中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所
硕士学位论文
HBV启动子调控的肝细胞高表达载体构建及抑癌作用研究
姓名：孙强玲
申请学位级别：硕士
专业：生物化学与分子生物学
指导教师：郑晓飞
20040525
里！兰竺笙苎一．一基塞！堕一
英文缩写Ａｄ
ＡＦＰ
Ａｍｐ
ｂｐ
ＢＬＡＳＴｃＤＮＡ
ＣＭＶ
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ＤＮＡ
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ＥＢ
ＥＮｌＩ
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ＧＦＰ
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ＭＣＳ
Ｍｉｎ英文全名
Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ
旺一ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ
Ｂａｓｅｐａｉｒ
英文缩写表
中文全名
腺病毒
甲胎蛋白
氨苄青霉素
碱基对
Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈ基本同源序列排列工ｔｏｏｌ具
ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ互补ＤＮＡ
ＣｙｔｏｍｅｇａＩｏｖｉｒｕｓ巨细胞病毒
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｎｄｅ二甲基亚砜
Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ焦碳酸二乙酯
Ｄｅｏｘｙ“ｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ脱氧核糖核酸
Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄｗａｔｅｒ去离子水
西ｃ＾Ｐ，，如抽ｃＤ，ｆ大肠杆菌
Ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ溴化乙锭
ＥｎｈａｎｃｃｒＩＩ增强子ＩＩ
Ｆ１０ｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ流式细胞术
ｇｒｅｅｎｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ绿色荧光蛋白
ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ乙肝病毒
Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ肝细胞癌
Ｋｉｌｏｂａｓｅｐａｉｒｓ千碱基对
ＫｉｌｏＤａｌｔｏｎ干道尔顿
Ｌｕｒｉａ－ＢｅｎａｎｉｍｅｄｉｕｍＬＢ培养基
Ｍ”Ｉｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ多克隆位点
ｍｉｎｕｔｅ分钟
硕士学位论文
ＭＴＴ
ｍＲＮＡＮＰ４０
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英文缩写
ＰＩ
ＰＣＲＰＥＧＰＢＳ
ＩＵ二ＰＣＲｒｐｍ
ＲＮＡ
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ｕｌＥＤＴＡ
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Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０ＯｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ
ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ
ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ
ＲｅＶｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ
ＲｏｕｎｄｐｅｒｍｉｎｕｔｅＲｉｂｏｍｌｃｌｅｉｃａｃｉｄ
噻唑蓝
信使ＲＮＡ
乙基苯基聚乙二醇光密度
碘化丙啶
聚合酶链式反应
聚乙二醇
磷酸盐缓冲液
逆转录ＰＣＲ
转每分核糖核酸
Ｔ“ｓ．ｃｌ，ＥＤＴＡｂｕｆｂｒ
ＴＥ缓冲液
１Ｈｓ卫ｌａｃｉａｌ
Ａｃｅｔｉｃ
ａｎｄＥＤＴＡ
…。
乙酸、ＥＤＴＡ缓冲液ＤＵＩＩｅｒ
Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ
微升
Ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ—ａｃｅｔｉｃ
ａｃｉ（ｉｄｉｓ。ｄｉｕｍｓａｌｔ
乙二胺四乙酸二钠
Ｖａｓｃｕｋ嵋
ｅｎｄＯｔｈｅｎａｌ
叠ｒｏｗｔｈ．
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血管内皮生长因子
塑主兰竺丝兰一——————土至壁墅！一
皿ｖ启动子调控的肝细胞高表达载体
构建及抑癌作用研究
摘要
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年使大约１００万例病人死亡，尽管目前肝癌的治疗方法很多，但仍未能从根本上改变病人的预后。近年来肝癌的基因治疗已经成为生物医学和临床医学研究的热点。肝癌基因治疗的靶向性调控，即调控目的基因特异性导入肝癌细胞或在肝癌细胞中实现特异性表达，最大限度的杀伤肝癌细胞的同时而不损伤正常肝细胞，已成为决定基因治疗效果及可行性的关键因素。
分子病毒学研究揭示了ＨＢＶ的表达调控机制，为利用ＨＢＶ嗜肝细胞基因表达调控特性构建肝细胞特异表达载体提供了条件。船Ｖ基因组仅有３．２ｋｂ，结构紧密，所有调控序列均位于蛋白编码区。ＨＢＶ３．５ｋｂ、２．４ｋｂ、２．１ｋｂ和Ｏ．９ｋｂ的ＲＮＡ转录物的起始点附近各有一个启动子，分别为ｃ、ｓＰＩ、ＳＰＩＩ和ｘ启动子。另外在１０７４～１２３４位核菅酸和１６２弘１７７４位核苷酸处有ＨＢＶ的两个增强子ＥＮＩ和ＥＮＩＩ。该两段序列具有高度保守性，并在其上有多个肝特异转录因子的结合位点，与ＥＮＩ结合的转录因子有肝细胞特异性的Ｃ，ＥＢＰ、｝Ⅱ虾４和衄ｌＦ，与ＥＮＩＩ相结合的肝细胞蛋白因子有Ｃ但ＢＰ、ｍ盯．４、ＨＬＦ、｝ⅡｑＦ３、Ｆ１下和Ｅ４ＢＰ４等。由于与｝ⅢＶ的启动予和增强子特异结合的转录表达调控因子几乎只存在于肝细胞中，而不存在于其它细胞中，决定了肝细胞增强子ＥＮＩ和ＥＮＩＩ具有高度肝细胞专一陛，其对ＨＢＶ在肝细胞中的特异表达有相当重要的贡献，并在一定程度上决定了ＨＢｖ的嗜肝｜生。
因此，以ＨＢＶ病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子、增强子为表达调控元件构建肝细胞特异表达载体携带只对肿瘤细胞起抑制或促调亡作用的治疗基因导入人体后，便可达到杀伤肝癌细胞而对正常肝细胞或非肝细胞无影响的目的，充分体现了基因治疗的优势。据此，本论文拟进行以下研究：（１）克隆不同的ＨＢｖ启动子片段，评价其在肝细胞和非肝细胞中的转录活眭。筛选出在肝细胞中特异性表达最强的ＤＮＡ序列组合形式。（２）构建ＨＢＶ启动子调控的外源端粒酶ｈｎ盯反义ＲＮＡ、印ｏｐｔ抽、ＩＬ一２４和ＯＳＭ基因载体，并检测各种治疗基因在体内外的抑癌作用。
婴主兰篁笙奎一一——————』兰兰塑兰一主要工作及结果概述如下
（一）肝细胞特异表达载体的构建
１．构建了受ＨＢｖＥＮＩＩ加基本核心启动子（ＢｃＰ）、ＥＮＩ和ＥＮＩＩ加ＢＣＰ联合调控、以及ＥＮＩＩ加ＢＣＰ联合ｍＣＭｖ调控的五种荧光素酶报告载体。
２．筛选获得了肝细胞高效特异表达的载体
应用脂质体介导基因转染技术将此５种质粒转染ＨｅｐＧ２、２．２１５、ＢＥＬ一７４０２、ｓＭＭＣ７７２１等４种肝癌细胞和肝细胞Ｌ０２以及５种非肝细胞Ｈｅｌａ、４４６、ＭｃＦ７、８０３、Ａ３７５，双荧光素酶报告基因实验检测其活性。ｐＥＮｌＩＲ（突变型）在各种肝细胞中的转录活性为阳性对照Ｓｖ４０启动子的Ｏ．９８７～５．７９倍，ｐＥＮＩ．１１ｗ（ａｙｗ型）为在肝细胞中转录潘ｉ生为阳性对照ｓｖ４０启动子的１．２５～１５．３１倍，ｐＥＮＩ．ＩＩＲ（突变型）在肝细胞转录活｜生为阳性对照Ｓｖ４０启动子的３．７６￣２１．８３倍，ｐＥＮＩＩｍｃＭＶ在肝细胞转录滑ｌ生可为阳性对照Ｓｖ４０启动子的９．４９￣９１．７１倍；同时发现野生型ＥＮｌｌｗ启动子在５种肝细胞中的转录活性分别为ｓｗＯ启动子转录活性的１．３２～１１．１２倍，而在５种非肝细胞中转录活性仅为ＳＶ４０启动子的２９．３５％￣ｏ．２７％，提示ＨＢＶ野生型ＥＮｌｌｗ启动子具有明显的嗜肝特异性表达的特性，该结果为特异性抗耶ｖ及抗肝癌药物评价系统的建立创造了条件。３．获得了一条新型ＨＢＶ启动子序列
