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四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究_第三章束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

束生刚毛藻Cladophora fascicularis (Mert.) Kuetzing为刚毛藻目(Cladophorales) 刚毛藻科 (Cladophoraceae) 刚毛藻属(Cladophora) 绿藻门(Chlorophyta)海藻。多生于水边及潮汐能至之地。中国对该种海藻化学成分的研究没有报道。本论文选用采自青岛沿海束生刚毛藻为研究对象，综合运用现代色谱和波谱技术对其化学成分进行了系统的分析和结构鉴定，并对其粗提取物及部分单体化合物进行了初步的生物活性筛选，以期寻找到具有活性的海洋天然产物，不仅具有可行意义，更是对海洋绿藻天然产物研究开发的工作的补充和尝试。

第一节新化合物结构解析

3.1.1 Porphyrinolactone (1) 的结构鉴定

2'4'1016'

化合物1棕红色无定型粉末，TLC紫外观察在254nm下有强烈暗斑，365nm下有红色荧光。FABMS 给出[M+1]+峰m/z 931.3，HRFABMS给出 [M+H]+峰m/z 931.5958(calcd. 931.5943)从而确定分子式为C57H78N4O7。红外光谱(3343, 2955, 1741, 1603 cm-1)和紫外光谱（224，302，400，499，529，612 nm）都显示为卟啉环的特征吸收，表明化合物1为叶绿素类化合物。1H NMR (in CDCl3) 数据显示在低场区有三个独特的单峰质子信号δH 9.55 (s), 9.78 (s)和8.75 (s) 归属为卟啉环上H-5, H-10和 H-20；三个烯甲基信号δH 3.47 (s, H3-21), 3.29 (s, H3-71)和3.94 (s, H3-121)；一个单取代的末端烯双键信号δH 8.02 (dd, J = 11.5, 17.5 Hz, H-31), 6.36 (dd, J = 2.3, 17.5 Hz, H-32a)和6.20 (dd, J = 2.3, 11.5 Hz, H-32b)都和叶绿素a及其相关衍生物相类似[1，2]。13C NMR数据及COSY 谱图也证实了这一点，通过HMQC谱完全归属了与氢谱相应的碳原子13C NMR 数据(表3.1)，HMBC(图3.1)相关经一步确定了取代基的位置。化合物1和132-hydroxyphaeophytin

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a相比，1H 和13C NMR非常相似，差别在E环上共轭酯碳δC 161.4 (s，C-131)和季碳δC 106.3 (s, C-132)取代了原来的酮羰基δC 192.0 (s) 和季碳89.1 (s)的相应位置。和不饱和度相联系，推断132-hydroxyphaeophytin a 中E环的C-131-C-132通过氧原子相连形成六元酯环。另外，氢谱δH 4.36 (2H，q, J = 7.0 Hz, H-1”)和1.60 (3H，t, J = 7.0 Hz, H-2”)，对应碳谱δC 62.4 (t) and 15.6 (q)，通过H-1”和C-132的HMBC相关，表明一个增加的乙氧基信号连在C-132。叶绿基片段通过2D NMR (DQFCOSY, HMQC, 和HMBC)的广泛分析给予归属。根据Nakatani [2]对叶绿素类化合物C-132立体构型的数据分析，确定化合物1 C-132的构型为R型，因为H-17的氢质子在δH 4.82 ppm，而S型的在δH 4.16 ppm。由H-17 和H-181δH 1.62（3H，d，J=7.0 Hz)的NOE相关，确定H-17 (δH 4.82, d) 和H-18 (δH 4.45, q) 反式关系，结合文献数据[2]，表明化合物1和一般的叶绿素一样，D环的立体化学仍为17S和18S。综上所述，化合物1的结构确定并命名为Porphyrinolactone 。1H NMR(500MHz, CDCl

)和13C NMR数据(125MHz, CDCl3)见表3.1。根据Hynninen P. H.

的文献报道[3]，化合物1可能为人工产物，由叶绿素酊经氧化生成，乙氧基被认为用乙醇提取时引入。

24681012

图3.1化合物1的主要HMBC相关

Fig. 3.1 The key HMBC Correlation of Compound 1

3.1.220-Chlor-(132-S)-hydroxyphaeophytin a（2）的结构鉴定

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16'

化合物2深绿色无定型粉末，TLC紫外观察在254nm下有强烈暗斑，365nm下有红色荧光。FABMS 给出[M+1]+峰m/z 921.2，HRFABMS给出 [M+Na]+峰m/z 943.5160(calcd. 943.5110)从而确定分子式为C55H72ClN4O6。和化合物1类似，化合物2的红外光谱(3367, 2955, 1740, 1608cm-1)和紫外光谱（218，300，412，513，544，617, 676 nm）也都显示为卟啉环的特征吸收，表明化合物2同样为叶绿素类化合物。化合物2的高分辨质谱显示含有Cl原子，表明分子中有Cl原子取代；与化合物1的氢谱相比，1H NMR (in CDCl

) 数据在低场区只显示有两个独特的单峰质子信号δH 9.72 (2H, s) 归

属为卟啉环上H-5和H-10；三个烯甲基信号分别在δH 3.64 (s, H3-21), 3.32 (s, H3-71), 和3.78 (s, H3-121)；单取代的末端烯双键信号在δH 8.00 (dd, J = 11.5, 17.5 Hz, H-31), 6.34 (dd, J = 2.3, 17.5 Hz, H-32a)和6.22(dd, J = 2.3, 11.5 Hz, H-32b)；这些信息表明H-20可能被Cl 取代。HMBC（图3.2）相关和COSY谱图进一步证实了这一点，通过HMQC谱完全归属了与氢谱相应的碳原子13C NMR 数据(Table 2.1)。与132-hydroxyphaeophytin a[1]的13C-NMR数据现比，化合物2的酮羰基δ

191.8 (s，C-131) 和季碳89.3 (s, C-132)都存在，

说明E环没有变化，仍为5元酮环。叶绿基片段通过2D NMR (DQFCOSY, HMQC, 和HMBC)的广泛分析给予归属。根据Nakatani [3]的对叶绿素类化合物的数据分析确定C-132的构型为S型，因为H-17的氢质子在δH 4.20 ppm，综上所述化合物2的结构确定并命名为20-Chloro-(132-S)-hydroxy－phaeophytin a。化合物2首次从自然界分离[4]，文中对其波谱数据进行归属。1H NMR(500MHz, CDCl3)和13C NMR数据(125MHz, CDCl3)见表3.1。

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Table 3.1 1H and 13C NMR Data of Compounds 1 and 2 (500/125 MHz, CDCl 3; δ ppm, J Hz)

1 2

No. C H C H C H C H 1 141.3 s 137.9 s 17

53.9 d

4.82 d 7.0

51.8 d

4.20 d 7.5 2 131.6 s 132.2 s 171

32.2 t 1.90 m; 2.62 m

31.6 t 1.92 m; 2.60

21 12.1 q 3.47 s 17.1 q 3.64 s 172 32.5 t 2.21 m; 2.48 m 30.8 t 2.20 m; 2.46 m 3 136.3 s

