实验一尿蛋白的测定（双缩脲法）
尿蛋白是指尿中蛋白质而言，尿蛋白的主要成分是白蛋白。正常人尿内含有微量蛋白质，成年人每天约排出50-100mg，偶尔达150mg。在体育运动或训练后，尿中蛋白质的排出量可能达到250mg以上，白天任意尿所含蛋白质可少于10mg/100ml，夜间混合尿可达20mg/100ml。
由于运动而出现尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿。研究证明，运动后尿蛋白数量的多少与运动量尤其运动强度有关；与运动员身体机能状态有关；与运动员的情绪有关；与不同体育项目有关……。因此，测定运动员运动后尿中蛋白质的含量，可作为一个简易的生化指标来评定运动员的身体机能状态、运动强度和运动量等。
一、实验目的
1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。
2、初步掌握分光光度计的使用，了解比色法的基本原理。
二、实验原理
蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合物生成紫色络合物。经光电比色可求出尿中蛋白质的含量。反应如下：
三、实验试剂及仪器
1、实验试剂
1）、0.15N硫酸
2）、0.15%钨酸钠溶液
3）、双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO
4?5H
2
O,A?R或CP)1.5克、酒石酸钾钠
或（NaKC
4H
2
O,4H
2
O
6
A?R或CP）6克，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移
入1升容量瓶中，混合。再加入10%氢氧化钠溶液约300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释至1升。保存于塑料试剂瓶中或内壁涂有一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。如无红色或和黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。
4）、0.9%生理盐水
5）、标准蛋白溶液（500mg/100ml）
2、实验仪器
分光光度计、离心机、移液管、离心管、洗耳球
四、实验操作步骤
测定管（离心管）
5ml尿液 b1
0.15N硫酸2.5ml b2
1.5%钨酸钠
2.5ml b3
混匀后离心5分钟(3000转/分)
倾去上清液,加生理盐水1ml,搅拌 b4
加双缩脲试剂4ml b5
混合后放置20-30分钟
540nm比色,空白调零读取测定管光密度值(OD
测
)五、计算尿蛋白含量
计算公式：尿蛋白（mg%）=（ OD
测/OD
标
）χ50
其中测得OD
标
为0.131
六、注意事项
1、如果尿液比较混浊，可能是尿液中的无机盐含量过高造成，会影响测定结果，可通过加热消除。
2、在用玻棒搅拌助溶时，注意不或垂直用力，否则容易造成离心管底破裂而终止实验。
尿蛋白定性检查 一、磺基水杨酸法 【目的】掌握尿蛋白（PRO）定性磺基水杨酸法（SSA）。 【原理】生物碱试剂磺基水杨酸，在酸性的条件下，其磺酸根阴离子与蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐沉淀。 【器材】 1. 小试管、试管架。 2.滴管、胶洗头。 3. 2ml刻度吸管、吸耳球。 4. pH广泛试纸。 5. 黑色衬纸。 【试剂】 200g/L磺基水杨酸溶液：20g磺基水杨酸溶于100ml蒸馏水中。 【标本】新鲜尿液或模拟蛋白尿标本。 【操作】 1、调pH 用pH广泛试纸测试尿液酸碱度，如pH不在5—6范围，可加酸或碱予以调节。 2、加尿液取小试管2支，分别加入清晰尿液1ml。 3、加试剂于第1支试管内滴加磺基水杨酸溶液2滴，轻轻混匀；另1支试管不加试剂作为空白对照。 4、判断结果 1min内观察结果，按照书中表格判断阳性程度及大致蛋白质含量。
【参考区间】阴性 【注意事项】 1、标本①如果尿液呈现明显的浑浊，应先离心或过滤。②当知患者应用大剂量青霉素、庆大霉素、磺胺、含碘造影剂时，应告知结果可能产生假阳性。③指导患者正确采集中段尿，避免混有生殖系统分泌物。 2、调pH 本法在尿液偏碱或偏酸时（pH＞9或pH＜3)可呈假阴性，因此检测前可先测试尿pH，必要时用稀NaOH或5%醋酸进行调节。 3、结果判断 （1）掌握好结果判断时间。操作时严格按照操作方法进行，判断时间严格掌握在1min，极轻度的混浊并无明显临床意义。当尿液中含高浓度尿酸或尿酸盐时，在加入试剂1—2min后可能出现白色点状物，逐渐呈蛛丝状浑浊，缓慢扩散，覆盖于尿液表面，遇此干扰可离心后的尿液上清进行检测。 （2）如果通过镜检发现大量细胞，分析其阳性可能是由于混有生殖系统分泌物造成的假阳性，则可用离心后的上清液重新测定，进行验证。 （3）对于微弱阳性的判断，可选用黑色衬纸作背景，以提高分辨力。 4、灵敏度本法灵敏度高，为0.05—0.10g/L。 尿葡萄糖班氏法定性试验 【目的】掌握葡萄糖（Glu）班氏定性的方法 【原理】葡萄糖含有醛基，在高热、碱性溶液中，能将试剂中的蓝
