病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…
（一）病毒的分离
病毒分离的一般程序是：
检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状
鸡胚→病变或死亡
细胞培养→细胞病变
→鉴定病毒种型(血清学方法)
无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。
1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。
原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。
二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。
传代细胞培养(Continous cell culture) 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如Hela 、Hep-2、Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。
表5.病毒增殖用部分细胞系及来源
细胞系名称来源
二倍体细胞系
HDCS ,MRC-9 ,WI-38
传代细胞系
Hela ,Hep-2 ,Vero ,BHK 人胚肺细胞,人宫颈癌细胞,人上皮细胞,猴肾细胞,地鼠肾
细胞
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…
淋巴细胞培养（Lymphocyte culture）正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T 淋巴细胞在加入T细胞生长因子（IL-2）后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒（HIV、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。
2．动物试验这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉，例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠（一周龄）腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。
3．鸡胚培养用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养；但很多病毒在鸡胚中不生长。
（二）分离病毒的鉴定
1．病毒在细胞内增殖的指征
（1）细胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。免疫荧光（IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。
表6.病毒在细胞内增殖的指征
病毒增殖指征
CPE病毒小RNA病毒单纯疱疹病毒腺病毒副粘病毒HIV 非CPE病毒正粘病毒副粘病毒风疹病毒
鼻病毒细胞园缩、单层破坏细胞肿大变园细胞变园堆积成葡萄状多核巨细胞（合胞体）红细胞吸附现象干扰并阻止其他病毒（如ECHO病毒）的细胞致病作用
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…
（2）红细胞吸附现象（Hemadsorption phenomenon）流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。
（3）干扰现象(Interference phenomenon) 一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。
2．病毒感染性的定量测定
空斑形成单位(Plaque-forming unit ,PFU) 测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。
（2）50%致死量（LD50）或50%组织细胞感染量（TCID50）的测定本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。
3．病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。
4．血清学鉴定用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性期与恢复期双份血清作血清学试验，血清抗体滴度有≥4倍以上增高，才有意义。
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用
4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
植物内生菌分离方法 植物内生菌分离方法 匿名提问 2009-02-18 20:04:53 发布 自然科学学术 6个回答 回答 曲恋| 2009-02-18 20:45:40 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。( 添加评论(0) nk0226 | 2009-07-25 11:13:09 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物病毒与病毒防治 Plant Virology& Control of Plant Virology 32学时2学分 一、课程性质、地位和任务 植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。 二、课程教学的基本要求 要求学生重点掌握以下内容： （1）植物病毒的传播途径及传毒机制；
（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程； （3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫； （4）植物亚病毒病原的基本特性； （5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。 三、课程理论教学大纲及学时分配 1. 绪论（2学时） 1.1 病毒的发现与病毒学的发展 1.2 研究病毒的意义与任务 1.3 植物病毒与其他病毒的关系 1.4病毒与其他微生物的区别 2. 病毒的分类与命名（3学时） 主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。 2.1 病毒命名和分类的发展 2.2 病毒命名的系列 2.3 病毒分类的系列 2.4 植物病毒的命名和分类系统 3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时） 主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。 3.1病毒粒体的吸附与侵入 3.2病毒粒体的脱壳与生物合成 3.3病毒粒体的装配与释放 3.4病毒的遗传与变异 3.5病毒的体外重新组与生物活性 4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时） 主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。 4.1介体传毒 4.2非介体传毒 4.3种子与花粉传毒 4.4传毒机制 5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时） 主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。 5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型） 5.2病毒在植物体内的运输
