酶切、片段回收与连接
黄华如
（生命科学学院，生技091，29号）
摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。
关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收
基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。
基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。
1 材料与设备
1.1 试供材料
大肠杆菌、质粒DNA
1.2 试剂准备
质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等
1.3 实验设备及用具
高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。
2 实验步骤
2.1 提取质粒DNA
这个步骤由老师完成
2.2 酶切
表一：质粒（bt2）双酶切体系表二：质粒（pet）双酶切体系
试剂用量试剂用量
Buffer 2ul Buffer 2ul
质粒（bt2）4ul 质粒（pet）4ul
Bam1HI 1ul Bam1HI 1ul
HindIII 1ul HindIII 1ul
Water 12ul Water 12ul
总体系20ul 总体系20ul
酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。
2.3 片段回收
1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注
意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。
5)向凝胶中加入胶块融化液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
凝胶浓度Buffer GM使用量
1.0% 3个凝胶体积量
1.0%-1.5% 4个凝胶体积量
1.5%-
2.0% 5个凝胶体积量
6)均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。
7)当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上
述胶块融化液中加入10ul 3 M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9)将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
10)将700ul 的Buffer WB 加入Spin Column中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11)重复操作步骤10。
12)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000rpm离心1分钟。
13)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30ul的
灭菌蒸馏水或Elintion Buffer，室温静置1分钟。
14)室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.4 T4连接酶连接
表三：T4连接酶连接体系
试剂用量
回收pet质粒4ul
回收bt2质粒4ul
T4 连接酶1ul
T4 Buffer 1ul
总10ul
放置4°C连接过夜
2.5 转化大肠杆菌
质粒DNA转化大肠杆菌方法：
1)把感受态细胞置于冰中；
2)把50ul的感受态细胞转至连接的DNA中（10ng一下，昏匀）；
3)冰中放置30分钟；
4)42°C放置45--60秒；
5)冰中放置2--3分钟；
6)加入37°C预热更好的soc培养基，使终体积1ml；
7)37°C振荡培养1小时（160--225r）
8)取适量的菌液涂布琼脂糖培养基
9)37°C过夜培养
2.6 验证（PCR）
表四：验证PCR体系
试剂用量
10xBuffer 2ul
dNTP 2.5ul
引物1 0.5
引物2 0.5ul
Taq酶0.5ul
加蒸馏水至25ul
PCR条件：94℃4min，94℃45s，51℃45s，72℃1m30s，30个循环，72℃10min。
3 结果分析
3.1 酶切结果
（M：Maker2000；B：bt2质粒；P：pet质粒；1，2，3···：每组实验）
图1 两种质粒的双酶切结果
在图1中可以清晰的看到，bt2质粒被酶Bam1HI和酶HindIII切成两条带，而pet质粒则被切成一条带，在bt2质粒中，第一条较粗的带为目的基因，第二条是双酶切切除目的基因后剩下的基因；在pet质粒中，可以看到的只有一条带，其实在双酶切下，pet质粒也会有两条带的，只不过是切完后的两段片段的质量差不多，在电泳的时候没能跑开来。由于bt2和pet质粒都是用相同的两种酶剪切，所以在在bt2质粒和pet质粒剪切下来的目的片段和载体片段都形成了相同的粘性末端。我们每组的结果都很清晰很成功，只要成功的地方很有可能是bt2质粒和pet质粒的质量都非常高。