139.9 s

173 173.2 s 173.5 s

31 129.0 d 8.02 dd 11.5, 17.5

129.5 d 8.00 dd 11.5, 17.5

18 50.0 d 4.45 q 7.0 50.0 d 4.89 q 7.0 32

122.7 t

6.20 dd 2.3, 1

7.5

6.36 dd 2.3, 11.5 125.0 t

6.22 dd 2.3, 1

7.5

6.34 dd 2.3, 11.5 181

22.6 q

1.62 d 7.0

19.7 q

1.50 d 7.0

135.1 s

133.7 s

19 171.8 s 171.2 s 5 99.5 s 9.55 s 99.9 d 9.72 s 20 94.0 d 8.75 s 106.4s

6 156.0 s 154.1 s 1’ 61.3 t 4.43 d 7.0 61.6 t 4.62 d 7.0

7 136.1 s

137.3 s

2’ 117.8 d 5.16 t 7.0 117.8 d 5.26 t 7.0 71 11.3 q 3.29 s 11.3 q 3.32 s 3’ 142.6 s 142.8 s

8 145.5 s

144.9 s

4’ 39.8 t 1.90 m 39.8 t 1.88 m

81 19.6 t 3.76 q 7.0 19.5 t 3.77 q 7.0

5’ 24.8 t

1.60 m; 1.72 m

24.8 t 1.62 m; 1.70 m

82 17.6 q 1.73 t 7.0 17.4 q 1.74 t 7.0 6’ 36.6 t 1.00 m; 1.20 m

36.6 t

1.00 m; 1.20 m

9 150.0 s

152.1 s 7’ 32.6 d 1.30 m 32.6 d 1.32 m

10 104.1 d 9.78 s 103.8 d 9.72 s 8’ 37.4 t 1.03 m; 1.26 m

37.3 t

1.03 m; 1.26 m

11 139.1 s 139.5 s 9’ 24.8 1.28 m 25.0 t 1.28 m 12 131.4 s

131.0 s 10’ 36.7 t 1.26 m 37.3 t 1.26 m

121 12.5 q 3.94 s 12.4 q 3.78 s 11’ 32.6 d 1.30 m 32.8 d

1.30 m; 1.26 m

112.2 s

128.1 s 12’ 37.3 t 1.03 m; 1.26

m 37.2 t 1.03 m; 1.26 m 131 161.4 s 191.8 s 13’

24.4 t 1.60 m 24.4 t 1.60 m 132

106.3 s 89.3 s 14’ 39.4 t 1.15 m 39.3 t 1.15 m 133

169.1 s 172.8 s

15’ 28.0 d 1.51 m 27.9 d 1.50 m 134

53.14 q 3.60 s 53.5 q 3.67 s 16’ 22.7 q 0.87 d 6.8 22.7 q 0.87 d 6.8 14 136.3 s 149.0 s 14 17’ 22.6 q 0.87 d 6.8 22.6 q 0.87 d 6.8 15 101.5 s 108.3 s 15 18’ 16.2 q 1.56 s 16.3 q 1.66 s 16 167.8 s 162.9 s 16 19’ 19.6 q 0.76 d 6.5 19.6 q 0.84 d 6.5 20’ 19.7 q 0.82 d 6.5 19.7 q 0.83 d 6.5 1’’ 62.4 t 4.36 q 7.0

2’’

15.6

1.60 t 7.0

24'

图3.2 化合物2的主要HMBC 相关

表３．１　化合物１和２的１Ｈ　和１３Ｃ　ＮＭＲ数据（５００／１２５　ＭＨｚ，　ＣＤＣｌ３；δ　ｐｐｍ，Ｊ　Ｈｚ）　

Fig. 3.2 The key HMBC Correlation of Compound 2

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第二节实验部分

3.2.1 植物来源与鉴定

束生刚毛藻Cladophora fascicularis (Mert.) Kütz为刚毛藻目(Cladophorales) 刚毛藻科 (Cladophoraceae) 刚毛藻属(Cladophora) 绿藻，研究用的束生刚毛藻于2003年11月采自青岛沿海富营养化水域（见第二章图2.1, 2.2），由中国科学院海洋研究所陆保仁教授鉴定为束生刚毛藻Cladophora fascicularis。

3.2.2仪器与药品、试剂

熔点： XT4A型显微熔点测定仪，温度未校正；

旋光仪：PERKIN-ELMER 243B polarimeter旋光仪；

红外光谱：Nicolet Nexus 470 FT-IR型红外光谱仪，KBr压片；

紫外光谱：棱光 756MC UV-Vis 型光谱仪

核磁共振：Bruker-500MHz-FT-NMR和Varian INOV A 500 MHz型核磁共振仪，

质谱：美国ABI公司QSTAR液质联用仪测定ESIMS；

TRACE GC-MS质谱仪测定EI-MS；

英国VG-ZAB-HS高分辨反置双聚焦磁质谱仪测定FABMS；

Bruker Daltonics. Inc. APEX II. FT-ICRMS质谱仪测定HRFABMS， Bruker

Daltonics. Inc. APEX II. FT-ICRMS质谱仪测定HREIMS；

ACCUTOFCSJMS-T100CS spectrometer测定HRESIMS

高效液相：Alltech ODS C-18，10×250mm，5μm，UV检测；

薄层层析：硅胶HF254,GF254，青岛海洋化工厂；

显色剂：10%硫酸乙醇溶液，茴香醛，碘蒸气；

柱层析：硅胶（160－200，200－300目），硅胶H，青岛海洋化工厂； Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品；ODS为德国Merck公司生产；

冷冻干燥：LGJ0.5-II冷冻干燥机（军事医学科学院实验仪器厂）；

离心机为 Becmann公司产品；

常规试剂：甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、正丁醇均为北京化工厂分析纯试剂。

2.2.3 提取分离流程

2.2.

3.1 提取

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束生刚毛藻采集后，用干净的海水洗净，剔除杂藻，在阴凉处晾干，称重约6.3kg，用50 L90%乙醇室温冷浸提取3次，每次72小时，提取液浓缩。海藻残渣用85%乙醇热提3次，每次2小时。提取液浓缩后与冷提部分合并，并用无水甲醇除盐后，得到深绿色总提物400 g。将总提物悬浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部分40g，乙酸乙酯部分40g，正丁醇部分20g 和水部分297g。具体步骤见提取流程图(图3.3 )。

束生刚毛藻干重（6.3kg)

石油醚部分(43g)乙酸乙酯部分

(40g)

正丁醇部分

(20g)

水部分

(297g)减压浓缩，

图3.3束生刚毛藻提取流程图

Fig. 3.3 The Extraction from Cladophora fascicularis

2.2.