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析 摘要：使用Vero细胞接种临床症状疑似感染犬流感病毒（CIV）的犬肺组织，盲传3代，观察其病变情况，收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性及形态学观察，同时进行序列测定和分析，并制作系统进化树。结果表明，从犬肺中成功分离出一株犬流感病毒，该病毒能够凝聚豚鼠、猪、鸡抗凝血，电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明，与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性极高，只有少数地方發生了特异变异。这些数据的分析对于犬流感的防控有一定的参考价值。 关键词：犬流感病毒;分离鉴定;基因序列 中图分类号：S858.292 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）08-0009-02 犬流感是由犬流感病毒（CIV）引起的犬的一种接触性传染病，该病的主要临床症状表现为发热、流涕和咳嗽。CIV是犬传染性呼吸系统疾病的主要病原之一，其容易引起犬的支气管炎和支气管肺炎，损害呼吸道上皮细胞，给其他病原体的感染创造了条件。该病对于世界各国养犬业的发展也产生了一定的影响。 CIV在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科如布拉病毒属。其与同属的猴病毒V型、人SV5分离株及人流感病毒等抗原性密切相关。当前，市场上虽然有相关疫苗，但是该病的发生率依然很高，之所以出现这种现象可能与该病毒的不断变异存在一定的关系。基于该原因，分离当前的流行变异株、了解序列变异情况对于该病的预防、诊断及治疗意义重大。本试验对一例疑似犬流感病例的肺组织中分离出的病毒进行了鉴定，并尝试对该病毒中的部分基因序列进行了分析，探讨了其出现遗传变异的情况。现将其报道如下。 1 材料与方法
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
作业指导书第 1 页共 5 页第1版第1次修订 起草人：王军鹏审核人： 标题：流感病毒分离培养和鉴定标准操作规程批准人：批准日期：2013年12月18日实施日期：2013年12月18日 1. 范围 适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。 2. MDCK细胞培养程序 2.1 生物安全要求 MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的MDCK细胞 2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶 2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于 -20℃ 2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液 2.2.6 胎牛血清 2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃ 2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V 2.2.9 1mL、10mL无菌移液管 2.2.10 70％～75％的酒精 注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 2.3 实验步骤 这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 2.3.1 D-MEM培养液的准备 500mL D-MEM液中加入： a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素）。 b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。 c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。 2.3.2 细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。 2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
流感病毒检验 发表时间：2009-08-10T09:20:24.920Z 来源：《中外健康文摘》2009年第20期供稿作者：谭耀武 (黑龙江省宝清县八五三农场疾控中心黑龙江宝清 [导读] 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)20-0277-01 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的前后顺序，更重要的是反映了对人危害程度的顺序，甲型常以流行的形式出现，可造成世界性的大流行，乙型常以局部流行的形式出现，丙型主要是侵犯婴幼儿。 1 样本采集 1.1采样液 Hank平衡盐、细胞培养液、牛肉浸液（小牛肉浸膏l0g、牛血清白蛋白2g，加蒸馏水至400ml、庆大霉素40mg、多粘菌素 B 0. 8mg，过滤除菌）等均可作采样液。 1.2采集鼻咽腔拭子标本（1）咽拭子：用棉签擦拭双侧扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸人2～3ml采样液中。（2）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插人鼻腔、接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液刷洗收集器3次。（3）含漱液：用8～10以采样液漱口。 1.3收集血清标本血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期应在发病7天内采集，恢复期则在发病后2～4周采集。血液标本以2500r/min离心l5min，收集血清，弃血凝块。 1.4标本运送病毒分离标本采集后应立即低温保存，应尽快送至实验室。24～48h内样品可置4℃保存，如48h内未能进行接种，应置－70℃或以下保存。血清标本可在4汇存放一周，在－20℃长期保存。 1.5标本处理咽拭子标本，收集管于混合器充分震荡，用无菌镊子取出棉拭子并在管壁上反复挤压棉拭子后弃拭子，标本加入双抗（青霉素、链霉素）终浓度为l000IU/ml，混匀置4℃2h方可接种或低温保存；含漱液标本，混匀后自然沉淀，取上清液3ml，加双抗；鼻咽抽取物标本，取无菌毛细吸管将洗液反复吹打，把粘液打散，而后按上述方法进行处理；器官组织标本，先用无菌的乳钵磨碎，用生理盐水配成20％悬液，2000r/min离心l0min，取上清液3ml按上述方法进行抗菌处理。 2 检验方法 2.1材料和方法 2.1.1器材孵卵箱（38℃、33～35℃：各一个）、照卵器、卵盘、注射器、消毒剂、镊子、无菌生理盐水、毛细吸管、试管、液体石蜡和封口胶等。 2.1.2方法当今国内外常用狗肾传代细胞（MDCK）。将已长成单层的细胞管弃生长液，用含有l00IU/ml双抗HanK's液洗2遍，用0.2～0.4ml处理过的标本液接种于细胞管，每份标本接种4管，置35T吸附1～2h后弃标本液，加入病毒培养液，其量为生长液的2倍。如标本液清亮和进行病毒传代时，可不必吸附，直接加入。置33～35℃孵育7d。从第3d开始观察细胞病变（CPE），如细胞出现颗粒增多、变圆、脱落达+++～++++时进行收获。如果7d还不出现CPE，可收集病毒培养液做血细胞凝集试验，在做试验前将细胞管冻融1～2次，以提高病毒滴度。阳性者可测定其血凝滴度并鉴定之，阴性者混合4管细胞液盲传2代，仍为阴性则弃去。 2.3病毒鉴定新分离的病毒可用血细胞凝集抑制试验、补体结合试验和中和试验等方法进行鉴定。最常用和简单的方法是血细胞凝集抑制试验，必要时采用补体结合试验。 2.4快速诊断流感病毒的主要感染部位是呼吸道上皮细胞，在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物。 2.5血清学诊断病毒分离是诊断流感最常用的方法之一，如因各方面因素未分离出病毒，血清学亦可作为一种代替手段，但必须收集急性期和恢复期双份血清，如恢复期血清特异性抗体较急性期增高4倍或以上，即可诊断。本章介绍两种常用的方法：血凝抑制试验和中和试验。
病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。 (一) 组织器官样品的处理 1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机 制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液； 2.加入复合抗生素； 3.以800×g离心15min； 4.取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。 (二) 粪便样品的处理 1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液； 2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球； 3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心； 4.用450nm的微孔滤膜过滤； 5.加二倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。 (三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品可不做处理，直接用于病毒分离。 注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。 (四) 样品的特殊除菌处理样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。 1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA
病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。取用下层水相分离病毒。 2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响， 常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。 3. 过滤除菌可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素 酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。 4. 离心除菌用低温高速离心机以1800r/min（1 5.24cm）离心20min，可沉淀除 去细菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。必要时转移离心管重复离心一次。 (五) 待检样品中病毒的浓缩对病毒含量很少的病毒样品一般普通方法不易检测或分离出 病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下： 1.聚乙二醇（PEG）浓缩法将分子量6 000的PEG逐步加入经一般处理的样品 溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的Hank’s 平衡盐溶液重悬，心要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。 2.硫酸铵浓缩法将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液 中边加边搅拌，置4C过夜。离心同上。 3.超滤器浓缩法是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。 4.超速离心浓缩法以40 000r/min（1 5.24cm）离心60-120min ,绝大多数病毒将沉 于管底。用少量Hank’s平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。 (六) 病毒分离样品脂类物质的去除有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很 高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂对半加入样品中，强烈振荡后，1000×g离心5 min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。
病毒的分离鉴定 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方 法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，～。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。 传代细胞培养 (Continous cell culture) 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如
病毒的分离与鉴 定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1. 病毒的分离 1.1 标本的处理 1.1.1 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g, 4C离 心 6min 。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml 运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g 4C离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000X g 4C离心30min。 1.1.2 除菌处理 a）粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。b）鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4 小 时。
图1.鸡胚卵黄囊接种：用 5?8 天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室 图刺入卵黄羊膜腔接种取获卵黄12? 囊膜检查胚,常用于某些羊膜腔病 毒育分取羊水检查。常用干流感 C ）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚 4C 过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据 病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细 胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量 上的一致。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温 度为38--39C ，相对湿度为40—70%，孵育8日后，鸡卵应每天 翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 C ） 检卵：鸡卵孵育4?5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡 卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内 有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵 血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚 胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来 鸡胚孵育完毕后，用铅笔 划出气室边缘和胚胎的位置待用。
病毒的分离与鉴定 2005-10-22 00:00:00 来源：本站原创点击数：评论：0我要评论 病毒分离的一般程序是：检验标本T杀灭杂菌（青、链霉素）T接种易感的动物（一）病毒的分离 出现病状鸡胚7病变或死亡细胞培养7细胞病变7鉴定病毒种型（血清学方法）无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10?20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是: 易感的动物7出现病状 检验标本7杀灭杂菌（青、链霉素）7接种鸡胚7病变或死亡7鉴定病毒种型（血清学方法） 细胞培养7细胞病变 无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10?20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1.细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture ）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，PH7.2?7.4。细胞培养适于绝大多 数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养（Primary cell culture）用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞， 加一定培养液，37 C孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养（Diploid cell cultune）原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退 化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生 长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经