3.2 转化大肠杆菌结果
图2 质粒DNA转化大肠杆菌
图2中可以清晰的看到白色的斑点，转化的大肠杆菌。由于目的基因中含有一些抗性基因，如，Amp、潮霉素等，而在培养基中也加有这如Amp、等的抗生素，能在培养基生长的细菌，它们的基因组里面应该是含有抗性基因的。从图中可以看到很多白色的斑点，能够正常生长的大肠杆菌，这些大肠杆菌中成功的转入了含有bt2质粒的目的基因。但是，这些白色的斑也有可能是假阳性，为了确定目的基因是否真正的转入大肠杆菌，还需要做PCR 验证。
3.3 验证的PCR结果
（M：maker2000；1-6：本组大肠杆菌结果；7-8：老师提供大肠杆菌结果）
图3 验证转化大肠杆菌PCR电泳图谱
图3中，白色方框内的为1班6组的结果，左边的六个孔是点用自己转化大肠杆菌PCR 的结果产物，右边两个点是老师提供转化大肠杆菌PCR的产物，可以看到，我们自己转化的大肠柑橘在电泳图中没有跑出来，而老师提供的大肠杆菌就可以跑出来。说明了我们自己转化的大肠杆菌虽然在抗生素培养基生存，但那是假阳性的大肠杆菌，而老师提供的大肠杆菌是成功转入了目的基因的阳性大肠杆菌。
4 讨论与分析
4.1 讨论
本实验所涉及的内容和步骤都非常多，有很多环节都是要注意的，这关系到整个实验的成功与失败，例如下面的这些：
1)感受态细胞非常脆弱，要轻拿轻放，不能过分的摇晃，更不能激烈震荡；
2)在做酶切和PCR过程中，尽量在冰上操作，保持低温环境；
3)在进行加样的时候要有耐心，因为进行双酶切时加入的物品的量都是比较少的，所以要
特别留意。特别是在把取出的样品加入到PCR管的时候更要注意，因为量太少，所以要粘着PCR的管壁来放样；
4)转化实验中所使用的玻璃仪器，微量吸管，离心管等应该彻底清洗干净，并进行高温高
压消毒灭菌，表面去污剂、化学试剂的污染残留会大大减低转化率。微量吸管应该剪去尖端扩大口径。
4.2 分析
质粒的重组和转化是基因工程的关键所在，所谓的基因的工程就是将真核细胞的基因能在原核细胞中成功地表达，这个实验通过质粒的重组和转化，这对基因工程的研究很有帮助的。在基因工程中，目的基因获取的途径有很多：从基因文库或cDNA文库中获取所需的目的基因；更具目的基因的序列来合成所需的目的片段；通过PCR扩增技术来获得所需的目的片段。而本实验就是通过PCR扩增技术来获取质粒DNA的，在进行电泳检测目的基因，可能会出现无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性、假阴性的现象。
参考文献：
[1] 梁红，梁雪莲. 生物技术综合实验教程[M]. 北京：化学工业出版社，2010.
汞的加标回收实验方法 实验原理及目的： 在测定样品的同时，于同一个样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定，将其测量结果扣除样品的测量值，从而得出所加标准的回收率。 加标回收率的测定可以反映测试结果的准确度。当按照平行加标进行回收测定时，所得结果可以反映测试结果的准确度，也可以判断其精密度。 实验仪器与材料: 仪器：AFS-2202E原子荧光光度计，恒温水浴箱。 试剂：5%HCL,5%氢氧化钠硼氢化钾混合溶液，溴酸钾溴化钾混合溶液(溴化剂)，20%盐酸羟胺，新制王水（1+1）。 样品：盐泥，脱盐水，清净水。 实验方法与计算：固体样品的加标回收实验 样品的测定：称取已制备好的固体样品（干燥碾碎）0.1000g-0.5000g四份分别于50ml干燥比色皿中，加入新制王水20ml，加塞充分摇动两分钟，然后于恒温水浴箱中加热消解2小时，注意水温不适过高，一般不能超过80℃，否则样品中的汞容易挥发。将消解完全的样品分别过滤至25 ml容量瓶中，首先用高纯水定容其中的两份样品并摇匀，另两份备用。 然后于定容后的两份试样中加入溴化剂0.5ml摇匀，于20℃以上室温下放置5min以上，应显黄色，否则应补加溴化剂到显黄色为止，但每25 ml容液中所加溴化剂不应超过4ml。最后边摇边滴加20%盐酸羟胺至黄色褪去，待测，同时做空白实验。 加标样品的测定：根据测定出的样品试样中汞的浓度，在备用的两份试样中加入一定量的0.1mg/L的汞标准溶液（一般加入的体积在0.1ml左右，可根据样品的浓度选择不同浓度的标准），使加标后样品试样的浓度增加一倍左右。然后同上述方法，测定加标样品中汞的浓度。 回收率的计算： 加标回收率=（加标样品的测定值-样品的测定值）/加标量×100%