3.2 分离

根据石油醚和乙酸乙酯部分的TLC、紫外和1H NMR谱比较，乙酸乙酯部分TLC没有明确的斑点，其氢谱信号主要在δH1.28，表现为长链烷烃信号；石油醚部分为深绿色提取物，TLC展开，有一系列斑点，紫外观察在365nm下有红色荧光，同时为254nm 下暗斑，可见光下和10％硫酸显色剂显色都观察到绿色斑点，初步判断可能为色素成分，考虑到样品为绿藻，叶绿素成分较大，从而确定对石油醚部分进行分离，用硅胶粗分段，用石油醚：丙酮=50：1到1：1极性依次增强的溶剂系统，梯度洗脱，根据TLC 表现，分为10个部分。

其中第1部分为淡黄色油状物，TLC表现及粗样1H NMR显示成分以脂肪酸和甘油酯为主，未对其进行分离。第2，3部分用硅胶和凝胶Sephadxe LH-20反复柱层析，并用HPLC纯化后，主要得到甾体化合物13、16、17、18、19、20和环阿尔廷三萜类

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化合物7、8、10。第4-6部分为深绿色，TLC 紫外表现为254nm 暗斑，365nm 显红色荧光，可见光可和10％硫酸显色剂显色都观察到绿色斑点。该部分极性段位于石油醚-丙酮系统15:1到8:1之间，极性偏低，纯化难度较大。对该部分的分离以硅胶和凝胶结合使用效果较好，根据实验报道，凝胶Sephadxe LH-20用甲醇-水系统做流动相，对叶绿素成分有吸附和富集作用，因此选用80%甲醇-水作为洗脱溶剂，先把叶绿素成分吸附在凝胶上，再用氯仿将其冲洗下来，用制备薄层和硅胶柱层析结合，反复纯化，分离效果较好；但因叶绿素化合物分子量较大，没有足够的量作谱，很难确定结构，所以最后分离并鉴定6个叶绿素化合物：1、2、3、4、5、6。分离得到叶绿素类化合物的同时，从该部分还得到环阿尔廷三萜类化合物9、11、12，环阿尔廷三萜类化合物成点性比较好，硅胶柱使用石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯体系，结合该类化合物容易结晶的特点，借助重结晶技术，进一步纯化。HPLC 使用甲醇/水体系，流速为1.5 mL/min ，检测波长为210nm 。具体分离流程见图3.4。

(6.0mg)(4.0mg)

(28mg)(20mg) (18.5g)(15.0mg)(20.0mg)3(160.0mg)(80.0mg)

图3.4 束生刚毛藻的分离流程

Fig. 3.4 The Isolation from Cladophora fascicularis

3.2.4 化合物的理化和波谱数据

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241016'

16'2** 20-Chlor-(132-S)-hydroxyphaeophytin a

1* Porphyrinolactone

3 (132- R)-hydroxyphaeophytin b

4 (132- S)-hydroxyphaeophytin b

16'

5 (132- R)-hydroxyphaeophytin a

6 (13

2- S)-hydroxyphaeophytin a

2'461012'14'

16'

21416'

8 cycloart-25(26)-en-3β, 24-diol

7 24-hydroperoxycycloart-25(26)-en-3β-ol

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9 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol

10 cycloart-23-en-3β, 25-diol

11 cycloart-23, 25(26)-dien-3β- ol

12 cycloart-24-en-3β- ol

13 24-hydroperoxy-24-vinylcholesterol

14 saringosterol

15 24,28-epoxy-24-ethylcholesterol 16 isofucosterol

17 β-sitosterol

18 stigmasterol

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19 3β-Hydroxystigmast- 5-en-7-one20 β-Hydroxyergosta-5,24(28)-dien-7-one21 4-hydroxybenzaldehyde

图 1 从束生刚毛藻中所分离鉴定的化合物结构 (*为新化合物,**为新天然产物)

Fig. 1 the Compounds from Cladophora fascicularis (new compounds marked *, new natural compounds

marked **)

化合物1 Porphyrinolactone

棕红色固体分子组成C57H78N4O7； IR (KBr) νmax 3343, 2955, 2925, 2855, 1741, 1603, 1460, 1378, 1250, 1162, 1086 cm-1； UV (MeOH) λmax 224, 302, 400, 499, 529, 612, 668 nm; FABMS m/z 931 [M+1]+； HRFABMS m/z 931.5958 (calcd for C57H79N4O7, 931.5943)；1H NMR（500MHz, CDCl3）和13C NMR数据(125MHz, CDCl3)见表3.1。

化合物2 20-Chloro-(132-S)-hydroxyphaeophytin a

深绿色固体分子组成C55H73ClN4O6；IR (KBr) νmax 3367, 2955, 2923, 2852, 1740, 1715, 1608, 1461, 1223, 1159, 1107 cm-1； UV (MeOH) λmax 218, 300, 412, 513, 544, 617, 676 nm; FABMS m/z 921 [M + 1]+； HRFABMS m/z 943.5160 (calcd for C55H73ClN4O6Na, 943.5110)；1H NMR（500MHz, CDCl3）和13C NMR数据(125MHz, CDCl3) 见表3.1。化合物3 (132- R)-hydroxyphaeophytin b

黑色固体分子组成C55H72N4O7；IR ( KBr) νmax cm-1 3402，2954，2922, 2852，1740，1714，1540，1462，1379，1163；UV (MeOH) λmax 221，435，526，270，381，492，580；FABMS m/z 900.0 [M]+, HRFABMS m/z 923.5393[M+Na]+（calcd.for C55H72N4O7Na）；1H NMR (500MHz, CDCl3) δH 11.14 (1H, s, H-71), 10.41(1H, s, H-5)，9.68(1H, s, H-10)，8.61 (1H, s, H-20)，8.03 (1H, dd, J=11.5,17.5Hz, H-31)，6.40 (1H, dd, J=2.5,17.5Hz, H-32a)，6.26 (1H, dd, J=2.5, 11.5Hz, H-32b)，5.39 (s, 132-OH), 5.20 (1H, t, J=7.0Hz, H-2’), 4.70 (1H, d, J=7.0Hz, H-17), 4.50 (1H, q, J=7.0Hz, H-18), 4.06 (2H, q, J=7.0Hz, H-81), 3.70 (3H, s, H-134), 3.67 (3H, s, H-121), 3.40 (3H, s, H-21), 1.82 (3H, t, J=7.0Hz, H-82), 1.72 (3H, d, J=7.0Hz, H-181), 1.61 (3H, s, H-18’), 0.84 (6H, d, J=6.0Hz, H-16’, 17’), 0.83 (6H, d, J=6.0Hz, H-19’, 20’) 0.83 (6H, d, J=6.0Hz, H-19’,20’) ; 13C NMR