以慢性ＨＢＶ病人的血清为模板，ＰＣＲ扩增出ＨＢＶ基因组中含ＥＮＩ和ＥＮＩＩ及核心启动子（ＢｃＰ）序列的片段，Ｃｐ区序列存在变异，但Ｃｐ区突变并没有降低该启动子转录活陛，该ＨＢＶ启动子在肝细胞中均具有较强的转录活性，尤其是在稳定转染了乙肝病毒的２．２．１５细胞中转录活性更高。该突变序列在ＧｅｎｅＢａｎｋ中未注册过，为本实验首次发现新序列。
（二）册Ｖ启动子调控表达的外源端粒酶ｈＴＲＴ反义ＲＮＡ、ａｐｏｐｔｉｎ、ＩＬ＿２４和０ＳＭ基因载体的构建
构建了肝细胞高表达船Ｖ启动子及Ｓｖ４０启动子调控的ａｐｏｐｔ协基因及反义ｈｎ己Ｔ的真核表达载体ｐＥＮＩＩＷ－印ｏ、ｐＳＶ４０＿ａｐｏ、ｐＥＮｌｌｗ．ａｓｌ】ＴＲＴ（１．２ｋｂ）、
ｐＳＶ４０埘ＬｈＴＲＴ（１．２ｋｂ），另外还构建了肝细胞高表达｝皿ｖ启动子及Ｓｖ４０启动子调控的ＯＳＭ基因、ＩＬ一２４基因的真核表达载体ｐＥＮＩＩＷ＿０ｓｍ、ｐＥＮＩＩＷ：２４、ｐＳＶ４０—２４。将以上获得的各载体转染肝癌细胞ＨｅｐＧ２，通过ＲＴ．ＰＣＲ分别检测ＨＢＶ启动子和Ｓｖ４０启动子
堕主堂垡笙苎————』生塑堕！！一驱动ａｐｏｐｔｉｌｌ、ＩＬ．２４、反义ｈＴＲＴ和ｏｓｍ基因在ＨｅｐＧ２细胞中的转录情况，结果表明在肝癌细胞中均可检测到外源ａｐｏｐｔｉｌｌ、ＩＬ．２４、反义ｈｎ玎基因和ｏｓｍ基因的转录。
（三）瑚ｗ启动予调控表达的端粒酶ｈＴＲＴ反义ＲＮＡ、ａｐｏｐｔｉＩｌ、ＩＬ２４和ｏｓＭ基因载体体内外抑癌作用
１．体外抑癌作用
为了研究印ｏｐ血、ＩＬ２４、反义ｈⅡ汀和ｏｓｍ基因表达对肝癌细胞和非肝癌细胞的作用，采用ＭＴＴ法和流式细胞法分别检测它们对肝癌细胞和非肝癌细胞增殖抑制的影响和诱导细胞凋亡的情况。结果显示以上四种载体在三种肝癌细胞ＨｅＤＧ２、７４０２、７７２１中均出现明显的细胞增殖抑制现象，ｐＥＮＩＩＶ，＿２４转染抑制率为１１．６‰３７．６％，ｐＥＮＩＩＷ＿ａｐ咖ｎ为２０．Ｏ％∞３．７‰ｐ刚ＩＩＷ－ｏｓｍ为１３．８％￣２９．％，ｐＥＮＩＩＷ一髂ｈ豫Ｔ为１１．２％￣２１．９％。ｐＥＮＩＩＷ—ｏＳｍ在肝癌细胞中可引起一定程度的凋亡，凋亡率为阳性对照Ｓｖ４０质粒的８２．５￣８４．４％，高于转染了上述四种质粒的非肝癌细胞Ｈｅｌａ、Ｈ４６０；而转染ｐＳＷＯ—ａｐｏｐｔｉｌｌ、ｐｓＶ４０－２４、ｐＳＶ４０—ａＳｈＩＲＴ和ｐＳＶ４０＿ｏｓｍ四种质粒的肝癌细胞和非肝癌细胞均出现了明显的细胞增殖抑制现象。
２．体内抑癌作用
ｐＥＮＩＩＷ＿２４、倒ＩＩＷ－ａｓｈＴＲＴ和ｐＥＮＩＩＷ＿ｏｓｎｌ转染Ｈ印Ｇ２细胞，皮下接种ＢＡＬＢ／ｃ
裸鼠的背部，接种２１天后，可以观察到，在未转染、转染空质粒和转染ＤＥＮＩＩＷ＿２４、ｐＥＮｌｌｗ－ａ㈣和ｐＥＮｌｌｗ＿０ｓｍ质粒的细胞组，裸鼠的成瘤率分别为１００％、１００％、５０％、５０％和２５％，瘤体的平均重量分别为１３３．５ｍ昏４９．５ｒｎｇ、６．５ｍｇ、１０．２ｍｇ和２＿３ｍｇ。这表明ＩＬ－２４、反义ｈｎ盯和ＯＳＭ基因转染对体内ＨｅｐＧ２细胞的生长产生了明显的抑制作用。
综上所述，本研究以ＨＢｖ病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子、增强子为调控序列构建载体，通过双荧光素酶报告基因试验，筛选获得了肝细胞中高效特异表达的载体，并克隆获得了一条新型耶Ｖ启动子序列。同时验证了肝细胞中高效表达的载体携带外源性治疗基因在肝癌细胞中的表达，并通过ＭＴＴ、流式细胞术及裸鼠接种试验评价了其体内外抑癌效应，结果表明端粒酶ｈⅡ盯反义ＲＮＡ、ａｐｏｐ曲、ＩＬ２４和０ＳＭ基因在体外
均列＿肝癌细胞中有一定的杀伤和抑制作用，在体内可明显抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞的生长。ＨＢＶ启动子调控的反义嘲、印叩Ⅱｎ、ＩＬ－２４和ＯＳＭ等载体可以有效的确保效应基因