加标回收率 有空白加标回收和样品加标回收两种 空白加标回收：在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。 样品加标回收：相同的样品取两份，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。 加标回收率的测定，是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术.对 于它的计算方法，给定了一个理论公式： 加标回收率=(加标试样测定值—试样测定值)加标量X 100%. 理论公式使用的约束条件 加标量不能过大，一般为待测物含量的0.5?2.0倍，且加标后的总含量不应超过方法的测定上限；加标物的浓度宜较高，加标物的体积应很小，一般以不超过原始试样体积的1%为好。加标后引起的浓度增量在方法测定上 限浓度C的0.4~0.6(C)之间为宜。对分光光度计来说，吸光度A在0.7以下，读数较为准确。 回收率计算结果不受加标体积影响的几种情况 F列情况下，均可以采用公式(2)计算加标回收率 (1) 样品分析过程中有蒸发或消解等可使溶液体积缩小的操作技术时，尽
管因加标而增大了试样体积，但样品经处理后重新定容并不会对分析结果产生影响?比如采用酚二磺酸分光光度法分析水中的硝酸盐氮(GB7480287),样品及加标样品经水浴蒸干后，需要重新定容到50 mL再行测定。 ⑵样品分析过程中可以预先留出加标体积的项目，比如采用离子选择电 极法分析水中的氟化物(GB7484287),当样品取样量为35 mL、加标样取 5.0mL以内时，仍可定容在50 mL ,对分析结果没有影响。 (3)当加标体积远小于试样体积时，可不考虑加标体积的影响?比如采用4- 氨基安替比林萃取光度法分析水中的挥发酚(GB7490287),加标体积若为 1.0 mL ,而取样体积为250 mL时,加标体积引起的误差可以忽略不计。 理论公式约束条件的含义 加标物的浓度宜较高，加标物的体积应很小”的含义便更加清晰：在计算加标试样浓度C2时，应尽可能减小标准溶液的取样体积V 0.只有这样，分别采用公式(3)和(4)的计算结果才会相等.由此可见,采用浓度值法计算加标回收率时，任意加大加标试样的体积，将会导致回收率测定结果偏低。 对加标量的规定： 1. 加标量应尽量与样品中待测物质含量相等或相近，并注意对样品容积的 影响 2. 当样品中待测物质含量接近方法检出限时，加标量应控制在校准曲线的 低浓度范围；当样品中待测物含量小于方法检出限时，以检出限的量作 为待测物质的含量加标
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
在测定样品得同时,于同一样品得子样中加入一定量得标准物质进行测定,将其测定结果扣除样品得测定值,以计算回收率 注意点 1.加标物得形态应该与待测物得形态相同 2.加标量应与样品中所含待测物得测量精密度控制在相同得范围内,一般情况下作如下规定: 1）加标量尽量与样品中待测物含量相等或相近,并应注意对样品容器得影响 2）当样品中待测物含量接近方法检出限时,加标量控制在校准曲线得低浓度范围 3）在任何情况下加标量均不得大于待测物含量得３倍 4）加标后得测定值不应超过方法得测量上限得90% 5）当样品中待测物浓度高于校准曲线得中间浓度时,加标量应控制在待测物浓度得半量 空白加标回收:在没有被测物质得空白样品基质中加入定量得标准物质,按样品得处理步骤分析,得到得结果与理论值得比值即为空白加标回收率。 样品加标回收:相同得样品取两份,其中一份加入定量得待测成分标准物质;两份同时按相同得分析步骤分析,加标得一份所得得结果减去未加标一份所得得结果,其差值同加入标准物质得理论值之比即为样品加标回收率。 加标回收率得测定, 就是实验室内经常用以自控得一种质量控制技术、对于它得计算方法, 给定了一个理论公式: 加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100%. 1、1 理论公式使用得前提条件 文献＆#91;1 &＃93;中对加标回收率得解释就是:“在测定样品得同时, 于同一样品得子样中加入一定量得标准物质进行测定, 将其测定结果扣除样品得测定值, 以计算回收率、"因此,使用理论公式时应当满足以下2 个条件:①同一样品得子样取样体积必须相等; ②各类子样得测定过程必须按相同得操作步骤进行。 1.2 理论公式使用得约束条件 文献[２＆＃93;中强调指出:加标量不能过大,一般为待测物含量得０、５~ 2、０倍, 且加标后得总含量不应超过方法得测定上限; 加标物得浓度宜较高, 加标物得体积应很小,一般以不超过原始试样体积得1％为好。 1。3 理论公式得不足之处 ( １)各文献对公式中“加标量"一词得定义, 均未准确给定, 使其含义不就是十分明确.从公式得分子上分析,加标量应为浓度单位; 从公式得分母上理解,应为加入一定体积得标准溶液中所含标准物质得量值, 为质量单位。 (2) 若公式中得加标量为浓度单位,此时得加标量并不就是指标准溶液得浓度, 而应该就是加标体积所含标准物质得量值除以试样体积(或除以试样体积与加标体积之与)所得得浓度值. 这里存在着浓度换算, 而在理论公式中并没有明确予以表现出来。? 2
体外诊断试剂 干扰评估指南-EP7A 郑金来 20110105