尿蛋白的五项检查 尿蛋白与尿酶:早期肾损伤标志 1.微量白蛋白尿(MAU): 作为全身血管内皮损伤标志,MAU是预测和早期诊断肾病、糖尿病、高血压及心血管疾病血管损伤的敏感指标,而且对疾病进展、预测及治疗效果评价等也具有重要参考价值 2: 尿低分子蛋白检测 低分子量蛋白尿也称肾小管性蛋白尿,多用于早期小管损伤标志。 ⑴β2微球蛋白(β2-MG) ⑵视黄醇结合蛋白(RBP) ⑶α1微球蛋白(α1-MG) ⑷尿蛋白-1 ⑸半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C) Cystatin C体内生成量恒定,不受性别、肌肉容积等因素影响,血浓度检测已成为评估肾小球滤过率的敏感指标。 沈阳国济检查报告： 尿蛋白五项： 1：尿转铁蛋白：肾小球滤过膜早期损伤的标志之一。 2：尿α1微球蛋白：肾小球滤过膜和肾小管重吸收损伤。 3：尿免疫球蛋白G：与疾病严重程度有关，越严重，值也高。 4：尿微量白蛋白：固有细胞损伤，是糖尿病肾病和高血压肾病的早期指标。 5：尿β2微球蛋白：早期肾小管损伤的指标。 案例分析：尿蛋白3+ 其含义是：正常尿液里不含或只含微量蛋白质，检查结果呈阴性（－），当尿液里的蛋白质含量上升到一定量是检查结果就呈阳性（+）。尿蛋白3+（+++、三个加号）是做24小时尿蛋白定量检测的结果。同时还可以表述为尿蛋白三个加号、尿蛋白+3，几种表述都是一个意思。尿蛋白三个加号的意思是1L尿液里含有蛋白质2.0—4.0g，即2.0—4.0g/L。
如果出现了上述的症状，我们的检查就要按照上文中的项目进行，不然造成的后果是很严重的：危害一、引起的小管细胞生物学波动：出现尿蛋白的许多肾脏病都存在着细胞过度增生，代表着一种非适应性反应，导致肾衰。蛋白质可直接调节小管细胞功能，改变其生长特性及其细胞因子和基质蛋白表型表达，可导致小管基底侧释放PDGF、FN和MCP-1，诱导纤维化过程。 二、引起小管间质缺氧加重：尿蛋白重吸收各消化多量蛋白质需额外能量，可造成小管细胞缺氧，以致引起小管细胞损伤。 三、系膜毒性：在肾衰模型中，可以观察到血清蛋白在肾小球系膜中的蓄积，那些大分子物质在系膜区的聚集可引起系膜细胞损伤、增生各系膜基质合成增多，从而产生肾小球硬化。尿蛋白肾病模型中，肾小球中有低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)的载脂蛋白B以及载脂蛋白A沉积那些聚集最终也可导致肾小球硬化。 四、尿蛋白3+的原因主要是肾小球滤过膜受损伤导致通透性增加造成的，肾小球的滤过膜通透性增强意味着启动了肾脏的纤维化，如果不及时的治疗，病情的进一步蔓延，肾脏固有细胞表型会发生转化，生成不易被降解的胶原纤维蛋白，沉积在肾脏，逐渐取代健康的肾单位，最终会发展成终末期肾衰竭--尿毒症。
尿蛋白3+什么意思 尿蛋白1+2+3+是怎么回事：尿蛋白是尿常规检查的项目之一，是判断患者肾脏是否正常的标准之一。当尿蛋白出现加号也就是出现阳性反应的时候，很大程度上意味着患者的肾脏受损，出现了蛋白尿，需及时进行治疗，防止病情继续恶化。那么尿蛋白1+，2+，3+是怎么回事呢? 首先，我们来了解一下蛋白尿1+是怎么回事?权威专家指出，正常尿液里不含或只含微量蛋白质，检查结果呈阴性(-)，当尿液里的蛋白质含量上升到一定量是检查结果就呈阳性(+)。尿蛋白1+(一个加号)是做24小时尿蛋白定量检测的结果。同时还可以表述为尿蛋白一个加号、尿蛋白+1，几种表述都是一个意思。尿蛋白一个加号的意思是1L尿液里含有蛋白质0.2—1.0g，即0.2—1.0g/L。 其次，我们再来了解尿蛋白2+是怎么回事?很多尿蛋白患者在做调查时显示尿蛋白为2+，那么这意味着什么呢?长沙普济肾病医院的权威专家介绍说，尿蛋白是尿液通过酸化加热后混浊而检出的蛋白质，尿蛋白2+(++、两个加号)是做24小时尿蛋白定量检测的结果。同时还可以表述为尿蛋白两个加号、尿蛋白+2，几种表述都是一个意思。尿蛋白两个加号的意思是1L尿液里含有蛋白质1.0～2.0g，即1.0～2.0g/L。 显而易见，尿蛋白3+要比尿蛋白1+，2+更为严重，这也意味着肾脏的受损程度更大了。长沙普济肾病医院的权威专家指出，在一般情况下，检查单上蛋白尿的+越少越好，越少代表损伤肾脏的程度越小，+越多表明肾脏损伤程度越大。蛋白尿3+是中度肾病尿蛋白。但是也有特殊情况如肾脏病变到了晚期，由于大量肾单位都已受到平生损伤，肾功能基本丧失，对蛋白几乎失去了过滤的能力，所以此时患者的尿蛋白也会减少，但是这并不意味着肾脏病变减轻，恰恰是肾脏受损十分严重的表现。
