚克隆到ｐＭＤｌ８一Ｔ载体（全长２．６９ｋｂ）上，转化感受态大肠杆菌ＪＭｌ０９，用含Ａｍｐ、ｘｇａｌ和ＩＰＴＧ的Ｉ。Ｂ平板进行筛选，挑取阳性菌落提取质粒ＤＮＡ，用ｐＭＤｌ８一Ｔ载体上的多克隆位点两侧的ｘ６ａＩ和＆ｚＩ进行双酶切鉴定．感受态细菌的制备、连接、质粒ＤＮＡ的提取、ＤＮＡ的酶切鉴定等，参见分子克隆实验技术”ｏ．含有目的插入片段的阳性菌落交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序．测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ上其他物种的ｐ一６Ｄ基因进行序列比对，在ｈｔ‘ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／网站上通过ｂｌａ蚶工具进行同源性分析．
２结果与讨论
２．１杜氏盐藻ＲＮＡ纯度及质量鉴定
由图１可以看出，Ｔｒｉｚｏｌ试剂提出的杜氏盐藻总ＲＮＡ。在电泳条件下未发现有基因组ＤＮＡ和蛋白质的污染，２８ｓ核糖体ＲＮＡ与１８ｓ核糖体ＲＮＡ的带型比较清晰，无拖尾现象，两条带的亮度比基本上呈２：ｌ的关系．由此说明提出的ＲＮＡ完整性比较好．为了进一步确定此ＲＮＡ的质量，还对其进行了２２０ｎｍ～３００ｎｍ波长的紫外光扫描＜表１），其（）Ｄ值为２６０／２３０＞２．ＯＯ，２６０／２８０在１．９０～２．ＯＯ之间，表明ＲＮＡ的纯度很高，不存在蛋白质、多糖和酚类的污染，适台下面的ＲＴ—ＰＣＲ．
表ｌ总ＲＮＡ紫外分析结果
Ｔａｂ．１Ｒｅ３ｕＩｔｓｏｆｕｎｒａｖｉｏｌｅｔａｂⅫｂｅｎｃｙｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ０６０】】２８７Ｏ６５７２】４１１９５９
图ｌ总ＲＮＡ电泳
Ｆｉｇ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｔｏｔａｌ
ＲＮＡ
第３期刘红涛等：杜氏盐藻光系统口反应中心蛋白Ｄ２基因的克隆及序列分析４３３
２．２ＲＴ－ＰｃＲ扩增杜氏盐藻光系统ⅡＤ２蛋白ｃＤ—
ＮＡ片段及酶切鉴定
杜氏盐藻总ＲＮＡ经变性凝胶电泳和测２６０
ｎｍ的（）Ｄ值检验，总ＲＮＡ的提取质量较好，经
ＲＴ—ＰＣＲ扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测在约１．Ｏ
ｋｂ处有一明显亮带，与预期目的片段大小一致（图
２）．另外将ＰｃＲ产物经Ｔ－Ａ克隆所得后，经过转
化筛选，小量提取质量进行双酶切鉴定，可以清晰
地看到两个条带（图３），说明所克隆的目的片段结
果正确．
图３台有声ｓ６Ｄ序列的重组质粒鉴定结果
Ｆｉｇ．３Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍ｜ｄ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅ声ｓ６Ｄｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｍ分子量标记；１，２．Ｘ６ａＩ和ＳｎⅡ双酶切鉴定
确插入片段（约１０００ｂｐ）的质粒进行测序分
析．经ＢＬＡｓＴ后与数据库中其他物种的ｐ如Ｄ
（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡｐｒｏｔｅｉｎＤ２）氨基酸序列有很高
的同源性．该ｃＤＮＡ片段核苷酸序列长度大约