目录 前言 干扰物及其机理 干扰的标准 干扰评估 干扰筛选及其效果评价 用病人标本评价干扰效果 临床实验室验证 总结
前言 NCCLS：国家临床化学实验室标准化委员会。 NCCLS是一家国际性的、各学科间的、非盈利性的标准制定和教育组织，推动在医疗团体间发展和使用自愿性一致的标准和指南。 NCCLS已经得到了全球广泛的认可 NCCLS基于的原理为一致性是一个有效并经济的手段来提高患者测定和医疗服务。 https://www.doczj.com/doc/3b13211591.html,，EMAIL:exoffice@https://www.doczj.com/doc/3b13211591.html, 08年11月NCCLS已经更名为CLSI
前言 NCCLS文件以标准、指南或委员会报告的形式发表 标准：通过一致性程序发展出来的一项文件，以一种未经修饰的形式、清楚地确定材料、方法学或使用惯例的特定以及必须的要求 指南：根据一致性程序发展出来的一项文件，描述某个一般性操作惯例、程序或材料的标准，供用户自愿使用。使用指南时，可由用户根据其特定需要草拟或进行修改 报告：还没有提交进行一致性回顾的一种文件，由董事会发布。
前言 NCCLS的标准和指南代表了有关良好医疗实践的一致性意见。 反映了实质上受到影响的有资质的以及有兴趣的各方根据NCCLS建立的一致性程序得到的实质协定。 即使符合自愿性一致文件，但用户仍有自认适合法规的要求。 用户的意见对于一致性程序时必要的，任何人都可以向委员会提出自己的意见。
前言 干扰物质是体外诊断试剂使用过程中造成测量误差的一个主要原因，针对体外诊断试剂进行的干扰实验是指通过实验查找出对体外诊断试剂测量结果产生影响的物质的过程。 干扰实验评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常
实验三、酶切与连接 一、实验目的与原理简介 限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。 制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带； 而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面： 1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况； 4）切割与连接方式；5）接头状态。 酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种： 1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。 2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。 二、材料和试剂 限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪 三、实验步骤 1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下： 2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。 3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。 4）回收产物电泳检测后进行连接： 连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl 目的基因 6μl 质粒载体 2μl 产物酶切体系 pPI9K 质粒酶切体系 DDW 4.6μl DDW 7μl 10×H Buffer 1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段 4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut 0.2μl(37 ℃15min)
加标回收率 2010-07-26 09:52 空白加标回收和样品加标回收 空白加标回收：在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。 样品加标回收：相同的样品取两分，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准的理论值之比即为样品加标回收率。 加标回收率的测定, 是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术. 对于 它的计算方法, 文献中均给定了一个理论公式： 加标回收率= (加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100%. 理论公式使用的前提条件 文献中对加标回收率的解释是:“在测定样品的同时, 于同一样品的子样中 加入一定量的标准物质进行测定, 将其测定结果扣除样品的测定值, 以计算回 收率. ”因此,使用理论公式时应当满足以下2 个条件：①同一样品的子样取样体积必须相等; ②各类子样的测定过程必须按相同的操作步骤进行。 