硕士学位论文中文摘要在肝细胞中的表达，而减少了对非肝癌细胞的损伤。
关键词：ＨＢｖ；启动子；肝癌：基因治疗
婴圭兰垡兰奎——一————————————』生Ｌ—
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｏｃｙｔｅＨｉｇｈＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆＶｂｃｔｏｒｓ
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３．ＡｎｅｗｔｙｐｅｏｆＨＢＶｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｌＩｅｄ
堡主兰堡丝兰一——————————————————竺三—一Ｐ０１ｙｒｎｅｍＳｅｃｈａｉｌｌ
ｒｅ捌ｏｎｗ髂ｅｍｐｌｏｙｅｄｔ０姗ｐｌ田ｔ１１ｅ皿Ｖ斟Ｉ、ＥＮＩＩａｎｄｃｏｒｅ
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前言
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，全球每年因患原发性肝癌的死亡人数约４５万～１００万，位居恶性肿瘤死因的第四位。在我国其病死率列恶性肿瘤病死率的第二位，占我国全部恶性肿瘤死亡人数的１８．８％。在我国大规模的流行病学调查和现代血清学、分子生物学研究发现：原发性肝癌（Ｈｅｐ甜ｃｃａｒｃ豳ｎｌａ，ＨＣＣ）号陧性乙型肝炎病毒∞ｐ撕吐ｓＢ“ｎｌＳ，璐Ｖ）感染之间存在明显的相关性，多数病人发病前都有一长期的ＨＢｖ慢性感染携带状态。近年来丙型肝炎（ＨｃＶ）感染引起的Ｈｃｃ有上升趋势。过去的十几年，与其他类型消化道肿瘤相比，ＨＣＣ的早期诊断、早期治疗相对进展不大。就诊的患者病期偏晚，治疗效果差，复发率高，并发症多，死亡率高。临床上治疗手段单一，效果也差。
随着肿瘤分子生物学和免疫学理论及技术的发展，在一定程度上阐明了肝癌的发生、发展及演变过程。研究表明，肝癌是由基因突变及基因表达异常引起的，故用基因工程的手段开发靶向分子药物和新的治疗方法进行肝癌的基因治疗，是目前医学界研究的热点。
基Ｉ司治疗是指基因直接导入人体用于治疗和预防疾病。确切地说，它指的是遗传信息相关的特异性ＤＮＡ序列的转移，是一项高度集成、综合性高难度的生物技术。它集中了基因分离、基因导八人体、基因在人体内的高效表达及其调控技术，既要求有效而又需确保安全。基因治疗有三个重大关键技术问题：基因导入系统、基因在人体内表达及其调控系统和有效的治疗基因。现就肝癌的基因治疗简要介绍如下：
一．肝癌基因治疗中基因导入系统的选择
（一）病毒载体系统
当前在肝癌基因治疗实验中使用最多的是病毒载体系统，腺病毒载体在肝癌治疗试验当中应用较多，因其具有可插入大片段，转染效率高等优点，施明等…利用携带人野生型ｐ５３、ＧＭ—ｃｓＦ和Ｂ７一ｌ基因的重组腺病毒载体（ＢＢ．１０２）转染ＢＥＬ－７４０２、印卫和ＨｕＨ．７肝癌细胞后，细胞生长明显受到抑制，同时还能诱导肝癌细胞的凋亡。但腺病毒不能在细胞内持久表达，并能引起宿主强烈的免疫反应，且可使宿主器官严重损害而危及生命，使其重复使用受到限制。１。逆转录病毒只感染处于复制、分裂期的细胞，特别是生长旺盛的癌细胞，在很大程度上避免了对正常组织的损伤，且可持久表达，无需反复
应用：腺相关病毒载体无致病性，有比较广泛的宿主范围，能感染不分裂的ｓ期细胞，并能整合到宿主ＤＮＡ的特异部位中，应用前景较为乐观。１。但目前所使用的病毒载体系统尚不同时具备低毒性、高效率、大容量、可控基因的转录及表达等特点，还需进一步加强对病毒载体的研究。
（二）非病毒载体系统
非病毒载体主要包括脂质体、ＤＮＡ聚合体、阳离子多聚物型载体等。以阳离子脂质体（１ｉｐｏｓｏｍｅ）最常用，携带目的基因的脂质体与细胞结合后，经细胞的吞饮进入细胞。相对于病毒载体而言，脂质体具免疫原性弱，制备方便，比较安全的优点，但转染性低，缺乏特异性，目的基因不易整合到染色体中，只呈一过｜生表达。纳米粒载体是一种新型的非病毒载体，因易被单核巨噬细胞摄取而主要分布于肝脏，具有一定的肝靶向性。且纳米粒无细胞毒Ｉ生，而脂质体则在５０％细胞中有毒性产生。研究显示，纳米粒载体较其他阳离子载体介导的基因转染效率显著提高，且转染的目的基因能持久稳定的表达。如分别载有ＧＦＰ基因及ＧＦＰ表达质粒ｐＥＢＶＧＦＰ的聚酰胺一胺型树枝状高聚物（Ｐ６ＭＡＭ－Ｄ），在白血病细胞Ｋ５６２中转染效率均达９８％，且ＧＦＰ可持续表达ｌＯ周”１。可见，纳米粒基因载体是一种无毒、高效、能稳定转染的非病毒载体，有望为肝癌基因治疗的研究带来新的突破。