24小时尿蛋白定量 什么是24小时尿蛋白定量？ (1) 尿蛋白化验值过高对肾脏的危害 (3) 尿常规尿蛋白化验与24小时尿蛋白化验的区别 (4) 24小时尿蛋白正常值是多少 (5) 24小时尿蛋白定量增高引起的疾病 (6) 什么是24小时尿蛋白定量？ 青岛静康中医肾病医院最近接到了很多的患者及家属的咨询，有部分患者对24小时尿蛋白定量这个问题不是很明白，针对这个问题，青岛静康中医肾病医院肾病专家给大家详细的介绍一下！ 24小时尿蛋白定量中的“24小时的尿量”，就是把早上的第一次的小便排干净后，从第二次的小便开始留。看一下这时是
几点，记一下时间，直至第二天的这个时间，为24个小时。把这24个小时内的，每一次的所有的小便，都放到一个容器里，混合均匀，然后从中间取取100～200毫升，拿到医院去化验。 青岛静康中医肾病医院肾病专家指出在正常情况下，肾小球滤过膜只能通过分子量较小的物质。正常人每天尿中蛋白质一般为40-80毫克，这一含量用蛋白质定性试验的方法一般不能检出。患某些疾病时，蛋白质漏出增加，就可被检出尿蛋白阳性。所以尿蛋白定性报告的结果是粗略的，如要精确地测出小便中排出的蛋白量，便需采用24小时尿蛋白定量检验。偶然一次发生24小时尿蛋白定量超标，不能确诊为肾病。正常情况下，尿常规检测24小时尿蛋白定量范围小于150mg/24小时.如果受检人的24小时尿蛋白定量指标高出了此正常值参考范围，则可认为其存在肾功能损伤情况，说明患者已经发生了肾病。 青岛静康中医肾病医院肾病专家指出尽管24小时尿蛋白定量是判定肾病是否发生的可靠指标，但是，单凭一次的24小时尿蛋白定量检查结果异常就判定受检者发生了肾病，这是不准确的。在临床对肾病的发生做出确诊时，通常情况下，需要重复做尿常规检查。通过做定期检查，患者的尿常规检查结果显示，存在三次及以上的24小时尿蛋白定量指标均高于正常参考范围，基本才可以判定患者确实发生了肾脏病变。 24小时尿蛋白定量，用通俗的话来解释就是，收集24小
尿蛋白+-是什么意思呢？很多人到医院检查身体，一看到报告单里有尿蛋白+-的字样，就不是很理解，其实，大家在平时多了解一些这些常规的知识是很有必要的。今天，我们请到了京东誉美肾病医院的专家来给大家做出讲解，希望对大家能有所借鉴。 正常尿液里不含或只含微量蛋白质，检查结果呈阴性（－），当尿液里的蛋白质含量上升到一定量时检查结果就呈阳性（+）。尿蛋白1+（一个加号）是做24小时尿蛋白定量检测的结果。同时还可以表述为尿蛋白一个加号、尿蛋白+1，几种表述都是一个意思。尿蛋白一个加号的意思是1L尿液里含有蛋白质0.2—1.0g，即0.2—1.0g/L。 尿蛋白更多加号表述 尿蛋白2+和3+的意思分别又是尿蛋白为1.0～2.0g/L：++、尿蛋白为2.0—4.0g/L：+++。尿蛋白四个加号：尿蛋白>4．0g/L：++++；阴性或中性的情况：尿蛋白<0．1g/L：－；尿蛋白为0．1—0．2g/L：±。 尿蛋白+-是什么意思？通过上述专家的讲解，大家对于尿蛋白应该有了很好的了解了吧 蛋白尿阳性怎么办？蛋白尿患者可能都不太了解自己的病情，由于身体的不适，出现了好多的病变，那么，如果您的身体正是蛋白尿阳性，您了解吗？好多的蛋白尿患者对这比较关注，面对大家的困惑，我们的肾病专家给大家做出详细的阐述。
誉美肾病专家指出，蛋白尿阳性是能够反应出肾脏功能有无损伤。尿蛋白持续阳性往往代表肾脏出现了病变。蛋白尿阳性的多少反映了肾脏的病变程度，临床可据蛋白尿阳性作为肾病治疗效果的观察指标。 然而，需要特别指出的是，肾病患者当其肾脏病变到了晚期，由于大量肾单位废损，使蛋白滤出减少，尿蛋白检查反而减少或消失，但这并不代表肾脏病变程度有所减轻。另外，健康人在有些情况下，尿常规检查也可以检测出蛋白尿阳性现象。这种蛋白尿阳性称为暂时性蛋白尿，或是生理性蛋白尿，常见于食高蛋白饮食后、精神激动、剧烈运动、妊娠、长时间处于高温或严寒环境中以及服用氨基水杨酸、阿司匹林、巴比妥盐、碘剂、青霉素之类药物。因此，对于出现蛋白尿阳性情况的人群，一定要及时就医，找到发生蛋白尿阳性的真正原因所在。对于确诊为肾病者，更应该及早采取有效治疗措施，防止肾病向肾功能不全、尿毒症的方向恶化进展。 蛋白尿阳性检查结果是通过尿蛋白定性试验检查得出的。各种类型的肾病都有发生蛋白尿阳性的可能。当肾小球、肾小管发生病变时，如各期肾炎、肾病以及高血压发生肾动脉硬化时，均可出现蛋白尿阳性；各种细菌性感染，如肾盂肾炎、肾结核、败血症等亦可出现蛋白尿阳性；非感染性疾病，如肾结石、多囊肾、肾淀粉样变性以及休克、严
