第十一章流式细胞技术与流式细胞仪
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习题名词解释选择题简答题
一、名词解释
1．流式细胞仪
2．流式细胞术
3．狭缝扫描流式细胞仪
4．测量区
5. 样品流
6．鞘液流
7．侧向角散射
8．延迟时间
9．荧光灵敏度
10．分选收获率
11．分选速度
12．分选纯度
13．长通滤光片
14．短通滤光片
15．带通滤光片
16. 细胞自发荧光
17．零分辨率的流式系统
二、选择题
【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。
1．流式细胞仪中的鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆形流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为（b ）
A．敏感区
B．测量区
C．激光区
D．计算区
2．流式细胞仪使用的染色细胞受激光照射后发出荧光，同时产生（ b）
A．电离辐射
B．光散射
C．电磁辐射
D．光反射
E．光电子
3．流式细胞仪中的光电倍增管接收（ b ）
A．散射光
B．荧光
C．激光
D．射线
E．反光
4．流式细胞仪中的光电二级管接收（a ）
A．散射光
B．荧光
C．激光
D．射线
E．反光
5．通过测量区的液柱断裂成一连串均匀液滴的原因是在（ c）
A．在流动室上加上了频率为30kHz的信号
B．在测量区上加上了频率为30kHz的信号
C．在压电晶体上加上了频率为30kHz的信号
D．在光电倍增管上加上了频率为30kHz的信号
E．在光电二级管上加上了频率为30kHz的信号
6．将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，动力来自于（c ）
A．激光
B．压电晶体
C．气体压力
D．荧光
E．散射光
7．流动室轴心至外壁的鞘液向下流动，形成包绕细胞悬液的是（ a ）
A．鞘液流
C．散射光
D．荧光
E．测量区
8．各类细胞的特性信息在测量区被测定的时间为（ a ）
A．在细胞形成液滴以前
B．在细胞形成液滴以后
C．在细胞形成液滴过程中
D．在细胞形成液滴前后
E．在细胞形成液滴一小时
9．样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过（ c ）
A．荧光照射区
B．散射光照射区
C．激光照射区
D．X光照射区
E．太阳光照射区
10．前向角散射可以检测（ b ）
A．细胞膜厚薄
B．被测细胞的大小
C．细胞质多少
D．核膜的折射率
E．DNA含量
11．在对细胞膜表面抗原的荧光检测时通常使用（ c）
A．线性放大器
B．指数放大器
C．对数放大器
D．整数放大器
E．函数放大器
12．一般对DNA倍体测量时采用（ a）
A．荧光信号的面积
B．散射光信号的面积
C．前向角散射信号面积和宽度
D．散射光信号的宽度
E．荧光信号的宽度
13．荧光信号的宽度常用来区分（d ）
A．淋巴细胞
B．红细胞
C．白细胞
D．双联体细胞
E．单倍体细胞
14．光谱重叠校正的最有效方法是使用（ e ）
A．放大电路
B．荧光电路
C．散射光电路
D．衰减电路
E．双激光立体光路
15．若每秒钟产生4万个水滴,每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中有（ d ）A．三个水滴是有细胞的
B．二个水滴是有细胞的
C．四个水滴是有细胞的
D.一个水滴是有细胞的
E．五个水滴是有细胞的
16．流式细胞术对HIV感染者或AIDS发病者进行区别是通过（c ）
A．测DNA凋亡峰
B．胞质抗原含量测定
C．动态监测T细胞亚群
D．测凋亡调节蛋白
E．DNA倍体含量测定
17．下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向（a ）A．带负电的电极板偏转
B．带正电的电极板偏转
C．不偏转
D．前向角偏转
E．侧向角偏转
18．什么是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标为（ e ）
A．非特异性酯酶含量测定
B．胞质抗原含量测定
C．DNA含量测定
D．过氧化物酶含量测定
E．DNA倍体含量测定
19．衡量流式细胞仪检测微弱荧光信号的重要指标是（ a ）
A．灵敏度的高低
B．荧光强度
C．散射光大小
D．精密度大小
E．准确度的高低
20．分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用（ d ）
A．误差值表示
B．标准差值表示
C．灵敏度值表示
D．变异系数值表示
E．精密度值表示
21．与前向角散射密切相关的是（ b ）
A．细胞直径
B．细胞直径的平方
C．细胞核的形状
D．血小板数量
E．病毒性质
22．流式细胞仪测定的标本，不论是外周血细胞,还是培养细胞，首先要保证是（ e ）A．单倍体细胞悬液
B．双倍体细胞悬液
C．红细胞悬液
D．白细胞悬液
E．单细胞悬液
23.光路与流路校正的主要目是确保（ c）
A．激光光路稳定
B．样品流稳定
C．激光光路与样品流处于正交状态
D．荧光光光路与样品流处于正交状态
E．散射光光路与样品流处于正交状态
24．为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，PMT校准采用（b ）
A．样品
B．质控品
C．鞘液
D．生理盐水
E．缓冲液