除了以上利用各种载体进行基因导入的方法之外，基因的传递也可以不借助任何工具而直接进行，称其为直接方法。例如将未经任何包裹的裸ＤＮＡ质粒直接注射到目标组织中去。在肿瘤组织中注射细胞因子和肿瘤抑制因子的裸ＤＮＡ，可以引发抗肿瘤免疫反应，称之为肿瘤疫苗。
二．肝癌靶向可控性表达系统的选择
使用靶细胞特异性表达载体，可使治疗基因选择陛表达在肝癌细胞内，可减少正常肝脏的毒性损害。目前报道较多的是选用肝癌特异性调控元件来驱动目的基因在肝癌细胞中的表达，主要包括甲胎蛋白启动子、白蛋白启动子、胰岛素样生长因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）基因启动子等。’，因白蛋白和ＩＧＦＩＩ并不只是在肝中表达，目前主要使用ＡＦＰ启动子，用ＡＦＰ启动子启动目的基因的表达，可以使基因表达基本上限定在Ｈｃｃ细胞内，避免了正常肝细胞的损伤。但ＡＦＰ启动子启动能力低且ＡＦＰ仅在５０％的ＨｃＣ中表达，使ＡＦＰ启动子的基因治疗效果大为降低嘲。近年，受体介导的细胞内吞和抗体依赖的基因转导系统可使目的基因在靶细胞内高效表达，取得较好的抗肿瘤效应。顾建人院士ｍ等曾设计了一种新型的非病毒基因导入系统，包括识别细胞表面受体（ＩＧＦＲ）的，配体寡
肽（ＬＯＰ），连接外源性ＤＮＡ的多聚阳离子多肽（ＰｃＰ）以及可避免内吞小体被溶酶体降解的内吞小体释放寡肽（ＥＲＯＰ），可将目的基因靶向性转移进入肝癌细胞内，体内外实验都取得较好的实验结果。
三．肝癌基因治疗中治疗方式的选择
（一）抑癌基因疗法肿瘤发生的一个重要机制就是抑癌基因的失活和（或）癌基因的活化。ｐ５３基因是一种抑癌基因，参与细胞增殖的调控。包括肝癌在内的大约５０％的人类肿瘤丢失了有功能的ｐ５３蛋白…。在肿瘤细胞内导入野生型ｐ５３可以抑制肿瘤的生长，体内外实验均可诱导肿瘤细胞凋亡…”。其他的抑癌基因有Ｂｃｌ＿ｘｓ、ｐ１６基因等。
（二）自杀基因疗法由于肿瘤细胞转染有病毒的相关酶基因，可将无毒或低毒的药物前体转变为致死性的毒性药物，从而发挥特异性的杀伤肿瘤细胞作用。胸苷激酶／更昔洛韦（ＴＫ／ＧＣＶ）和胞嘧啶脱氨酶／５一氟胞嘧啶（ＣＤ／５．ＦＣ）是研究的最广泛的激活系统。其显著特点是“旁观者效应”。Ｈｕａｎｇｘ““等人构建的表达ＣＤ的复制缺陷型腺病毒载体体外转染ＨｅｐＧ２和ｓＭＭＣ７７２１两种肝癌细胞，并用５一Ｆｃ处理。发现病毒载体在转染效率不足２０％时即可产生有效的肿瘤细胞生长抑制。
（三）免疫基因疗法肿瘤的产生是由于宿主的免疫系统，不能识别并清除肿瘤细胞。这种抗肿瘤免疫缺陷可部分归因于肿瘤细胞缺乏主要组织相容性复合体（ＭＨｃ）分子的表达。给组织中转染在免疫系统中发挥重要调节作用的细胞因子基因，可克服机体对肿瘤抗原的免疫耐受。Ｃａｏ“”等将ｎ师．ａ基因构建在白蛋白基因启动子驱动下，以逆转录病毒载体介导，显示可使肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性消失，并显著延长荷瘤鼠的生存期。其他细胞因子基因如ＩＬ－２、４、６、１２，１ＮＦ—Ｑ，ⅡＮ—Ｙ，ＧＭ．ＣＳＦ等用于肝癌治疗均可收到不同程度的效果。
（四）耐药基因疗法肝癌的基因化疗常伴有不同程度的骨髓抑制，是制约化疗效果的重要因素。将耐药基因包括多耐药基因唧．１）等导入造血干细胞，增强机体对化疗药
物引起骨髓抑制的抵抗力，从而可加大化疗药物的用量，使更多药物进入靶肿瘤区，间接的提高了疗效。
（五）抗血管生成疗法肝癌是典型的富血供肿瘤，肿瘤血管生长在肝癌增殖、侵袭和转移中都起重要作用。血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）促进肿瘤血管生长，使用ｖＥＧＦ反义ｃＤＮＡ阻断其促血管生成作用，可观察到肝癌生长受抑。…。
（六）联合基因治疗研究发现，将免疫基因、抑癌基因、反义基因、自杀基因等联合应用，能发挥更有效的抗肿瘤效应，是目前肿瘤基因治疗的研究趋势。Ｄｍｚｄｚ泌…１