理论公式使用的约束条件 文献中强调指出: 加标量不能过大,一般为待测物含量的0.5～2.0 倍, 且加标后的总含量不应超过方法的测定上限;加标物的浓度宜较高, 加标物的体积应很小，一般以不超过原始试样体积的1%为好。 回收率计算结果不受加标体积影响的几种情况 下列情况下, 均可以采用公式(2) 计算加标回收率。 (1) 样品分析过程中有蒸发或消解等可使溶液体积缩小的操作技术时, 尽 管因加标而增大了试样体积, 但样品经处理后重新定容并不会对分析结果产生 影响. 比如采用酚二磺酸分光光度法分析水中的硝酸盐氮(GB7480287) , 样品及加标样品经水浴蒸干后, 需要重新定容到50 mL 再行测定。 (2) 样品分析过程中可以预先留出加标体积的项目, 比如采用离子选择电 极法分析水中的氟化物(GB7484287) , 当样品取样量为35 mL、加标样取5.0 mL 以内时, 仍可定容在50 mL , 对分析结果没有影响。 (3) 当加标体积远小于试样体积时, 可不考虑加标体积的影响. 比如采用4-氨基 安替比林萃取光度法分析水中的挥发酚(GB7490287) , 加标体积若为1.0 mL , 而取样体积为250 mL 时, 加标体积引起的误差可以忽略不计。 理论公式约束条件的含义 在具体实践中, 考虑使用加标体积对回收率测定结果影响的公式(3) 时, 其计算结果常比使用公式(4) 计算的结果偏低, 最大时偏差可超过10%. 一般来讲,
加标回收率计算方法的探讨 摘要：阐述了加标回收率计算的理论公式的使用条件和不足, 并推导出5 种不同条件下适用的加标回收率计算方法的数学表达式。 关键词: 加标回收率; 理论公式; 计算方法 加标回收率的测定, 是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术. 对于它的计算方法, 文献[1, 2 ]中均给定了一个理论公式： 加标回收率= (加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100%. 1 理论公式的使用条件与不足 1.1 理论公式使用的前提条件 文献[1 ]中对加标回收率的解释是:“在测定样品的同时, 于同一样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定, 将其测定结果扣除样品的测定值, 以计算回收率. ”因此,使用理论公式时应当满足以下2 个条件：① 同一样品的子样取样体积必须相等; ②各类子样的测定过程必须按相同的操作步骤进行。 1.2 理论公式使用的约束条件 文献[2 ]中强调指出: 加标量不能过大,一般为待测物含量的0.5～ 2.0 倍, 且加标后的总含量不应超过方法的测定上限; 加标物的浓度宜较高, 加标物的体积应很小，一般以不超过原始试样体积的1%为好。 1.3 理论公式的不足之处 ( 1) 各文献对公式中“加标量”一词的定义, 均未准确给定, 使其含义不是十分明确. 从公式的分子上分析, 加标量应为浓度单位; 从公式的分母上理解, 应为加入一定体积的标准溶液中所含标准物质的量值, 为质量单位。 (2) 若公式中的加标量为浓度单位, 此时的加标量并不是指标准溶液的浓度, 而应该是加标体积所含标准物质的量值除以试样体积(或除以试样体积与加标体积之和)所得的浓度值. 这里存在着浓度换算, 而在理论公式中并没有明确予以表现出来。 2 加标回收率计算方法及数学表达式 2.1 以浓度值计算加标回收率理论公式可以表示为： P =（c2－c1）/c3× 100%. (1) 式中: P 为加标回收率；c1 为试样浓度, 即试样测定值, c1 =m 1/V 1；c2 为加标试样浓度，即加标试样测定值, c2 =m 2/V 2；c3 为加标量, c3 =c0 ×V 0/V 1或c3 =c0 ×V
是 A《医学实验室质量和能力的专用要求》 B.《检测和校准实验室能力的通用要求》 C.《实验室生物安通用要求》 D.以上都对 答案：A 2.为了实施质量体系 A.在与质量活动有关的部门和岗位上都使用相应的有效版本文件 B.及时撤出失效文件 C.及时撤出作废文件 D.以上都对 答案：D 3.实验室对质量体系运行全面负责的人是： A.最高管理者 B.质量负责人 C.技术负责人 D.专业实验室组长 答案：A 4.下列活动中的哪一项必须有与其工作无直接责任的人员来进行 A.管理评审者 B.合同评审者 C.监督检验 D.质量体系审核 答案：D 5.进行现场质量体系审核的主要目的是 A.修改质量手册 B.检验质量体系文件的实施情况 C.修改程序文件 D.寻找质量体系存在的问题 答案：B 6.实验室的客户请一个有资格的机构对该实验室进行质量体系审核，这种审核称为 A.第一方审核 B.第二方审核 C.第三方审核 D.以上都对 答案：C 7.审核过程中确定中确定的不符合项必须 A.记录 B.备受审核方管理层认可 C.第三方审核 D.第一方审核 答案：B