为１０００个碱基（图３，４），由其推导的氨基酸序
列包含３３０个氨基酸左右的残基，所得片段长图２ＲＴ—ＰＣＲ扩增杜氏盐藻户ｓ６ＤｃＤＮＡ序列的电泳结果度与理论值相符．杜氏盐藻声曲Ｄ基因的氨基酸
Ｆｉｇ?２Ａｇａｒｏｓｅｅｌｅｃｔｍｐｈｏｒｅｓｉｓ“ＲＴＰｃＲｐｒ。ｄｕｃｔｏ‘序列比对分析表明，其与下列物种的同源性依Ｄｓａｌｉｎａ卢小ＤｃＤＮＡ次为Ｃ＾缸ｍｖｄｏ优。枷５Ｍｉ”＾“ｒ出“９２％，ＮＰ声＾ｒｏ—
Ｍ?分子量标记５１＇２ｐ拍ＤＲＴ—ＰｃＲ扩增的。ＤＮＡ片段
５９Ｚ研如ｏＺｉｔ砬ｆ∞８８％，Ｐｉｎ“ｓ抽“”６Ｆｒｇｚｚ８８％，２．３杜氏盐藻光系统ⅡＤ２蛋白基因推导的氯基Ａｍ６０心ｚ缸ｆｒｉｆ＾ｏ由ｏｄｎ８８％，ｃ＾ｚＤｒＰｚ陆酸序列的同源性分析口“ｚ“，打８８％．
随机挑取数个阳性克隆进行酶切鉴定，含有正
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４３４华中师范大学学报（自然科学敝１第４１卷
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图４ｐ曲Ｄ基因推导氨基酸序列同源性比较
Ｆｉｇ．４ＡｌｉｇｍｎｅｎｔｏｆｔｈｃｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｒｐｓｈＤ
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２．４杜氏盐藻Ｐｓ６Ｄ基因密码子偏爱性分析杜氏盐藻ｐｓ６Ｄ基因存在明显的密码子偏爱性（表２），其Ａ＋Ｔ含量明显高于Ｇ＋ｃ含量。分别为：５８．０３％和４１．９７％．密码子第三位使用Ａ和Ｔ的次数也明显高于Ｇ和ｃ，依次为：３２．２３％，３６．１４％，２２．８９％和８．７３％．其Ｌｙｓ残基数量为３．
３讨论
杜氏盐藻是一种极其耐盐的特殊逆境生物，但目前对它的遗传背景知之甚少，而且没有基因文库用来筛选功能基因．简并引物是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间有一个或数个核苷酸的差异．通过简并引物进行ＰｃＲ，可以相对简便的检测一个已知基因家族的新成员，或用来检测物种间的同源基因Ｄ】．通过比较物种间氨基酸保守序列设计简并引物，用ＰｃＲ的方法筛选同类基因，不失为一种简单可靠的方法Ｍ］．
作者根据ＧｅｎＢａｎｋ上登录的莱茵衣藻（（１＾ＺⅡｍｙ矗ｏｍｏｎｄｊｒ“ｎ＾口，ｏｆｉｉ）、ｏｒｖｚｄｓｄｆｉ抛、ｃ＇，ｌｚｏｒＰｚ缸ｕ“ｚｇⅡｒ曲阻及ＭＰｓｏ“ｊｇ巩ｎ口ｉｒｉ也等真核生物的ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍⅡｐｒｏｔｅｉｎＤ２（声如Ｄ）基因
的氨基酸序列，比较筛选出其高度保守、桉苷酸简并程度较低的区域：ＭＴＩＡＩＧ和ＦＶＦＶＧｗ，设计简并引物，进行ＲＴ—ＰｃＲ，以获得杜氏盐藻的ｐｒ６Ｄ基凶信息．根据ＢＬＡｓＴ分析结果，本实验所得的核苷酸序列转化成氨基酸序列后，杜氏盐藻ｐｓ一６Ｄ基因与下列物种的同源性依次为：ｃ＾ｚｎｍｙｄｏ一仇口Ｈｎ５ｒＦｉ”妇耐￡打９２％，ＮＰ却加ｓＦｚ研如“ｉ眦ｃｅⅡ８８％，ＰｉｎＨ５曲“ｎ６Ｐｒｇｉｉ８８％，Ａｍ加ｒＰｚ肠￡一ｆ＾ｏ声ｏｄｄ８８％，（麓如Ⅳｚ如口“ｆｇⅡｒ如８８％，据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻声如ＤｃＤＮＡ序列，本实验为研究杜氏盐藻ＰＳⅡ的Ｄ２蛋白基因上游启动子序列提供的必要的信息，为下一步研究该基因的表达调控打下基础，而且还有利于阐明杜氏盐藻生长过程中叶绿体转录调控及其光合作用的机理．