．婴主堂堡堡兰．一一一———————————————————』坚Ｌ—一等将ＩＬ．１２基因与ＨＳｖ．ＴＫ基因联合应用治疗鼠肝癌模型的作用，疗效明显优于单独应用ＩＬ．１２基因或Ｈｓｖ－ＴＫ基因。亦有人发现双抑癌基因的联合，如新发现的肿瘤抑制基因ＰＴＥＮ和ｐ５３基因的联合，会在肝癌细胞信号转导的不同途径发挥作用，其疗效优于使用单一抑癌基因。
（七）反义基因疗法反义基因的应用包括反义ＲＮＡ，反义ＤＮＡ，ｒｉｂ０巧ｍｅ三大技术，是根据碱基互补原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因的表达，从而达到基因治疗的目的。将反义胰岛素样生长因子（ＩＧＦ－ＩＩ）基因直接注入荷瘤裸鼠，可显著抑制ＩＧＦ．１Ｉ的过量表达，并使瘤体缩小““。核酶是一类具有生物催化活性的ＲＮＡ分子．与反义ＲＮＡ相比，它具有空间结构稳定、可反复使用、催化效率高、无免疫原性等特点。近年来，一种新的反义技术即ＲＮＡ干涉技术（ＲＮＡｉｎｌｅ跪ｒｅｎｃｅ删Ａ）就是利用外源或内源性的双链ＩⅢＡ（ｄｏｕｂｌｅｓ昀ｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）在ＲＮＡ水平诱导序列特异性的转录后基因沉默００Ｓｔｔｍｎｓｃｒｉ加ｏｒｌａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃ’ｍｇ，ＰＴＧｓ），从而关闭特定基因功能，它为基因功能研究提供了一个快速、简便和有效的方法，亦成为肿瘤基因治疗研究的热点，可能是一种最有希望的基因治疗方法。
肝癌基因治疗的研究已取得了令人鼓舞的效果。然而，目前所进行的工作均是探索性的，大多处于实验阶段，仍有许多问题有待于改进和提高，目前肝癌基因治疗存在的问题主要是：（１）没有十分理想的治疗基因，不同个体发生肿瘤免疫逃避的机制可能不同，而目前还没有一个公认的与肝癌的发生发展密切相关的基因。（２）没有一个十分理想的靶向治疗载体，导入的目的基因难以控制，肝癌细胞的靶向性不强。已有研究证明，ＨＢＶ启动子具有肝特异表达的特性，ｓａｎｄｉ扩１等用含有ｕ）Ｌ受体基因的重组腺病毒分别在哪Ｖｃ启动子、ｃ启动子和ＥＮＩ、ＨＢｖ－ＣＭＶ杂合启动子转录控制下表达，与ｃＭｖＩＥ启动子驱动的表达相比，前三者有较高水平ＬＤＬ受体基因表达，且有肝细胞特异性。为此我们利用ＨＢｖ病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子和增强子作为肝特异表达调控元件，以端粒酶的反义基因或凋亡蛋白（ａｐｏｐ垃ｎ）、抑瘤素（ｏｎｃｏＳＩａｔｈｌＭ，ｏｓｍ）或黑色素瘤分化相关基Ｉ习（ｍｅｌａｌｌｏ衄ｄｉ髓ｒｅｒｎｉａ廿叫ａｓｓｏｃｉａｃｃｄｇｅｎｅ，ｍｄａ．７／ＩＬ．２４）作为治疗基因进行肝癌的靶向性治疗。
四．ＨＢＶ启动予作为肝癌基因治疗的特异性调控子的可行性
分子生物学研究表明ＨＢＶ基因组仅有３．２ｋｂ，结构紧密，所有调控序列均位于蛋白编码区，是研究真核基因表达调控的理想模型。ＨＢＶ３．５ｋｂ、２．４ｋｂ、２．１ｋｂ和Ｏ，９ｋｂ的ＲＮＡ
堡主堂堡丝苎————————————————旦曼—一转录物的起始点附近各有一个启动子，分别为ｃｐ、ｓＰＩ、ｓＰＩＩ和ｘ启动子。其长度为１００－３００ｂＤ，其中有一些保守序列，如ＳＰＩ启动子有类似ＴＡＴＡ框的序列，Ｃ启动子有类似Ａ１’Ａ框的序列等。但总体上，嗜肝病毒启动子和保守序列与已知启动子元件的共有序列同源性较低，说明ＨＢｖ的启动子元件可能是一类独特的启动子序列“…。
ＨＢｖ的２个增强子分别为１０７４～１２４４位核苷酸的ＥＮＩ和１６２７－１７７４位的ＥＮ儿。ＥＮＩ在ｓ基因和ｘ基因之间，与ｘ基因启动子重叠，可增强Ｃ、ｓＰＩ、ｓＰＩＩ和ｘ启动子的转录，但效率不同，如对下游的Ｃ启动子比对Ｘ启动子的增强作用高６０倍。与ＥＮＩ结合的转录因子有非肝细胞特异性的ＮＦ．１、ＡＰ．１、ＮＦ—ＫＢ和ＥＦＣ、ＲＦ－ｘ，以及肝细胞特异性的Ｃ／ＥＢＰ、心Ｆ．４和ＨＢｌ一“。ＥＮＩ对Ｃ启动予的作用不是直接的，而是通过与ＥＮＩＩ协同作用，ＥＮＩＩ可分为ＥＮＩＩ．Ａ和ＥＮＩＩ—Ｂ。前者是正调节元件，与ＥＮＩＩ的肝细胞特异性有关，必须与后者协同作用才有活性。后者是ＥＮＩＩ的基本单位，有６０％～７０％的ＥＮｌＩ活性，又可分为Ｂ１、Ｂ２和Ｂ３等３个亚区，前两部分是主要功能区，Ｂ２是主要转录因子的结合位点“…。ＥＮＩＩ有可与相应的蛋白因子Ｃ／ＥＢＰ和ＨＮＦ－４结合的位点。ＨＮＦ３能结合Ｂ２亚区并激活ＥＮＩＩ的活性，在ＥＮＩＩ的肝细胞特异性中起重要作用“…。Ｂ１亚区也结合有肝细胞特异的因子，只存在于ＨｅｐＧ２细胞中，而不存在于ｃｃＬｌ３细胞和ＨｅＬａ细胞中。ＥＮＩｌ对于分化的肝细胞和肝癌细胞有显著的特异性，可增强Ｃ、ＳＰＩ、ｓＰＩＩ和Ｘ启动子的转录。