8.有时工作急需，所采购的物资或在校准/检测过程中的消耗品来不及检验或沐浴合适的仪器，又不能确定质量的，在此种情况下 A.仍不准投入使用 B.应充分相信供应商出具的合格证或充分相信校准/检测操作员的经验和技术水平，可以投入使用 C.要经实验室授权人审批后，做好记录和标识后方可放行使用 D.经实验室授权人审批后，可以不做记录和标识后就可放行使用 答案：C 9.对仪器设备的审查主要是审查 A.校准/检测检测证书的合法性 B.量值溯源结果的有效性 C.仪器设备使用记录的完整性 D.以上都对 答案：B 10.通常一般医院实验室属生物安全几级实验室 A.一级 B.二级 C.三级 D.四级 答案：B 11.“患者准备”是： A.检验程序内容 B.预防措施 C.检验前程序内容 D.检验后程序内容 答案：C 12.对于测量设备 A.只有经授权的人才可操作设备 B.只有实验室主任才可操作设备 C.进入实验室的人，只要按照说明要求都可操作设备 D.各实验室组长都可操作设备 答案：A 13.医学实验室是 A.以诊断、预防、治疗人体疾病或评估人体健康提供信息为目的 B.对来自人体材料进行临床化学、临床微生物学、临床血液学、临床免疫学、临床细胞学等检验的实验室 C.实验室可以提供其检查范围内的咨询性服务 D.以上都是 答案：D 14.对质量体系的总要求可以归纳为 A.写你所做的（应该做到的事情一定要写成文件） B.做你所写的（写入文件的内容一定要做到） C.记你所做的（做到的事情一定要有记录） D.以上都对
在测定样品的同时，于同一样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定，将其测定结果扣除样品的测定值，以计算回收率 注意点 1.加标物的形态应该和待测物的形态相同 2.加标量应和样品中所含待测物的测量精密度控制在相同的范围内，一般情况下作如下规定： 1）加标量尽量与样品中待测物含量相等或相近，并应注意对样品容器的影响 2）当样品中待测物含量接近方法检出限时，加标量控制在校准曲线的低浓度范围 3）在任何情况下加标量均不得大于待测物含量的3倍 4）加标后的测定值不应超过方法的测量上限的90% 5）当样品中待测物浓度高于校准曲线的中间浓度时，加标量应控制在待测物浓度的半量 加标回收率- 有空白加标回收和样品加标回收两种 空白加标回收：在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。 样品加标回收：相同的样品取两份，其中一份加入定量的待测成分标准物质；两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。 加标回收率的测定, 是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术. 对于它的计算方法, 给定了一个理论公式： 加标回收率= (加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100%. 加标回收率- 理论公式的使用条件与不足 1.1 理论公式使用的前提条件 文献[1 ]中对加标回收率的解释是:“在测定样品的同时, 于同一样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定, 将其测定结果扣除样品的测定值, 以计算回收率. ”因此,使用理论公式时应当满足以下2 个条件：①同一样品的子样取样体积必须相等; ②各类子样的测定过程必须按相同的操作步骤进行。 1.2 理论公式使用的约束条件 文献[2 ]中强调指出: 加标量不能过大,一般为待测物含量的0.5～ 2.0 倍,
DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4m l菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR 产物片段=1：10，一般取前者，后者取。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=μg，如载体是5380bp，则为××=μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER 2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①? 全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②? 42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③ 加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