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

(125MHz, CDCl3) δC 143.8 (s, C-1), 132.4 (s, C-2), 12.3 (q, C-21), 138.1 (s, C-3), 128.7(d, C-31), 123.9 (t, C-32), 137.2 (s, C-4), 102.1 (s, C-5), 151.3 (s, C-6), 133.1 (s, C-7), 187.9 (s, C-71), 159.6 (s, C-8), 19.3 (t, C-81), 19.6 (q, C-82), 147.2 (s, C-9), 106.8 (s, C-10), 137.8 (s, C-11), 133.1 (s, C-12), 12.6 (q, C-121), 127.2 (s, C-13), 192.2 (s, C-131), 89.1 (s, C-132), 173.3 (s, C-133), 54.1 (q, C-134), 151.2 (s, C-14), 107.5 (s, C-15), 164.9 (s, C-16), 50.5 (d, C-17), 30.2 (t, C-171), 30.4 (t, C-172), 173.0 (s, C-173), 50.9 (d, C-18), 22.8 (q, C-181), 174.8 (s, C-19), 93.9 (s, C-20), 61.6 (t, C-1’), 117.8 (d, C-2’), 143.2 (s, C-3’), 39.9 (t, C-4’), 24.8 (t, C-5’), 36.6 (t, C-6’), 32.6 (d, C-7’), 37.4 (t, C-8’), 25.1 (t, C-9’), 37.3 (t, C-10’), 32.8 (d, C-11’), 37.3 (t, C-12’), 24.4 (t, C-13’), 39.4 (t, C-14’), 28.0 (d, C-15’), 22.7 (t, C-16’,17’), 16.3 (q, C-18’), 19.6 (q, C-19’), 19.7 (q, C-20’) 1H NMR数据与文献对照完全一致[5, 6]，对文献中的13C NMR 数据进行补充。

化合物4 (132- S)-hydroxyphaeophytin b

黑色固体分子组成C55H72N4O7；IR ( KBr) νmax cm-13423, 2955, 2924, 2854, 1717, 1640, 1462, 1378, 1166; UV (MeOH) λmax226, ,369, 435, 523, 348, 382, 491, 580; FABMS m/z 901.9 [M+1]+, HRFABMS m/z 923.5292[M+Na]+ (calcd.for C55H72N4O7Na); 1H NMR (500MHz, CDCl3) δH 11.16 (1H, s, H-71), 10.46(1H, s, H-5)，9.74(1H, s, H-10)，8.64(1H, s, H-20)，8.04(1H, dd, J=11.5,17.5Hz, H-31)，6.41(1H, dd, J=2.5,17.5Hz, H-32a)，6.26(1H, dd, J=2.5, 11.5Hz, H-32b)，5.64(s, 132-OH), 5.26 (1H, t, J=7.0Hz, H-2’), 4.18 (1H, d, J=7.0Hz, H-17), 4.50 (1H, q, J=7.0Hz, H-18), 4.08 (2H, q, J=7.0Hz, H-81), 3.66 (3H, s, H-134), 3.76 (3H, s, H-121), 3.43 (3H, s, H-21), 1.86 (3H, t, J=7.0Hz, H-82), 1.62 (3H, d, J=7.0Hz, H-181), 1.66 (3H, s, H-18’), 0.87 (6H, d, J=6.0Hz, H-16’, 17’), 0.83 (3H, d, J=6.0Hz, H-19’ ) 0.81 (3H, d, J=6.0Hz, H-20’) ; 13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 143.6 (s, C-1), 132.1 (s, C-2), 12.1 (q, C-21), 137.9 (s, C-3), 128.6(d, C-31), 123.7 (t, C-32), 136.9 (s, C-4), 102.2 (s, C-5), 151.0 (s, C-6), 133.1 (s, C-7), 187.7 (s, C-71), 159.3 (s, C-8), 19.1 (t, C-81), 19.7 (q, C-82), 147.2 (s, C-9), 106.7 (s, C-10), 138.0 (s, C-11), 132.7 (s, C-12), 12.4 (q, C-121), 127.8 (s, C-13), 192.0 (s, C-131), 88.8 (s, C-132), 172.5 (s, C-133), 53.5 (q, C-134), 150.8 (s, C-14), 107.5 (s, C-15), 165.3 (s, C-16), 52.1 (d, C-17), 31.2 (t, C-171), 31.7 (t, C-172), 174.2 (s, C-173), 50.4 (d, C-18), 22.7 (q, C-181), 173.5 (s, C-19), 93.9 (s, C-20), 61.7 (t, C-1’), 117.9 (d, C-2’), 143.6 (s, C-3’), 39.9 (t, C-4’), 24.8 (t, C-5’), 36.7 (t, C-6’), 32.6 (d, C-7’), 37.4 (t, C-8’), 25.0 (t, C-9’), 37.3 (t, C-10’), 32.8 (d, C-11’), 37.3 (t, C-12’), 24.4 (t, C-13’), 39.2 (t, C-14’), 28.0 (d, C-15’),

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

22.6 (t, C-16’,17’), 16.4 (q, C-18’), 19.4 (q, C-19’), 19.7 (q, C-20’) 1H NMR数据与文献对照完全一致[5, 6]，对文献中的13C NMR 数据进行补充。

化合物5 (132- R)-hydroxyphaeophytin a

深绿色固体分子组成C55H74N4O6；IR ( KBr) νmax cm-1 3387, 2955, 2922, 2853, 1739, 1710, 1461, 1377, 1163; UV (MeOH) λmax220, 410, 504, 534, 299，478, 521; FABMS m/z 887.8[M+1]+; 1H NMR (500MHz, CDCl3) δH 9.58(1H, s, H-10)，9.43 (1H, s, H-5)，8.66 (1H, s, H-20)，7.98 (1H, dd, J=11.5,17.5Hz, H-31)，6.31 (1H, dd, J=2.5,17.5Hz, H-32a)，6.20 (1H, dd, J=2.5, 11.5Hz, H-32b)，5.39(s, 132-OH), 5.21 (1H, t, J=7.0Hz, H-2’), 4.73 (1H, d, J=7.0Hz, H-17), 4.52 (1H, q, J=7.0Hz, H-18), 3.69 (2H, q, J=7.5Hz, H-81), 3.69 (3H, s, H-134), 3.74 (3H, s, H-121), 3.44 (3H, s, H-21), 3.22 (3H, s, H-71), 1.70 (3H, t, J=7.5Hz, H-82), 1.72 (3H, d, J=7.0Hz, H-181), 1.60 (3H, s, H-18’), 0.88 (6H, d, J=6.5Hz, H-16’, 17’), 0.86 (3H, d, J=6.0Hz, H-19’), 0.82 (3H, d, J=6.5Hz, H-20’); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 142.3 (s, C-1), 132.1 (s, C-2), 12.3 (q, C-21), 136.6 (s, C-3), 129.2 (d, C-31), 123.1 (t, C-32), 136.4 (s, C-4), 98.0 (s, C-5), 155.8 (s, C-6), 136.6 (s, C-7), 11.4 (s, C-71), 145.4 (s, C-8), 19.6 (t, C-81), 17.6 (q, C-82), 151.1 (s, C-9), 104.4 (s, C-10), 137.9 (s, C-11), 130.0 (s, C-12), 12.5 (q, C-121), 126.4 (s, C-13), 192.2 (s, C-131), 89.2 (s, C-132), 173.6 (s, C-133), 54.0 (q, C-134), 150.4 (s, C-14), 107.8 (s, C-15), 162.1 (s, C-16), 50.3 (d, C-17), 30.4 (t, C-171), 31.4 (t, C-172), 173.0 (s, C-173), 50.9 (d, C-18), 22.8 (q, C-181), 173.2 (s, C-19), 93.7 (s, C-20), 61.5 (t, C-1’), 117.8 (d, C-2’), 143.1 (s, C-3’), 39.9 (t, C-4’), 24.9 (t, C-5’), 36.8 (t, C-6’), 32.8 (d, C-7’), 37.5 (t, C-8’), 25.1 (t, C-9’), 37.5 (t, C-10’), 32.9 (d, C-11’), 37.4 (t, C-12’), 24.6 (t, C-13’), 39.5 (t, C-14’), 28.1 (d, C-15’), 22.9 (t, C-16’,17’), 16.4 (q, C-18’), 19.8 (q, C-19’), 19.9 (q, C-20’) 1H NMR数据与文献对照完全一致[5, 6]，对文献中的13C NMR 数据进行补充。