肝细胞增强子ＥＮＩ和ＥＮＩＩ所表现出的高度肝细胞专—性依赖于肝细胞核转录调控因子的作用，其对ＨＢＶ在肝细胞中的特异表达有相当重要的贡献，并在一定程度上决定了ＨＢＶ的嗜肝性，因此，以｝ｍＶ病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子、增强子为表达调控元件构建肝细胞特异表达载体，可以达到靶基因只在肝细胞中特异表达，而在其他的体细胞中不表达的目的，解决了肝癌基因治疗中载体的特异表达难题。
五．端粒酶的反义基因、ａｐｏｐ血、０ｓＭ、ｍｄａ－７／ＩＬ．２４作为治疗基因进行肝癌的靶向性治疗的可行性
人类端粒是位于染色体末端的重复ＤＮＡ序列（ｒｒＡｏＧＧ），具有维持染色体稳定的重要作用，端粒长短变化和稳定与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白ＤＮＡ聚合酶，它能以自身的鼢ｎ作为模板合成端粒弥补端粒丢失，对维持端粒长度，使细胞获得永生化起重要作用。许多研究表明９０％以上的肿瘤细胞和永生化的细胞具有高度的端粒酶活陛，而正常人体细胞中不表达或｛氐表达端粒酶４”。人端粒酶的主要成分有人端粒酶鼢舱０１岫ａｎｔｅｌｏｍｅｍＳｅ耻ＪＡ’ｈＴＲ）、人端粒酶相关蛋白（ｈｕｍａｎ
堡兰差壁堡墨．一一————————————————ｊ兰旦—一ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ。ａＳｓｏｃｉａ刚口ｍｔｅｍｌｌｌＴＰ）、人端粒酶具有逆转录酶活性的催化亚基（ｈ唧ａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｃａｃａｌⅧｃｓｕｂ删ｋｈＴＲＴ）扭１。ｈＴＲ和ｈＴＰ在人端粒酶滑眭阴性的正常组织中广泛表达，”ＲＴ只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达，因此，在肝癌细胞中的端粒酶ｈＴＲＴ反义ＲＮＡ将起到抑制肝癌生长的目的，而在正常肝细胞中由于没有端粒酶的表达，载体表达产生的ｈⅡ玎反义ＲＮＡ没有作用的靶点，不会对正常肝细胞功能产生明显的副作用，避免了对肝脏功能的破坏。
细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）使细胞程序性死亡的一种形式，在肿瘤细胞中细胞凋亡被阻断，使肿瘤细胞具有了无限增殖的能力，因此，重建肿瘤细胞的凋亡程序可能是肿瘤基因治疗的一项有意义的策略。凋亡蛋白（ａｐｏｐ曲）是近年来发现由鸡贫血病毒（ｃＡＶ）ｖｐ３基Ｉ习产生的蛋白质，主要引起鸡淋巴细胞凋亡。”。进一步研究发现，凋亡蛋白具有一种抗肿瘤细胞特异性，即仅仅诱导肿瘤细胞或转化细胞凋亡，而对正常细胞或二倍体细胞不起作用。更让人感兴趣的是，凋亡蛋白诱导的凋亡不依赖功能性Ｐ５３的生成，也不被ＢＡＧ．１、Ｂｃｒ－ａｂｌ的生成所抑制，甚至不受凋亡抑制因子Ｂｃｌ＿２过量产生的影响…１。这些特性预示，凋亡蛋白可被用作一种治疗因子，通过靶向载体导入机体后，就可选择性地将它们诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无影响。
抑瘤素（ｏｎｃｏｓｌａ垃ｎＭ，ｏ锄）是—种２８ＫＤ的细胞因子，它是１９８６年Ｚａｒｌｉｌｌｇ等人用ＰＭＡ刺激组织淋巴瘤系ｕ９３７，在培养的上清中纯化的一种单链多肽”１。０ｓＭ的氨基酸序列与几．６、Ｇ—ＣＳＦ和白血病抑制因子（ＬＩＦ）都有一定的同源性。并且它们的受体都包含相同的蛋白亚基ｇｐｌ３０，因此属于同一个家族（ＩＬ一６细胞因子家族）。其前体由２５２个氨基酸残基组成，Ｎ端有２５个疏水残基的信号肽，Ｃ端有类似的胰蛋白酶位点，能切除３１个氨基酸残基，形成１９６个氨基酸的０ｓＭ，其抑制活性提高５．６０倍嘲。ＯｓＭ的受体分布广泛，主要生物活性为抑制多种肿瘤细胞生长，对正常细胞无影响，在肝特异性调控元件驱动下导入体内，便可选择性的抑制肝癌细胞的生长。