24小时尿蛋白定量 24小时尿蛋白定量-24小时尿蛋白定量的定义和意义 24小时尿蛋白定量中的“24小时的尿量”，就是把早上的第一次的小便排干净后，从第 二次的小便开始留。看一下这时是几点，记一下时间，直至第二天的这个时间，为24个小时。把这24个小时内的，每一次的所有的小便，都放到一个容器里，混合均匀，然后从中间抽取100?200毫升，拿到医院去化验。 在正常情况下，肾小球滤过膜只能通过分子量较小的物质。正常人每天尿中蛋白质一般 为40-80毫克，这一含量用蛋白质定性试验的方法一般不能检出。患某些疾病时，蛋白质漏出增加，就可被检出尿蛋白阳性。所以尿蛋白定性报告的结果是粗略的，24小时尿蛋白 定量检验可以精确地测出小便中排出的蛋白量。 24小时尿蛋白定量是判定肾病有无的可靠指标： 临床上，判定肾病发生与否，多通过尿常规检查中的尿蛋白定性和定量两个指标进行综合判定。尿蛋白定性指标就是常说的尿蛋白是阴性还是阳性。如果尿蛋白检查结果为阳性，反应肾病的病情程度看其带有几个+。而尿蛋白定量判定则更能准确的反应受检者的肾脏功 能，常用的诊断指标即是24小时尿蛋白定量。 偶然一次发生24小时尿蛋白定量超标，不能确诊为肾病： 正常人，尿常规检测24小时尿蛋白定量范围小于150mg/24小时.如果受检人的24小时尿蛋白定量指标高出了此正常值参考范围，则可认为其存在肾功能损伤情况。 尽管24小时尿蛋白定量是判定肾病是否发生的可靠指标，但是，单凭一次的24小时尿蛋白定量检查结果异常就判定受检者发生了肾病，这是不准确的。在临床对肾病的发生做 出确诊时，通常情况下，需要重复做尿常规检查。通过做定期检查，患者的尿常规检查结果 显示，存在三次及以上的24小时尿蛋白定量指标均高于正常参考范围，才可以判定患者确实发生了肾脏病变。 定期检查，早发现早治疗，防止病情恶化： 肾病早期发病隐匿，患者多无明显症状表现，很容易被忽视。许多人就医时，肾病已经
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
尿蛋白SDS-PAGE分析 一、实验目的与要求 1.掌握SDS-PAGE分析蛋白质组分的原理与实验操作技术 2.熟悉肾病患者尿蛋白组分的特征 3.了解实验设计对照组和空白组的意义 4.了解临床实验样品的获取应符合医学伦理学规范 二、实验原理 1.SDS-PAGE 原理 *十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE- 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程是以过硫酸铵（APS）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂的氧化还原作用 *丙烯酰胺 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关 中等毒性，操作注意安全（口罩手套通风等） *甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺聚合成带有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个长链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶 *过硫酸铵APS 强氧化剂，单体聚合引发剂 提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合所需的自由基 新鲜配制 *TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合 加入TEMED聚合立刻开始，迅速混合凝胶液并灌胶 易燃有腐蚀性，注意操作安全 SDS-PAGE常用于蛋白质分子量测定、蛋白质纯度分析、蛋白质浓度检测、western blot的第一步、蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白鉴定ect 。 本次实验利用垂直板SDS-PAGE分析肾病患者的尿蛋白样品。 2. 尿液蛋白与肾脏疾病 尿液蛋白检测为肾病临床诊断重要指标 正常尿液蛋白质<150mg 血浆蛋白质60%尿蛋白非血浆蛋白质40% 尿液蛋白形成主要通过肾小球滤过、肾小管重吸收及肾小管、尿道排泄三大机制完成 包含血浆蛋白质、肾组织蛋白质、尿路蛋白质 血浆蛋白质主要经肾小球滤过及近曲小管重吸收后逸出产生 肾组织蛋白质主要为肾小管细胞分泌或小管细胞破坏后释放漏入尿液所致 尿路蛋白质主要为膀胱、尿道、副腺等分泌或漏至尿液所致 分为选择性和非选择性 选择性蛋白尿指肾小球仍保留一定的分子筛选功能，尿中主要为一些中小分子蛋白如白蛋白、转铁蛋白，没有或极少大分子蛋白
蛋白尿检测方法有什么 文章导读 蛋白尿其实是肾病的主要症状，肾病给人体带来的伤害是很大的，患者在进行常规治疗的同时，最好还要在饮食上多加注意，这样才可以让疾病更快的恢复，对于一些病情比较严重的患者，最好是吃一些高质量的低蛋白食物，这样就可以有效的缓解症状，从而还会让患者的机体抵抗力得到提高，那么蛋白尿检测方法有什么呢? 第一，蛋白尿检测方法有什么?临床上常用的方法有以下3种：尿蛋白定性试验：通常采用蛋白试纸法、磺基柳酸法、加热醋酸法3种方法。正常情况下，尿蛋白定性试验呈阴性。但此种检查方法易受一些因素的影响，可致假性结果，如尿酸盐含量高时，尿呈酸性反应，蛋白试纸法结果较实际情况低，磺基柳酸法易呈假阳性;大量使用青霉素时，磺基柳酸法易呈假阳性反应;使用磺造影剂时，磺基柳酸法、加热醋酸法均可出现假阳性反应;当尿呈强碱性时，假性结果更多，或出现蛋白试纸法假阴性反应，或出现磺基柳酸法和加热醋酸法的假阴性反应。