我们研究室申报了转基因盐藻生物反应器的中国和美国专利，利用杜氏盐藻构建生物反应器在我国具有自主知识产权，该反应器具有如下优点：①盐藻为真核生物。其表达产物可白行完成翻译后加工，保证产品的生物活性和质量；②盐藻本身无毒，富含多种天然维生素、蛋白质、氨基酸和多不饱和脂肪酸，食用价值高．因此盐藻是表达外源基因
第３期刘红涛等：杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心蛋白Ｄ２基因的克隆及序列分析４３５表中所不挫氏盐漂户ｓ６Ｄ基因每个氢基酸密码子使用的次数．
的良好宿主，转基因盐藻生物反应器有可能成为新一代廉价、高效、安全的生产体系．但是目前在杜氏盐藻生物反应器的构建过程中有如下问题急待解决：①高效启动子的分离；②高效表达载体的构建；
③提高盐藻自身的生长速率．该实验克隆的ｐ站Ｄ序列有望在研究杜氏盐藻光系统ＩＩ的光合作用机理及其光表达调控提供理论依据．另外有研究报道声５６Ｄ基因的５’上游距转录起始位点１ｌｏｏｂｐ区域存在一个类似真核基因增强子的序列，此序列与该基因表达的光调控性质有关“３．所以不论对光合作用机理研究还是叶绿体基因表达调控的研究，ｐｒ６Ｄ基因的克隆和体外表达研究都有重要价值．作者所克隆的户妇Ｄ的序列是从起始密码子开始，通过所克隆的序列信息，可以通过５，一ＲＡｃＥ以及基因组步行文库（ＧｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇＬｉｂｒａｒｙ，ＧｗＩ，）来进一步克隆得到声如Ｄ的全基因序列及其上游调控序列，为研究叶绿体基凶表达调控及杜氏盐藻光合作用的机理与其生长习性之间的关系提供一定的理论依据．
Ｍｏｒｔｏｎ在研究了地钱、水稻和烟草叶绿体基因组中密码子使用情况后发现，叶绿体基因组对密码子的使用具有偏爱性，表现为对ＮＮＡ、ＮＮＴ的选择使用优于同义密码子ＮＮＣ、ＮＮＧ的选择。因而整个基因组表现出高（Ａ＋Ｔ）含量”］，作者克隆的ｐｊ６Ｄ的部分序列的（Ａ＋Ｔ）含量也明显高于（Ｇ＋Ｃ）含量，其（Ａ＋Ｔ）和（Ｇ＋Ｃ）含量分别为５８，０３％和４１．９７％，但ｐ５６Ｄ全基因序列的密码子的使用情况如何，还有待进一步探讨，这些实验结果根据Ｇｍｎｔｈａｍ等””的基因组假说推断，其原因可
能是叶绿体基因中各成员普遍遵循的密码子使用策略之一．另外从第三位密码子的偏爱性分析，杜氏盐藻ｐｓ６Ｄ的显著偏爱Ａ和Ｔ，其含量分别为：３２．２３％，３６．１４％，而Ｇ和Ｃ的含量较低分别为：２２．８９％和８．７３％．
Ｉ。ｙｓ残基的数量是纯化蛋白的一个有用的衡量标准，另外有文献报道了户ｓｈＡ基因Ｌｙｓ残基数量的统计情况”“，大麦和欧龙牙草各有１个编码Ｌｙｓ残基的密码子外，其余陆生植物的ｐｓ６Ａ都无此密码子．莱苗衣藻中也无此密码子＋但纤维裸藻中有５个，蓝细菌ＡＭ６ⅡⅫｎ７１２０的ｐｓ６Ａ有２个．这一特性在纯化Ｄ１蛋白时可能成为一个有用的衡量标准．实验结果表明，所克隆的ｐｓ６Ｄ序列编码Ｌｙｓ残基的数量为３个，这一特性也为我们分离纯化杜氏盐藻光系统ⅡＤ２蛋白提供了理论基础，为更进一步研究杜氏盐藻光系统ⅡＤ２蛋白的特性提供实验依据．
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