化合物6 (132- S)-hydroxyphaeophytin a

深绿色固体分子组成C55H74N4O7；IR ( KBr) νmax cm-1 3394, 2955, 2924, 2853, 1739, 1710, 1461, 1164; UV (MeOH) λmax219, ,300, 409.5, 505, 472, 550; FABMS m/z 901.9 [M+1]+, HRFABMS m/z 923.5292[M+Na]+ (calcd.for C55H72N4O7Na); 1H NMR (500MHz, CDCl3) δH 9.66(1H, s, H-10)，9.51(1H, s, H-5)，8.70 (1H, s, H-20)，8.04 (1H, dd, J=11.5,17.5Hz, H-31)，6.32 (1H, dd, J=2.5,17.5Hz, H-32a)，6.21(1H, dd, J=2.5, 11.5Hz, H-32b)，5.57 (s, 132-OH), 5.23 (1H, t, J=7.0Hz, H-2’), 4.19 (1H, d, J=7.0Hz, H-17), 4.51 (1H,

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

q, J=7.0Hz, H-18), 3.75 (2H, q, J=7.5Hz, H-81), 3.59 (3H, s, H-134), 3.76 (3H, s, H-121), 3.45 (3H, s, H-21), 3.27 (3H, s, H-71), 1.72 (3H, t, J=7.5Hz, H-82), 1.64 (3H, d, J=7.0Hz, H-181), 1.63 (3H, s, H-18’), 0.88 (6H, d, J=6.0Hz, H-16’, 17’), 0.84 (3H, d, J=6.5Hz, H-19’) 0.82 (6H, d, J=6.5Hz, H-20’) ; 13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 142.0 (s, C-1), 131.8 (s, C-2), 12.0 (q, C-21), 136.3 (s, C-3), 128.9 (d, C-31), 122.9 (t, C-32), 136.3 (s, C-4), 97.9 (s, C-5), 155.4 (s, C-6), 136.2 (s, C-7), 11.2 (s, C-71), 150.0 (s, C-8), 19.4 (t, C-81), 17.3 (q, C-82), 149.9 (s, C-9), 104.2 (s, C-10), 137.7 (s, C-11), 130.0 (s, C-12), 12.3 (q, C-121), 126.9 (s, C-13), 191.8 (s, C-131), 88.8 (s, C-132), 172.5 (s, C-133), 53.4 (q, C-134), 149.9 (s, C-14), 107.8 (s, C-15), 162.7 (s, C-16), 51.7 (d, C-17), 31.4 (t, C-171), 31.3 (t, C-172), 173.5 (s, C-173), 50.3 (d, C-18), 22.5 (q, C-181), 173.5 (s, C-19), 93.9 (s, C-20), 61.5 (t, C-1’), 117.7 (d, C-2’), 142.7 (s, C-3’), 39.7 (t, C-4’), 24.7 (t, C-5’), 36.5 (t, C-6’), 32.5 (d, C-7’), 37.3 (t, C-8’), 24.9 (t, C-9’), 37.2 (t, C-10’), 32.6 (d, C-11’), 37.1 (t, C-12’), 24.3 (t, C-13’), 39.2 (t, C-14’), 27.8 (d, C-15’), 22.6 (t, C-16’,17’), 16.3 (q, C-18’), 19.5 (q, C-19’), 19.6 (q, C-20’) 。1H NMR和13C NMR 数据与文献对照完全一致[5,6]。

化合物7 24-hydroperoxycycloart-25-en-3β-ol

℃e/z 476 [M+NH4+]. 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, 白色粉末, mp 112-115, ESIMS

d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, d, J=4.0Hz, H-19b), 0.82 (3H, s, H-30), 0.88 (d, 3H, J=7.0Hz, H-21), 0.90 (3H, s, H-28), 0.98 (6H, s, H-18, 29), 1.74 (3H, s, H-27), 3.30 (1H, dd, J=5.0, 11.0Hz, H-3), 4.28 (1H, t, J=6.6, H-24), 5.02 (2H, s, H-26), 7.82 (br s, -OOH)；13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 32.0 (t, C-1), 30.3 (t, C-2), 78.9 (d, C-3), 40.5 (s, C-4), 47.1 (d, C-5), 21.1 (t, C-6), 26.0 (t, C-7), 48.0 (d, C-8), 20.0 (s, C-9), 26.1 (s, C-10), 26.4 (t, C-11), 32.9 (t, C-12), 45.3 (s, C-13), 48.8 (s, C-14), 35.6 (t, C-15), 28.1 (t, C-16), 52.1 (d, C-17), 18.0 (q, C-18), 29.9 (q, C-19), 35.8/36.0 (s, C-20),18.4 (q, C-21), 32.0 (t, C-22), 27.2/27.6 (t, C-23), 90.2 (d, C-24), 144.0 (s, C-25), 114.1/114.6 (t, C-26), 16.9/17.1 (q, C-27), 19.3 (q, C-28), 25.4 (q, C-29), 14.0 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[7,8]。

化合物8cycloart-25-en-3?, 24-diol

℃e/z M+ 442.1 (8), 424.1 (20), 408.9 (16), 306.6 (18), 无色针状晶体, mp 140-142, FABMS

288.6 (18), 256.8 (16), 219.0 (56), 154.2 (100); 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, d, J=4.0Hz, H-19b), 0.80 (3H, s, H-30), 0.90 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.91 (3H, s, H-28), 0.99 (6H, s, H-18, 29), 1.75 (3H, s, H-27), 3.30 (1H, dd, J=5.0,

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

11.0Hz, H-3), 4.05 (1H, t, J=6.5Hz, H-24), 4.86 (2H, s, H-26)； 13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 32.0 (t, C-1), 30.4 (t, C-2), 78.8 (d, C-3), 40.5 (s, C-4), 47.1 (d, C-5), 21.1 (t, C-6), 28.1 (t, C-7), 48.0 (d, C-8), 20.0 (s, C-9), 26.0 (s, C-10), 26.1 (t, C-11), 32.6 (t, C-12), 45.3 (s, C-13), 48.8 (s, C-14), 32.9 (t, C-15), 26.5 (t, C-16), 52.2 (d, C-17), 18.0 (q, C-18), 29.9 (q, C-19), 35.6/35.9 (s, C-20),18.3 (q, C-21), 32.0 (t, C-22), 31.7/31.9 (t, C-23), 76.4 (d, C-24), 144.8 (s, C-25), 110.9/111.6 (t, C-26), 17.6/17.15 (q, C-27), 19.3 (q, C-28), 25.4 (q, C-29), 14.0 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[7, 8]。