1.ISO15489是 A《医学实验室质量和能力的专用要求》 B.《检测和校准实验室能力的通用要求》 C.《实验室生物安通用要求》 D.以上都对 2.为了实施质量体系 A.在与质量活动有关的部门和岗位上都使用相应的有效版本文件 B.及时撤出失效文件 C.及时撤出作废文件 D.以上都对 3.实验室对质量体系运行全面负责的人是： A.最高管理者 B.质量负责人 C.技术负责人 D.专业实验室组长 4.下列活动中的哪一项必须有与其工作无直接责任的人员来进行？ A.管理评审者 B.合同评审者 C.监督检验 D.质量体系审核 5.进行现场质量体系审核的主要目的是 A.修改质量手册 B.检验质量体系文件的实施情况 C.修改程序文件 D.寻找质量体系存在的问题 6.实验室的客户请一个有资格的机构对该实验室进行质量体系审核，这种审核称为 A.第一方审核 B.第二方审核 C.第三方审核 D.以上都对 7.审核过程中确定中确定的不符合项必须 A.记录 B.备受审核方管理层认可 C.第三方审核 D.第一方审核 8.有时工作急需，所采购的物资或在校准/检测过程中的消耗品来不及检验或沐浴合适的仪器，又不能确定质量的，在此种情况下 A.仍不准投入使用 B.应充分相信供应商出具的合格证或充分相信校准/检测操作员的经验和技术水平，可以投入使用 C.要经实验室授权人审批后，做好记录和标识后方可放行使用 D.经实验室授权人审批后，可以不做记录和标识后就可放行使用 9.对仪器设备的审查主要是审查
A.校准/检测检测证书的合法性 B.量值溯源结果的有效性 C.仪器设备使用记录的完整性 D.以上都对 10.通常一般医院实验室属生物安全几级实验室 A.一级 B.二级 C.三级 D.四级 11.“患者准备”是： A.检验程序内容 B.预防措施 C.检验前程序内容 D.检验后程序内容 12.对于测量设备 A.只有经授权的人才可操作设备 B.只有实验室主任才可操作设备 C.进入实验室的人，只要按照说明要求都可操作设备 D.各实验室组长都可操作设备 13.医学实验室是 A.以诊断、预防、治疗人体疾病或评估人体健康提供信息为目的 B.对来自人体材料进行临床化学、临床微生物学、临床血液学、临床免疫学、临床细胞学等检验的实验室 C.实验室可以提供其检查范围内的咨询性服务 D.以上都是 14.对质量体系的总要求可以归纳为 A.写你所做的（应该做到的事情一定要写成文件） B.做你所写的（写入文件的内容一定要做到） C.记你所做的（做到的事情一定要有记录） D.以上都对 15.GB19489－2004《实验室生物安全通用要求》规定实验室个人责任 A.可以在工作区域内使用化妆品和处理隐形眼镜 B.在工作区域内可以佩带戒指、耳环、腕表、手镯、项链和其他珠宝 C.可以在工作区域中喝水 D.个人物品、服装和化妆品不应该放在有规定禁放的和可能发生污染的区域 16.GB19489－2004《实验室生物安全通用要求》规定实验室安全工作行为 A.实验室工作人员在实际或可能接触了血液、体液或其他污染材料后，即使带手套也应立即洗手 B.工作人员离开实验室可以带手套出实验室 C.摘除手套，使用卫生间前后可以不用洗手 D.可以带手套吸烟 17.GB19489－2004《实验室生物安全通用要求》规定实验室工作人员的免疫状态 A.所有实验室工作人员应接受免疫以预防其可能被所接触的生物因子的感染，并
干扰实验
1.干扰实验 1.1 干扰物对检测结果的影响 1.1.1 干扰物的干扰效果 检测方法的总分析误差有3个主要来源：不精密度、方法特异性偏差、样品特异性偏差。方法学评价时通常只考虑前2者，样品特异性偏差常被认为与特定样品有关，不属于方法学的计量特征。但如果一种检测方法本身易受某种干扰物质的影响，则干扰物即可引起系统误差也可引起偶然误差。 当采用特异性更好的方法做为比对方法时，特定病人群体样品中某中干扰物的平均浓度可引起系统偏差，而偏离平均偏差的个体差异则成为总偶然误差的成份。某些方法中随机干扰效果超过不精密度成为偶然误差的主要来源。 对于个体病人，干扰物的干扰效果可随样品中干扰物浓度的不同发生变化，这可被误认为是病人病情的改变。干扰物对检测结果的影响可通过一些方法进行补偿或修正，使干扰效果在特定病人群体中减小。对于常见的内源性干扰物（如胆红素、血红蛋白、脂类等），可通过样品前处理、样品空白、血清基质校准或数学修正等
方法减少干扰效果。 1.1.2 干扰效果机制 干扰物对分析过程的影响机制有： ——化学效应：干扰物通过与试剂竞争或抑制指示反应改变反应结果，也可通过络合或沉淀作用改变分析物的形式。 ——物理效应：干扰物可具有与被测量相近的性质，如荧光、颜色、光散射、洗脱位置或检测时的电极反应等。 ——基质效应：干扰物可改变样品基质的物理特性，如粘度、表面张力、浊度或离子强度等，从而改变被测量浓度。 ——酶抑制作用：干扰物可与金属激活因子形成螯合物、与催化位点结合、氧化必需巯基基团而改变被测量或试剂中酶的活性。 ——检测方法的非特异性：干扰物以与被测量同样的方式参与反应。尽管非特异性与干扰有所不同，但对实验结果的效果的相同的。如：酮酸在碱性苦味酸法测肌酐时发生反应，吲哚硫酸盐在重氮法测胆红素时发生反应，免疫化学中的交叉反应等。 ——水的取代效应：非水溶性物质（蛋白、脂类