当尿蛋白仅为一些特殊蛋白质时，蛋白试纸法和磺基柳酸法均不敏感。因此，在进行尿蛋白定性时，应综合各种因素，具体情况具体分析，选择适宜的方法。尽管定性试验比较方便，但有时难以反应蛋白尿的实际情况，有条件时，最好进行定量检查。 第二，尿蛋白定量测定：一般进行ECTkey=24小时尿蛋白定量 target=_blank>24小时尿蛋白定量检测。使用的方法比较多，有些方法虽然比较精确，如凯氏定氮法、双缩脲法等，但操作很复杂。目前临床多采用简易的半定量法，如艾司巴赫氏定量法、磺基柳酸比浊定量法。24小时尿蛋白定量在0.15～0.5克之间为微量蛋白尿，在0.5～1克之间为轻度蛋白尿，在1～4克之间为中度蛋白尿，大于4克(有学者定为3.5克)为重度蛋白尿。 蛋白尿检测方法有什么?尿蛋白电泳分析：常用的方法有醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿蛋白免疫电泳等方法。该方法主要从确定尿中蛋白质的种类出发，通过区分不同尿蛋白的种类，对某些疑难病症如多发性骨髓瘤、重链病等有诊断和鉴别诊断的意义。同时可以区别尿蛋白的分子量大小，这对区别蛋白尿的来源，以及检查尿中是否有特殊蛋白质具有重要的意义。
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
微量尿蛋白的实验室检测 什么是微量尿蛋白？ 肾脏具备强大的代偿功能，肾功能早期损伤往往没有症状和体征，患者就诊时已经到达肾功能不全，失去了最佳的治疗机会。 在早期损伤时尿蛋白已有微量的增加，但还不能用常规方法检测出，此时称为微量尿蛋白，是肾病早期损伤的最敏感变化。 目前用于实验室检测的微量尿蛋白有哪些？ 理论上讲，血浆蛋白均可在病理条件下出现于尿液中，但与肾脏结构和功能受损较为密切的微量尿蛋白系列约有20多种。由于肾单位受损部位不同，临床最常用的，最具标志性的尿微量蛋白系列有以下四种 中文名称英文名称缩写应用意义 1.尿微量白蛋白Mircroalbumin MA 肾小球滤过膜电荷屏障受损的传统标志蛋白 2.尿转铁蛋白Urine Transferrin TRU 肾小球滤过膜电荷屏障受损的敏感标志蛋白 3.尿免疫球蛋白Urine Immunoglobulin G IGU 肾小球滤过膜分子筛屏障受损的标志蛋白 4.尿α1-微球蛋白α1-Microglobulin A1M 肾小管量吸收功能受损的标志蛋白 MA TRU IGU A1M 病理变化有关提示 —/↑↑——肾小球滤过电荷屏障受 损如如糖尿病肾病，急慢性肾小球肾炎，炎症，代谢异常，免疫损伤等所引起的滤过膜上负电荷减少，静电排斥力下降，蛋白滤出增多 —/↑—/↑↑—肾小球滤过筛网屏障轻 度受损1.如高血压肾病是肾血流量增多与压力升高使肾小球内滤过压超过滤过膜阻力，蛋白滤除增多 2.如急性肾小球肾炎，微小病变肾病，狼疮肾，系膜病肾炎和小球节性硬化等引起的滤过膜通透性增高，蛋白滤出增多 ↑↑↑↑↑↑—肾小球滤过筛网屏障严 重受损如感染，肾中毒，血管病变和免疫损伤均可导致滤过膜孔径增到活闭锁，基膜断裂，蛋白滤出增多 ———↑↑肾小管重吸收功能受损如肾缺血，肾间质肾炎，重金属中毒和药物损 伤引起的肾小管上皮细胞损伤，蛋白重吸收减 少，蛋白增多 ↑↑↑↑↑↑↑↑复合损伤如多种原因引起的肾小球和肾小管同时受损除了这四项，尚有以下一些项目作为补充：(β2-mG,CysC,RBP,FDP) 另外，ACR（urine Albumin Creatinine Ratio 尿白蛋白肌酐比值）被K／DOQI指南推荐
24小时尿蛋白定量测定 24小时尿蛋白定量；是指收集24小时内排出的所有尿液来做定性试验的一种尿液检测方法。 24小时尿蛋白定量中的“24小时的尿量”，就是把早上的第一次的小便排干净后，从第二次的小便开始留。看一下这时是几点，记一下时间，直至第二天的这个时间，为24个小时。把这24个小时内的，每一次的所有的小便，都放到一个容器里，混合均匀，然后从中间取取100～200毫升，拿去化验。在正常情况下，肾小球滤过膜只能通过分子量较小的物质。正常人每天尿中蛋白质一般为40-80毫克，这一含量用蛋白质定性试验的方法一般不能检出。患某些疾病时，蛋白质漏出增加，就可被检出尿蛋白阳性。所以尿蛋白定性报告的结果是粗略的，如要精确地测出小便中排出的蛋白量，便需采用24小时尿蛋白定量检验。24小时尿蛋白定量是判定肾病有无的可靠指标:临床上，判定肾病发生与否，多通过尿常规检查中的尿蛋白定性和定量两个指标进行综合判定。尿蛋白定性指标就是常说的尿蛋白是阴性还是阳性。如果尿蛋白检查结果为阳性，反应肾病的病情程度看其带有几个+。而尿蛋白定量判定则更能准确的反应受检者的肾脏功能，常用的诊断指标即是24小时尿蛋白定量。偶然一次发生24小时尿蛋白定量超标，不能确诊为肾病: 正常人，尿常规检测24小时尿蛋白定量范围小于150mg/24小时.