化合物9 25-hydroperoxycycloart-23-en-3β-ol

无色针状晶体, mp. 126-128, ESIMS e/z 458 [M+]. 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, J=4.0Hz, H-19b), 0.82 (3H, s, H-30), 0.90 (3H, s, H-28), 0.88 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.98 (6H, s, H-18, 29), 1.34 (6H, s, H-26, 27), 3.30 (1H, dd, J=5.0, 11.0Hz, H-3), 5.53 (1H, d, J=15.0Hz, H-24), 5.68 (1H, ddd, J=6.0, 9.0, 15.0Hz, H-23), 7.32 (brs, -OOH)；13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 32.0 (t, C-1), 30.3 (t, C-2), 78.9 (d, C-3), 40.5 (s, C-4), 47.1 (d, C-5), 21.1 (t, C-6), 26.0 (t, C-7), 48.0 (d, C-8), 20.0 (s, C-9), 26.1 (s, C-10), 26.4 (t, C-11), 32.9 (t, C-12), 45.3 (s, C-13), 48.8 (s, C-14), 35.6 (t, C-15), 28.1 (t, C-16), 52.1 (d, C-17), 18.0 (q, C-18), 29.9 (q, C-19), 36.3 (s, C-20),18.4 (q, C-21), 39.3 (t, C-22), 130.6 (d, C-23), 134.6 (d, C-24), 82.3 (s, C-25), 24.4 (q, C-26,27), 19.3 (q, C-28), 25.4 (q, C-29), 14.0 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[9]。

化合物10 cycloart-23-en-3β, 25-diol

无色针状晶体, mp. 201-204, FABMS

℃e/z M+ 442.0 (20), 424.2 (56), 410.1 (40), 307.7 (65), 303.0 (41), 288.9 (65), 219.5 (100), 203.2 (88), 154.2 (100). 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, d, J=4.0Hz, H-19b), 0.83 (3H, s, CH3-30), 0.88 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.91 (3H, s, H-28), 0.99 (6H, s, H-18, 29), 1.34 (6H, s, H-26, 27), 3.30 (1H, dd, J=5.0, 11.0Hz, H-3), 5.62 (2H, br s, H-23, 24)；13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 31.7 (t, C-1), 30.1 (t, C-2), 78.5 (d, C-3), 40.2 (s, C-4), 46.8 (d, C-5), 20.8 (t, C-6), 27.8 (t, C-7), 47.7 (d, C-8), 19.7 (s, C-9), 25.8 (s, C-10), 25.8 (t, C-11), 32.5 (t, C-12), 45.1 (s, C-13), 48.5 (s, C-14), 32.5 (t, C-15), 26.2 (t, C-16), 51.9 (d, C-17), 17.8 (q, C-18), 29.7 (q, C-19), 36.1 (s, C-20),18.0 (q, C-21), 38.8 (t, C-22), 139.0 (d, C-23), 125.3 (d, C-24), 70.5 (s, C-25), 29.6 (q, C-26,27), 19.3 (q, C-28), 25.2 (q, C-29), 13.7 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[10]。

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

化合物11 cycloart-23, 25（26）-dien-3?-ol

℃e/z M+ 424.2 (25), 409.2 (23), 341.1 (10), 307.0 (20), 白色粉末, mp. 185-188, FABMS

288.9 (22), 219.3 (58), 203.2 (88), 154.3 (62), 136.4 (64),79.1 (100). 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, d, J=4.0Hz, H-19b), 0.82 (3H, s, H-30), 0.88 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.91 (3H, s, H-28), 0.99 (6H, s, H-18, 29), 1.75 (3H, s, H-27), 3.30 (1H, dd, J=5.0, 11.0Hz, H-3), 4.87 (2H, br s, H-26), 5.67 (1H, ddd, H=7.0, 15.0Hz, H-23), 6.14 (d, 1H, J=15.0Hz, H-24)；13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 31.7 (t, C-1), 30.1 (t, C-2), 78.5 (d, C-3), 40.2 (s, C-4), 46.8 (d, C-5), 20.8 (t, C-6), 27.8 (t, C-7), 47.7 (d, C-8), 19.7 (s, C-9), 25.8 (s, C-10), 25.8 (t, C-11), 32.5 (t, C-12), 45.1 (s, C-13), 48.5 (s, C-14), 32.5 (t, C-15), 26.2 (t, C-16), 51.9 (d, C-17), 17.8 (q, C-18), 29.7 (q, C-19), 36.5 (s, C-20),18.2 (q, C-21), 38.5 (t, C-22), 129.6 (d, C-23), 133.2 (d, C-24), 142.0 (s, C-25), 113.7 (t, C-26), 18.8 (q, C-28), 19.1 (q, C-28), 25.2 (q, C-29), 13.7 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[9]。

化合物12 cycloart-24-en-3β- ol

℃e/z M+ 426.4 (8), 409.2 (55), 407.1 (54), 367.2 (76), 无色针状晶体,mp. 106-108, EIMS

339.2 (73), 297.2 (88), 227.1 (100). 1H-NMR (500M, CDCl3) δ: 0.35 (1H, d, J=4.0Hz, H-19a), 0.56 (1H, d, J=4.0Hz, H-19b), 0.80 (3H, s, H-30), 0.89 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.90 (s, 3H, H-28), 0.99 (6H, s, CH3-18, 29), 1.63 (3H, s, H-26), 1.70 (3H, s, H-27), 3.30 (1H, dd, J=5.0, 11.0Hz, H-3), 5.12 (1H, t, J=7.5Hz, H-24；13C NMR (125MHz, CDCl3) δC 32.0 (t, C-1), 30.4 (t, C-2), 78.9 (d, C-3), 40.5 (s, C-4), 47.1 (d, C-5), 21.1 (t, C-6), 26.5 (t, C-7), 48.0 (d, C-8), 20.0 (s, C-9), 26.0 (s, C-10), 26.1 (t, C-11), 32.9 (t, C-12), 45.3 (s, C-13), 48.8 (s, C-14), 32.6 (t, C-15), 28.2 (t, C-16), 52.3 (d, C-17), 18.0 (q, C-18), 29.9 (q, C-19), 35.9 (s, C-20),18.2 (q, C-21), 35.6 (t, C-22), 25.0 (t, C-23), 125.3 (d, C-24), 130.9 (s, C-25), 17.7 (q, C-26), 24.7 (q, C-27), 19.3 (q, C-28), 25.4 (q, C-29), 14.0 (q, C-30)。1H NMR和13C NMR 数据与文献对照完全一致[11,12,10]。

化合物13 24-hydroperoxy-24vinylcholesterol 24-过氧氢-24-乙烯基胆甾醇

℃m/z 444.36[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 7.02 白色固体，mp.142-145,EIMS

（brs, -OOH）, 5.76 (1H, ddd, J=17.5, 11.0, 6.0Hz, H-28), 5.37 (1H, brd, H-6), 5.30 (1H, dd, J=17.5, 6.0Hz, H-29a), 5.18 (1H, d, J=11.0Hz, H-29b), 3.55 (1H, m, H-3), 1.03 (3H, s, H-19), 0.96 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.88 (6H,d , J=7.0Hz, H-26, 27), 0.71 (3H, s, H-18)。13C-NMR