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：https://www.doczj.com/doc/3b13211591.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
加标回收率 加标回收率，是指在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。 空白加标回收:在没有被测物质的空白样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值即为空白加标回收率。 样品加标回收:相同的样品取两份，其中一份加入定量的待测成分标准物质;两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。 加标回收率的测定,是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术.对于它的计算 方法,给定了一个理论公式: 加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%. 理论公式 理论公式使用的前提条件 在测定样品的同时,于同一样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定,将其测 定结果扣除样品的测定值,以计算回收率.因此,使用理论公式时应当满足以下2个条件:①同一样品的子样取样体积必须相等;②各类子样的测定过程必须按相同的操作步骤进行。 理论公式使用的约束条件 加标量不能过大,一般为待测物含量的0.5~2.0倍,且加标后的总含量不应超过方法的测定上限;加标物的浓度宜较高,加标物的体积应很小，一般以不超过原始试样体积的1%为好。 理论公式的不足之处 (1)各文献对公式中"加标量"一词的定义,均未准确给定,使其含义不是十分明确.从公式的分子上分析,加标量应为浓度单位;从公式的分母上理解,应为加入一定体积的标准溶液中所含标准物质的量值,为质量单位。 (2)若公式中的加标量为浓度单位,此时的加标量并不是指标准溶液的浓度,而应该是加标体积所含标准物质的量值除以试样体积(或除以试样体积与加标体积之和)所得的浓度值.这里存在着浓度换算,而在理论公式中并没有明确予以表现出来。 计算方法 2.1以浓度值计算加标回收率理论公式可以表示为
1001. [单选题] 对常用的又是易制毒的试剂，应： A.放在试剂架上 B.放在抽屉里，并由专人管理 C.锁在实验室的试剂柜中，并由专人管理 参考答案: C 1002. [单选题] 下面所列试剂不用分开保存的是： A.乙醚与高氯酸 B.苯与过氧化氢 C.丙酮与硝基化合物 D.浓硫酸与盐酸 参考答案: D 1003. [单选题] 甲苯属于何种级别的毒性 A.剧毒 B.高毒 C.低毒 D.微毒 参考答案: C 1004. [单选题] 责任报告单位对甲类传染病、传染性非典型肺炎和乙类传染病中艾滋病、肺炭疽、脊髓灰质炎的病人、病原携带者或疑似病人，应于（）小时内通过传染病疫情监测信息系统进行报告。 A.2小时 B.3小时 C.4 小时 D. 5小时 1
参考答案: A 1005. [单选题] 湿热灭菌最高温度和时间通常为 A.100℃，15min； B.131℃，15min； C.121℃，15min 参考答案: C 1006. [单选题] 属于Ⅱ级易燃液体的是:( ) A.甲醇 B.煤油 C.丁醇 D.甘油 参考答案: C 1007. [单选题] 普通塑料、有机玻璃制品的加热温度不能超过： A.40℃ B.60℃ C.80℃ D.100℃ 参考答案: B 1010. [单选题] 高致病性病原微生物菌（毒）种或者样本的运输方式不包括：（） A.应当通过陆路运输。 B.可以通过水路运输。 C.紧急情况下运输或者需要运往国外的，可以通过民用航空运输。 D.地区内运输可通过公共电（汽）车和城市铁路运输。 参考答案: D
1011. [单选题] 需要你将硫酸、氢氟酸、盐酸和氢氧化钠各一瓶从化学品柜搬到通风橱内，正确的方法是： A.硫酸和盐酸同一次搬运，氢氟酸和氢氧化钠同一次搬运 B.硫酸和氢氟酸同一次搬运，盐酸和氢氧化钠同一次搬运 C.硫酸和氢氧化钠同一次搬运，盐酸和氢氟酸同一次搬运 D.硫酸和盐酸同一次搬运，氢氟酸、氢氧化钠分别单独搬运 参考答案: D 1012. [单选题] 把玻璃管或温度计插入橡皮塞或软木塞时，常常会折断而使人受伤。下列不对的操作方法是: A.可在玻璃管上沾些水或涂上甘油等作润滑剂 B.一手拿着塞子，一手拿着玻璃管一端(两只手尽量靠近)，边旋转边慢慢地把玻璃管插入塞子中 C.橡皮塞等钻孔时，打出的孔比管径略小，可用圆锉把孔锉一下，适当扩大孔径 D.无需润滑,且操作时与双手距离无关 参考答案: C 1013. [单选题] 考查候选方法的准确性应选用的评价试验为（） A.重复性试验 B. 对照试验 C.干扰试验 D.回收试验 参考答案: D 1014. [单选题] 实验室存放化学品不得使用哪类冰箱？ A.机械温控冰箱 B.电子温控冰箱 C.防爆冰箱 3