如果受检人的24小时尿蛋白定量指标高出了此正常值参考范围，则可认为其存在肾功能损伤情况，说明患者已经发生了肾病。尽管24小时尿蛋白定量是判定肾病是否发生的可靠指标，但是，单凭一次的24小时尿蛋白定量检查结果异常就判定受检者发生了肾病，这是不准确的。在临床对肾病的发生做出确诊时，通常情况下，需要重复做尿常规检查。通过做定期检查，患者的尿常规检查结果显示，存在三次及以上的24小时尿蛋白定量指标均高于正常参考范围，基本才可以判定患者确实发生了肾脏病变。定期检查，早发现早治疗，防止病情恶化: 偶然一次检查出24小时尿蛋白定量超标，不能说明其一定并发了肾病。所以，需要注意的是，养成良好的定期检查身体的习惯。进行定期检查，可以随时关注自身的身体情况，查看有无并发肾病。肾病早期发病隐匿，患者多无明显症状表现，很容易被忽视。许多人就医时，肾病已经发展到了中、晚期阶段，为后期肾病治疗带来很大的难度。如果您的24小时尿蛋白定量检查超过正常值，您可以将您的基本病情提交给肾病专家，让专家为您分析诊断并制定出适合您的治疗方案，防止肾病病情继续恶化进展、增加不必要的负担。编辑本段如何收集送检尿标本 一些肾病往往要求做“24小时尿蛋白定量”检查，那么如何收集送检尿标本呢？[1]为准确测得24小时尿蛋白定量，早上8时准应把膀胱内的尿量排清并弃去，开始计时，把24小时所排出的尿全部贮存在一容器内(包括第二天早上8时准解出的尿)，全部送检查。如果在这24小时之内解大便，亦强调先解小便收集，然后大解。小量尿液亦不要遗漏。尿量收集不齐全，尿蛋白量的计算就不准确。检测前要先用量杯量总尿量，然后搅匀，取出一小杯测定每100毫升的蛋白量，再根据实际尿量进行计算，可计出24小时的蛋白量。总之，要准确测得24小时尿蛋白量，必须准确收集整日尿量，检测部分是总尿量的混合液，才有代表性。因为本试验是计算尿蛋白的绝对值，与饮水量关系不大，所以，测定当天不必限制水分和进食量，如常进食便可以了。
目的 掌握尿蛋白定性试验的方法。 方法一磺基水杨酸法 原理 在酸性条件下，磺基水杨酸的磺酸根阴离子与蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐沉淀。 器材 小试管或凹玻片。 试剂 200g／L磺基水杨酸溶液：磺基水杨酸200g溶于1000ml蒸馏水中。 标本来源 病人不同程度的蛋白尿标本。 尿蛋白定性结果判断 反应外观结果报告相当蛋白质含量（g/L） 仍清澈透明（－）<0.05 微混浊（±）0.05~0.1 明显白色混浊，但无颗粒（+）0.1~0.5 明显白色混浊且出现颗粒（++）0.5~2.0 明显白色混浊且有絮状沉淀（+++） 2.0~5.0 严重混浊且有大凝块沉淀（++++）>5.0 操作步骤 以试管法为例： 1、加尿液在2支试管中各加清晰尿液1ml(如为混浊尿标本，应离心后取上清液；碱性尿应加冰乙酸数滴，为5左右再试验)。 2、加试剂在1支试管中加磺基水杨酸2滴并混匀，1min时与另1支试管中空白尿液比较，判断结果。
3、判断结果见表。 报告方式 尿蛋白定性：阴性或阳性(磺基水杨酸法) 本法结果阳性，即可报告阳性。必要时可用加热乙酸法证实，并以加热乙酸法为准报告结果。 方法二加热乙酸法 原理 加热煮沸使蛋白质变性凝固，加乙酸使尿pH接近蛋白质等电点(pH5左右)而加速蛋白质沉淀。 器材 中试管、木夹、酒精灯。 试剂 5％(V／V)冰乙酸溶液。 标本来源 病人不同程度的蛋白尿标本。 操作步骤 1、加尿液在试管中加清晰尿液至管高2／3处，混浊尿标本应离心后取上清液再试验。 2、煮沸尿液用木夹夹持(或手持)试管下1／3处，加热煮沸试管上1／3处内的尿液(注意：应不断转动试管防止尿液沸溅)。 3、观察结果将试管上部加热处尿液与试管下部未加热尿液比较；观察有无混浊变化。 4、加试剂在试管中加入5％(v／v)冰乙酸2滴。 5、再煮沸尿液、立即观察结果，方法同步骤3。 6、结果判断和报告见表。 报告方式 尿蛋白定性：阴性或阳性(加热乙酸法) 方法三干化学试带法
双缩脲法测定蛋白质浓度 ――生物化学实验 一、目的 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。 二、原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应(蛋白质分子中有-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜色反应)，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色配合物，在540m处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。 双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但Cu2＋离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。 三、实验仪器 1．