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[13,14]。

化合物14 saringosterol马尾藻甾醇

℃m/z 428.6[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.82 (1H, 无色针晶，mp.158-160, EIMS

ddd, J=17.5, 11.0, 6.0Hz, H-28), 5.37 (1H, brd, H-6), 5.20 (1H, dd, J=17.5, 6.0Hz, H-29a), 5.16 (1H, d, J=11.0Hz, H-29b), 3.50 (1H, m, H-3), 1.00 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.86 (6H,d , J=7.0Hz, H-26, 27), 0.67 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[14]。

化合物15 24,28-epoxy-24-ethylcholesterol 24，28-环氧-24-乙基胆甾醇

℃m/z 428.3[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.36 (1H, brd, 白色固体，mp.133-136,EIMS

H-6), 3.55 (1H, m, H-3), 2.96 (1H, q, J=6.0Hz, H-28), 1.30 (3H, d, J=5.6Hz, H-29), 1.02 (3H, s, H-19), 0.99 (6H, d , J=7.0Hz, H-26, 27), 0.92 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.68 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[15]。

化合物16 isofucosterol岩藻甾醇

℃m/z 412.3[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.36 (1H, brd, 无色针晶，mp.133-136,EIMS

H-6), 5.18(1H, q, J=6.6Hz, H-28), 3.52 (1H, m, H-3), 2.80 (1H, m, H-25), 1.58 (3H, s, H-29), 1.01 (3H, s, H-19), 0.98 (6H, d , J=7.0Hz, H-26, 27), 0.94 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.70 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[16]。化合物17 β-sitosterolβ-谷甾醇

℃m/z 414.39[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.36 无色针晶，mp.135-139,EIMS

(1H, brd, H-6), 3.52 (1H, m, H-3), 1.01 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.68 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[17]。化合物18 stigmasterol豆甾醇

℃m/z 412.3[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.36 (1H, 白色固体，mp. 168-169,EIMS

brd, H-6), 5.18 (2H, brs, H-22, 23), 3.52 (1H, m, H-3), 1.00 (3H, s, H-19), 0.94 (3H, d, J=6.5Hz, H-21), 0.70 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[18]。

化合物19 3β-Hydroxystigmast- 5-en-7-one5-烯-7-酮胆甾醇

白色固体，mp. 147-149,EIMS

℃m/z 428.4[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.72 (1H, s, H-6), 3.70 (1H, m, H-3), 1.22 (3H, s, H-19), 0.98 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.84 (3H, d, J=7.0Hz, H-27), 0.81 (3H, d, J=7.0Hz, H-26), 0.71 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[19]。

化合物20 β-Hydroxyergosta-5,24(28)-dien-7-one

3β-麦角甾醇-5，24（28）-二烯-7-酮

℃m/z 412.3[M+]；1H-NMR (500M,CDCl3) δH 5.72 (1H, 白色固体，mp. 166-168,EIMS

s, H-6), 4.74-4.68 (2H, brs, H-28), 3.68 (1H, m, H-3), 1.20 (3H, s, H-19), 1.04 (6H,d , J=7.0Hz, H-26, 27), 0.96 (3H, d, J=7.0Hz, H-21), 0.70 (3H, s, H-18)。13C-NMR 数据见表3.2。1H NMR和13C NMR数据与文献对照完全一致[19]。

化合物 214-hydroxybenzaldehyde 对羟基苯甲醛

白色固体分子组成C7H6O2；mp116-117o C；ESIMS(negative) m/z [M-H]-121.4；1H NMR(300MHz, CDCl3)数据δH 9.84(1H, s, CHO)，7.77(2H, d, J=9.1Hz H-2, 6)，6.93(2H, d, J=9.1Hz, H-3, 5)。与文献对照完全一致[20]。

表3.2 化合物13-20的13C-NMR（δ）数据 (125MHz，CDCl3-d1)

compounds

carbon 13 14 15* 16 17 18 19 20

1 37.41 37.41 37.26 37.20 37.20 37.40 36.34 36.35

2 31.82 31.82 31.65 31.71 31.61 31.71 31.19 31.18

3 71.98 71.98 71.77 71.82 71.82 71.82 70.5

4 70.55

4 42.4

5 42.4

6 42.30 42.33 42.33 42.33 41.81 41.81

5 140.90 140.91 140.90 140.80 140.70 140.90 165.10 165.12

6 121.90 121.89 121.61 121.70 121.70 121.70 126.13 126.13

7 31.82 32.06 31.90 32.00 31.93 31.93 202.38 202.40

8 32.05 32.06 31.90 31.90 31.90 31.90 45.41 45.42

9 50.25 50.25 50.10 50.12 50.12 50.32 49.95 45.95

10 36.67 36.66 36.50 36.41 36.50 36.61 38.58 38.82

11 21.24 21.23 21.08 21.11 21.11 21.11 21.22 21.22

12 39.90 39.89 39.74 39.80 39.70 39.90 38.69 38.68

13 42.25 42.46 42.30 42.33 42.33 42.43 43.10 43.13

14 56.90 56.90 56.74 56.74 56.84 57.00 49.91 49.91

15 24.47 24.45 24.27 24.33 24.33 24.43 26.32 26.32

16 28.46 28.35 28.21 28.22 28.22 28.92 28.56 28.56

17 56.03 55.95 55.57/55.74? 55.80 56.00 56.10 54.78 54.62

18 12.04 12.03 11.86 11.80 12.00 12.10 11.98 11.98

19 19.58 19.58 19.40 19.44 19.44 19.04 17.32 17.32

20 36.36 36.29 36.14/35.98? 36.40 36.10 40.40 36.18 35.67

21 19.07 18.97 18.89/18.93? 18.71 18.81 21.12 18.98 18.87

22 28.46 29.24 30.32 35.21 33.91 138.30 33.90 34.68

23 28.45 32.13 25.38/25.69? 25.70 26.00 129.40 26.32 30.97

24 89.35 77.80 66.11 147.10 45.80 51.30 46.03 156.80

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

25 32.05 36.08 30.88/30.91? 34.80 29.10 32.00 28.88 33.76

26 16.84 16.64 17.74/17.81? 22.10 26.10 19.10 18.98 21.01

2717.89 17.75 18.66 22.20 19.00 21.20 18.87 21.87

28 137.34 142.73 57.52/57.97? 115.40 23.00 25.44 22.98 106.03

29 116.54 113.04 13.44 13.30 11.82 11.90 12.33

*旋光异构体*Mixture of epimers.