黑色素瘤分化相关基因（ｍｅｌ趾０ｍａｄｉ髓ｒｅｌｌｄ拍ｏｎａｓＳｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅ，ｍｄａ．７）是Ｊｉａｌｌｇ例等人１９９５年用重组人Ⅱ＝Ｎ．８和密执霉素（ＭＥｚ）处理人黑色素瘤细胞（｝｛ｏ．１）后，通过消减杂交鉴别出的一种黑色素瘤分化相关基因，现命名为ＩＬ－２４。ｍｄａ．７，ＩＬ－２４是单拷贝基因，转录单位长约６．３３ｋｂｐ，含有７个外显子和６个内含子，ｃＤＮＡ长１７１８ｎｔ，含一个开放读框，编码一个由２０６个氨基酸组成的多肽，分子量约为２３．８ｋＤ人ｍｄａ．７／ＩＬ．２４基因定位于１ｑ３２．２—１ｑ４１，位于儿．１０家族相关基因簇中，与其它成员ＩＬ．１０、ＩＬ．１９、ＩＬ－２０在１９５ｋｂ的基因组ＤＮＡ上依次排列”１。体内、外实验表明过表达的ｍｄａ．加Ｌ一２４导致多种恶性肿
硕士学位论文刚舌
瘤细胞生长抑制和凋亡，而对正常细胞无相同作用…。
为此，我们利用ＨＢｖ病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子和增强子作为肝特异表达调控元件，构建肝特异表达ｈⅡ盯的反义基因以及ａｐｏｐ血、ＯＳＭ或ＩＬ－２４基因的载体，可以达到靶基因只在肝癌细胞中表达，对肝癌细胞起杀伤作用，而对癌组织以外的正常肝细胞和其他体细胞没有作用的目的，更具有安全性，从而为肝癌的基因治疗探索了一条新路。
鉴于以上分析，我们进行如下研究：（１）克隆不同的ＨＢｖ启动子片段，评价其在肝细胞和非肝细胞中的转录活性。筛选出在肝细胞中特异性表达最强的ＤＮＡ序列组合形式。（２）构建ＨＢＶ启动子调控的外源端粒酶ｈＴＲＴ反义ＲＮＡ、印ｏｐｔｉｔｌ、ＩＬ＿２４和ＯＳＭ基因载体，并检测各种治疗基因在体内外的抑癌效应。
硕十学位论文ＨＢｖ启动予基网克隆及转录活性评价
技术路线和实验方案
分析ＨＢＶ启动子表达调控的序列特点
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真核表达载体
验证由ＨＢＶ启动子构建的重组载体在肝细胞中表达的
高效性及其体内外的的抑癌作用
堡主兰垡鲨塞坚！∑旦垫王蔓里塞堕墨堕墨堕苎塑塑—一第一部分咖Ｖ启动子基因克隆及转录活性评价
基因治疗是指基因直接导入人体用于治疗和预防疾病。基因治疗中的一个关键技术问题就是目的基因表达的靶向性，目前主要有两大策略，一是胞外靶向，一是胞内靶向，但采用特异转录调控序列进行胞内靶向的策Ⅲ各应用得更为普遍。利用组织特异性的基因启动子限制目的基因只在靶细胞中表达是靶向基因治疗的—种有效的治疗途径。本研究旨在构建不同ＨＢｖ启动子调控的荧光素酶表达载体，通过双荧光素报告基因试验比较出其在肝细胞和非肝细胞中的转录活性大小，从而为乙肝、肝癌及其他与肝脏有关的遗传病及代谢陛疾病的靶向基因治疗创造条件。
实验材料
１．主要仪器设备
洁净工作台，北京半导体设备一厂生产；隔水式电热叵温培养箱，国光医疗器械厂生产；ＰＥ２４００ＰｃＲ仪，ＰＥ公司生产；Ｄｕ６４０紫外分光光度计，美国Ｂｅｃｂ蛐公司生产：ＧｅｌＤＯｃ１０００凝胶成相系统；美国ＢｉｏＲａｄ公司生产；Ｍｉｕ＿ＱＢ妣ｅｌ超纯水器，美国ＭｉＩｌ∞ｒｅ公司生产；ｃ０２培养箱，上海Ｈｅｍｅｕｓ公司生产；ｆＢ１２Ｉ柚ｍｉｎｏｍ阳?，Ｂｅ曲ｏｌｄ公司生产。
２．载体和菌株
ｐＧＥＭ—Ｔ、ＫｔｏｒＳｙｓｔｅｍ、ｐＧＬ３系列Ｌｕｃ报告基因载体、ｐＲＬ．ｃＭＶ内参照载体、大肠杆菌ＪＭｌ０９均为Ｐ撇ｇａ公司生产；携带有ｃＭＶ基本启动子ｒｎＣＭＶ的质粒ｐＧｃｌ为本室保存。肿瘤细胞株｝ｋ：ｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２ｌ、ＢＥＬ．７４０２、ＨｅＬａ、８０３、ＭｃＦ７、Ａ３７５、
４４６和永生化的肝细胞Ｌ０２均为本室保存，２．２．１５细胞由王升启博士惠赠。
３．主要试剂
删ＰｈｌｓＳＶＭ．ｍｉｐｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉ矗ｃ舐ｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍ、Ⅵ矗ｚａｒｄＰＣＲＰ印ｓＤＮＡＰ丽丘ｃ舐ｏｎｓｙｓ吼ｌ、荧光素酶检测试剂盒，Ｐｒｏｍｅ静公司生产：ＩＡ－１ｈｑＤＮＡ多聚酶，