容量瓶10ml(×6)。 2．试管1.5cm×15cm(×8)。 3．吸管5.0ml(×3)、2.0ml(×1)。 4．722型(或7220型)分光光度计。 四、实验试剂 1、双缩脲试剂：将0.175g CuSO4·5H20溶于约15ml蒸馏水，置于l00ml 容量瓶中，加入30ml浓氨水30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 2、卵清蛋白液：约lg卵清蛋白溶于l00ml 0.9％NaCl溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9％NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg/ml的牛血清白蛋白溶液。 3、未知液：可用酪蛋白配制。 五、操作 1、标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。
取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管吸光度(须在显色后30min内比色，30min后可能有雾状沉淀产生；各管由显色到比色的时间尽可能一致)。绘制浓度一吸光度曲线。 2、样液测定： 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml(样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml范围内)置试管内，加入双缩脲试剂2．0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。 六、思考题 1、写出双缩脲反应的方程式。 2、简述用分光光度法测定蛋白质浓度的原理。 3、总结本实验应该注意的主要问题。
如何正确认识蛋白尿 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
对尿蛋白的认识 尿蛋白是尿液中的正常成分，正常人每天尿中排出的蛋白质一般为40-80毫克/天，上限为150毫克/天，在常规检测中显示的是阴性，在正常含量范围内的尿中的蛋白质即为尿蛋白。当尿中蛋白增加，尿常规检查可以测出即为蛋白尿。蛋白尿是肾脏病的常见表现，全身性疾病亦可出现蛋白尿。 病因 可以导致蛋白尿的原因很多，它们包括：功能性蛋白尿、体位性蛋白尿或病理性蛋白尿。常见有：剧烈运动后，发热的极期，进食高蛋白饮食；胡桃夹现象；各种肾脏病和肾血管病等。 临床表现 不同病因引起的腰疼临床表现也不相同，例如： 1.功能性蛋白尿 功能性蛋白尿是一种轻度（24小时尿蛋白定量一般不超过～1克）、暂时性蛋白尿，原因去除后蛋白尿迅速消失。常发生于青壮年，可见于精神紧张、严重受寒或受热、长途行军、强体力劳动、充血性心衰、进食高蛋白饮食后。 2.体位性蛋白尿 清晨尿液无尿蛋白，起床活动后逐渐出现蛋白尿，长时间站立、行走或加强脊柱前凸姿势时，尿蛋白含量增多，平卧休息1小时后尿蛋白含量减少或消失，多发生于瘦长体型的青年或成人。反复体位性蛋白尿，需注意除外肾病，如胡桃夹现象（又叫左肾静脉压迫综合征，是因主动脉和肠系膜上动脉挤压左肾静脉所致）。 3.病理性蛋白尿 蛋白尿持续存在，尿中蛋白含量较多，尿常规检查常合并有血尿、白细胞尿和管型尿。并可伴有其他肾脏病表现，如高血压、水肿等。病理性蛋白尿主要见于各种肾小球、肾小管间质疾病、遗传性肾病、肾血管疾病和其他肾脏病。常见的如： （1）原发性肾小球疾病①肾炎可为隐匿性、急性、急进性或慢性。常合并血尿、高血压和水肿等。②肾病综合征24小时尿蛋白定量大于或等于克，同时伴有血白蛋白减少，水肿、高血脂。③肾功能不全分为急性和慢性肾功能不全。蛋白尿为肾脏损害的表现。 （2）继发性肾小球疾病①狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮累及肾脏的表现。育龄期女性多见。依据肾脏受累严重程度的不同，尿蛋白量可以表现为少量至大量。②紫癜性肾炎是过敏性紫癜肾脏受累的表现。主要表现为血尿、蛋白尿，儿童多见，成年人亦可发生。蛋白尿多数发生在紫癜出现后2～4周。③糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症，早期肾脏受累，但是尿常规检查尿蛋白可为阴性，后逐渐出现微量白蛋白尿，再发展至大量蛋白尿，乃至终末期肾病，即肾功能衰竭需要透析等治疗。④痛风性肾病尿检异常出现较晚且轻微，仅见轻度蛋白尿及少量红细胞。晚期可进展至慢性肾衰竭。⑤高血压肾病原发性高血压病发生5～10年后常出现肾脏等损害。良性高血压导致的蛋白尿一般为轻至中度的尿蛋白（24小时尿蛋白定量一般不超过～2克），很少出现大量蛋白尿。有些合并镜下血尿，常有高血压左心室肥厚、脑动脉和视网膜动脉硬化等表现。另外一种恶性高血压导致的蛋白尿常为突发性，24小时尿蛋白定量可由少至大量，多数伴有血尿和白细胞尿，肾功能多急剧恶化。 （3）肾小管间质疾病如肾盂肾炎、间质性肾炎等，尿蛋白多为+至++，24小时尿蛋白定量多＜2克。 （4）遗传性肾病如Alport综合征、Fabry病、薄基膜肾病、先天性肾病综合征等，由于基因异常，导致肾脏结构缺陷，导致不同程度的蛋白尿。