?异构体对应的碳谱数据 ?Signal of the minor epimer

第三节药理活性筛选结果

对中国黄海海域束生刚毛藻的化学成分及其生物活性方面尚无报道，为了真正找到该海藻的生物活性成分，对束生刚毛藻全藻的90%乙醇提取物的各极性段和从中所分离得到的部分单体化合物做了体外细胞毒活性筛选和几种肿瘤细胞靶蛋白酶抑制活性筛选，并对叶绿素类化合物做了NF-κB和蛋白酶体的抑制活性筛选。

3.3.1 束生刚毛藻粗提物各极性段的体外细胞毒活性筛选

对束生刚毛藻90%乙醇提取物萃取后的石油醚部分，乙酸乙酯部分，及正丁醇部分进行了体外肿瘤细胞细胞毒活性筛选。石油醚部分，乙酸乙酯部分，正丁醇部分在浓度分别为100、10、1μg/mL时对6种人肿瘤细胞株（HL-60人白血病细胞、PC-3M-18人前列腺癌、BGC-823人胃癌细胞、MDA-MB 435人乳腺癌、Bel-7402人肝癌、Hela人宫颈癌）。

3.3.1.1 实验材料

实验所用六种肿瘤细胞株分别为：HL-60人白血病细胞、PC-3M-18人前列腺癌、BGC-823人胃癌细胞、MDA-MB 435人乳腺癌、Bel-7402人肝癌、Hela人宫颈癌(由北京大学医学部天然药物与仿生药物国家重点实验室新药筛选中心测定)。

MTT(Methyl-Thiazol-Tetrozolium，四甲基偶氮唑盐，购于Sigma公司)，用生理盐水溶解配制成5mg/mL的溶液，-20℃保存；所选用溶剂为DMSO(二甲基亚砜)，西安化学试剂厂生产，分析纯。

磺酰罗丹明(sulforhodamine B, SRB，购于Sigma公司)以1%醋酸配制成0.4%的溶液备用。

3.3.1.2 实验方法及实验结果

3.3.1.2.1四甲基偶氮唑盐(MTT)还原法

方法：药物与细胞接触48小时后，每孔加入5 mg/mL的MTT工作液20μl，37℃、5%CO2继续培养4小时，快翻法除去上清液，每孔加入DMSO 100μl，微型振荡器振荡10分钟，酶标仪570nm波长测定每孔OD值，按照下列公式计算抑制率：抑制率＝[1－(对照孔平均OD值－加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值]×100%

四种海洋生物的化学成分及其生物活性研究

细胞株：HL-60人白血病细胞株

作用时间：72小时

结果表明束生刚毛藻粗提物的石油醚(P.E.)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BUOH)和水(H2O)四个极性段在浓度为10－4 g/ml、10－5 g/ml和10－6 g/ml对HL-60人白血病肿瘤细胞的生长没有显著的抑制作用。

3.3.1.2.2磺酰罗丹明(sulforhodamine B, SRB)蛋白染色法

细胞株： PC-3M-1E8人前列腺癌细胞、MDA-MB 435人乳腺癌细胞、BGC-823人胃癌细胞、HELA人宫颈癌及BEL-7402人肝癌细胞株

方法：药物和细胞接触48小时后，每孔加入预冷好的4℃的80% TCA 50μl，静置片刻，将96孔板移入冰箱放置1小时，取出后以去离子水冲洗培养板5遍，自然干燥至无湿痕，每孔再加50μl 0.4% SRB工作液，染色30分钟，以1% 醋酸冲洗5遍，自然干燥至无湿痕，最后每孔加入10mM Tris缓冲液(PH 10) 100 μl，酶标仪540nm测定每孔OD值。

作用时间：72小时

结果表明束生刚毛藻粗提物的石油醚(P.E.)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BUOH)和水(H2O)四个极性段在浓度为10－4 g/ml、10－5 g/ml和10－6 g/ml对PC-3M-1E8人前列腺癌细胞、MDA-MB 435人乳腺癌细胞、BGC-823人胃癌细胞、HELA人宫颈癌细胞、BEL-7402人肝癌细胞没有显著的抑制活性。

3.3.1.3石油醚部分分段F2-F9细胞毒活性筛选

对石油醚部分根据TLC进行分段，所得F2-F9部分在浓度为100μg/mL时，对4种人肿瘤细胞株（HL-60人白血病细胞、BGC-823人胃癌细胞、Bel-7402人肝癌细胞、KB人鼻咽癌细胞）进行细胞毒活性筛选，结果见表3.3。

表.3.3 石油醚部分分段F2-F9细胞毒活性筛选结果

Table 3.3 the Bioactivity Screening of F2-F9

对不同细胞株抑制率

HL-60

人白血病细胞

MTT法

BGC-823人胃癌

细胞

SRB法

Bel-7402人

肝癌细胞

SRB法

KB人鼻咽癌

细胞

SRB法

评价

F2 －18.22 11.83 3.27 11.07

无效F3 －10.02 7.67 1.57 12.29

无效F4 67.39 10.33 30.49 30.40

无效F5 22.63 13.64 51.99 71.55

无效F6 －11.72 15.59 6.8/2 37.52

无效

第三章　束生刚毛藻的化学成分及其生物活性研究

35.82

无效F7 3.60 17.80 10.14

有效F8 67.86 52.86 74.74 81.66

有效F9 73.98 30.91 71.06 73.20

F10 22.94 10.01 －0.19 8.53 无效

表3.3给出石油醚分段部分F2-F9的体外对肿瘤细胞的细胞毒活性的筛选结果，从中可以看出, 只有F8和F9对HL-60人白血病细胞、BGC-823人胃癌细胞、Bel-7402人肝癌细胞、KB人鼻咽癌细胞有一定的细胞毒活性，考虑到该海藻可能还有其他活性和相关的TLC表现，确定对石油醚部分进行重点分离。

3.3.2 束生刚毛藻部分单体化合物的体外细胞毒活性筛选

在浓度为100μg/mL时，对分离得到的单体化合物1、5、7、8、11、14，选用7种人肿瘤细胞株：HL-60人白血病细胞、MDA－ME-319人乳腺癌、Bel-7402人肝癌、PC-3M-18人前列腺癌、BGC-823人胃癌细胞、HeP-2人喉癌、Hela人宫颈癌，进行了体外肿瘤细胞毒活性筛选。其中HL-60人白血病细胞、MDA－ME-319人乳腺癌、Bel-7402人肝癌采用MTT法；PC-3M-18人前列腺癌、BGC-823人胃癌细胞、HeP-2人喉癌、Hela人宫颈癌采用SRB法，方法同3.1.2，(由北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室新药筛选中心测定)。筛选结果表明这些化合物对所筛选的肿瘤细胞都没有显著的抑制活性。

对叶绿素类化合物5、6在不同浓度（浓度分别为10－4、10－5、10－6、10－7和 10－8 M）下，分别进行对HL-60、A-549、HELA和BEL-7402肿瘤细胞生长的抑制活性筛选，结果表明这些化合物对所筛选的肿瘤细胞都没有显著的抑制活性。

3.3.3单体化合物的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性筛选

PTP1B是第一个被鉴定的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase)，通过PTP1B剔除对老鼠实验显示，PTP1B通过对胰岛素受体的脱磷酰化，进而在调节胰岛素敏感性和脂肪代谢过程中起着非常重要的作用。因而，选择性的、高活性的PTP1B 抑制剂在糖尿病和肥胖症的治疗中有重要的价值。

实验方法：用于筛选的蛋白质酪氨酸酯酶PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外底物pNPP，观察不同化合物对重组酶的活性抑制，以初步评价化合物的药用效果。

PTP1B水解底物pNPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收，因此可以直接监测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其对抑制情况。实