尿液蛋白质定量测定方法及临床意义 【摘要】正常人尿液中含有微量的蛋白质,每天排出量在150mg 以下,其中以白蛋白占多数,随不同病种有一定量的球蛋白和其它蛋白。随着肾病科研工作的开展,以观察患者每天排出蛋白质的量以示病情的变化,因此尿液蛋白质定量在临床上有实际应用价值,已成为医院化验室常规的检验项目。 【关键词】尿液蛋白质检测 1丽春红-S法 尿液标本中的蛋白质与丽春红-S染料混匀后一起被三氯醋酸沉淀，将沉淀物溶解于碱性溶液中，此时溶液呈紫色，显色深度与蛋白质浓度成正比。 1.1试剂 三氯乙酸-丽春红-S试剂原液：称取丽春红-S1.0g，加入到1000ml300g／L三氯乙酸中溶解。 三氯乙酸-丽春红-S试剂应用液：将原液用蒸馏水按1：10稀释，放置室温稳定数月。 蛋白定性试剂。0.2mol／L氢氧化钠溶液。 蛋白标准曲线：把定值蛋白稀释成不同的浓度，按操作测定其吸光度，以吸光度为横坐标，以稀释后的蛋白浓度为纵坐标绘制标准曲线。 1.2操作先做尿蛋白定性试验，以适当稀释标本。在试管中加入100μl标本，再加入1ml三氯乙酸一丽春红-S应用液，混匀后以3000r
／min离心15分钟，吸去上清液，倒置于洁净滤纸上。在沉淀中加入0．2mol／L氢氧化钠溶液lml，用560nm波长测定其吸光度，查标准曲线的蛋白含量。 1.3参考值46.5±18．1mg／L 1.4注意事项：尿液如被稀释应乘以稀释倍数。尿中血红蛋白含量>5mg／L时影响结果。离心后上清必须全部弃去，若沉淀中夹带有丽春红-S影响比色结果。 2双缩脲比色法 以磷钨酸乙醇溶液沉淀尿中的蛋白质，在碱性介质中蛋白质与铜离子形成紫红色络合物，与标准液比色即可得出尿中蛋白质的含量。 2.1试剂 蛋白沉淀液：称取磷钨酸7.5g，加入30ml蒸馏水、95％乙醇385ml、浓盐酸25ml。 双缩脲液：(1)称取枸橼酸钠34．6g，无水碳酸钠20g，加入120ml 蒸馏水使其溶解；(2)称取硫酸铜3．46g，加入20ml蒸馏水使其溶解。将(1)、(2)混合，加入蒸馏水至200ml，备用。0．75mol／L氢氧化钠溶液。蛋白标准液(1．5g／L)：称取150mg结晶型冻干人血清白蛋白，加入100ml的3g／L苯甲酸溶液溶解。 2.2操作取5ml24小时混合尿液，2500～3000r／min离心5分钟，取上清备检。混匀放入56℃水浴15分钟，取出后离心，倾上清留沉淀。0．75mol／1 NaOH1．51．51．5
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]
实验一尿蛋白的测定（双缩脲法） 尿蛋白是指尿中蛋白质而言，尿蛋白的主要成分是白蛋白。正常人尿内含有微量蛋白质，成年人每天约排出50-100mg，偶尔达150mg。在体育运动或训练后，尿中蛋白质的排出量可能达到250mg以上，白天任意尿所含蛋白质可少于10mg/100ml，夜间混合尿可达20mg/100ml。 由于运动而出现尿中蛋白质增加的现象称为运动性蛋白尿。研究证明，运动后尿蛋白数量的多少与运动量尤其运动强度有关；与运动员身体机能状态有关；与运动员的情绪有关；与不同体育项目有关……。因此，测定运动员运动后尿中蛋白质的含量，可作为一个简易的生化指标来评定运动员的身体机能状态、运动强度和运动量等。 一、实验目的 1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。 2、初步掌握分光光度计的使用，了解比色法的基本原理。 二、实验原理 蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合物生成紫色络合物。经光电比色可求出尿中蛋白质的含量。反应如下： 三、实验试剂及仪器 1、实验试剂 1）、0.15N硫酸 2）、0.15%钨酸钠溶液 3）、双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO 4?5H 2 O,A?R或CP)1.5克、酒石酸钾钠 或（NaKC 4H 2 O,4H 2 O 6 A?R或CP）6克，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移 入1升容量瓶中，混合。再加入10%氢氧化钠溶液约300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释至1升。保存于塑料试剂瓶中或内壁涂有一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。如无红色或和黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。