25．为保证仪器在计数时的准确性，流式细胞仪应建立绝对计数（ e）A．样品
B．细胞
C．鞘液
D．细菌
E．标准品
26．样品和鞘液管道应用漂白粉液清洗的间隔时间为（ d ）A．每月
B．每天
C．每季度
D．每周
E．每年
27．FCM显示激光器开启错误,引起故障的可能原因是（ b ）A．激光器关闭
B．激光器门打开
C．流式细胞仪连接错误
D．清洗液少了
E．数据太大，难以处理
28．FCM显示清洗液高度警示,引起故障的可能原因是（ e）A．激光器关闭
B．激光器门打开
C．流式细胞仪连接错误
D．清洗液少了
E．清洗液传感器失灵
29．FCM显示数据处理速率错误,引起故障的可能原因是（ a）A．数据太大，难以处理
B．激光器门打开
C．流式细胞仪连接错误
D．清洗液少了
E．清洗液传感器失灵
【X型题】每题的备选答案中有两个或者两个以上正确答案。
1．流式细胞仪综合了（ abce ）
A．激光技术
B．电子技术
C．流体力学
D．生物化学
E．计算机技术
2．流式细胞仪广泛应用于（ ace ）
A．细胞生物学
B．物理学
C．免疫学
D．电子学
E．血液学
3．FCM在细胞生物学研究中，应用频繁的领域是（ abcd ）
A．细胞周期
B．DNA倍体
C．细胞表面受体
D．细胞表面抗原
E．病毒表面抗体
4．生物学颗粒的内容包括（ abcde ）
A．DNA
B．RNA
C．蛋白质
D．染色体
E．细菌
5．染色的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被（ ad ）A．光电倍增管荧光检测器接收
B．细胞检测器接收
C．激光检测器接收
D．光电二极管散射光检测器接收
E．DNA检测器接收
6.计算机通过储存、计算、分析流式细胞检测到的数字化信息，就可得到（ bcde ）
A．离子多少
B．细胞的大小
C．核酸含量
D．酶的性质
E．抗原的性质
7．流式细胞仪根据其结构不同又可分（ ad ）A．一般流式细胞仪
B．高级流式细胞仪
C．特殊流式细胞仪
D．狭缝扫描流式细胞仪
E．零点流式细胞仪
8．流式细胞仪根据功能不同可分为（ ac ）A．临床型
B．普通型
C．科研型
D．特殊性
E．灵敏型
9．流式细胞仪的结构可分为（ abcde ）A．流动室及液流驱动系统
B．激光光源及光束成形系统
C．光学系统
D．信号检测与存贮、显示、分析系统
E．细胞分选系统
10．流动室的类型有（ ace ）
A．在室内检测的流动室
B．激发型流动室
C．在空气中检测的流动室
D．荧光流动室
E．显微检测流动室
11．属于FCM光学系统的是（ abc ）
A．透镜
B．滤光片
C．小孔
D．流动室
E．分选系统
12．FCM光学系统主要分为（ abe ）
A．长通滤片
B．短通滤片
C．高通滤片
D．低通滤片
E．带通滤片
13．当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质分别产生（bc ）A．激光信号
B．散射光信号
C．荧光信号
D．离子信号
E．反射信号
14．散射光分为（ bd ）
A．后向角散射
B．前向角散射
C．反向角散射
D．侧向角散射
E．正向角散射
15．目前采用前向角散射和侧向角散射这两个参数组合，可区分经裂解红细胞处理后外周血中的（ abd ）
A．淋巴细胞群体
B．单核细胞群体
C．血小板群体
D．粒细胞群体
E．红细胞群体
16．目前采用前向角散射和侧向角散射这两个参数组合，可区分未进行裂解红细胞处理的全血样品中的（ ce ）
A．淋巴细胞群体
B．单核细胞群体
C．血小板群体
D．粒细胞群体
E．红细胞群体
17．线性放大测量适合于检测（ cde ）
A．细胞膜表面抗原的分布
B．单核细胞含量
C．总蛋白质含量
D．RNA含量
E．DNA含量
18．属于细胞分选器组成内容的是（ bcde ）A．细胞分布
B．水滴形成
C．分选逻辑电路
D．水滴充电
E．水滴偏转
19．影响延迟时间的因素为（ abcd ）
A．平均延迟时间的不准确性
B．喷射液流的变化
C．水滴分离点的变化
D．细胞本身对水滴形成条件的影响
E．水滴的性质
20．流式细胞仪在免疫学中的应用包括（ abcd ）A．淋巴细胞功能分析
B．淋巴细胞及其亚群分析
C．化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制
D．肿瘤细胞的免疫检测
E．免疫分型
21．分选指标主要包括（ abce ）
A．分选速度
B．分选灵敏度
C．分选纯度
D．分选精密度
E．分选收获率
22．保证荧光信号产生的非常关键技术是（ abde ）A．荧光染料的选择
B．标记染色方法
C．鞘液的选择
D．细胞的选择
E．细胞的分离
23．FCM室内应注意（ abcd ）
A．配空调
B．避光
C．防尘
D．除湿
E．不用除湿
三、简答题
1．简述流式细胞仪生物学颗粒分析原理。
2．简述流式细胞仪细胞分选原理。
3．流式细胞仪依据什么进行分类? 各类型有什么特点?
4．流式细胞仪主要应用在哪些领域？
5．流式细胞仪的基本结构由哪几部分组成？
6．流式细胞仪的液流系统的功能？
7．流式细胞仪的流动室的作用是什么？
8．流式细胞仪的光源有什么特点？
9．流式细胞仪的光学系统组成和各种滤光片的作用是什么?
10．流式细胞仪所检测的信号有哪些？这些信号所代表的意义和作用是什么？
11．流式细胞仪信号的测量方式和校正方法是什么？
12．流式细胞仪分选器的组成和细胞分选原理是什么？
13．流式细胞仪的主要性能指标有哪些?
14．流式细胞仪操作技术的质量控制主要涉及哪几个方面？
15.流式细胞仪通常出现的故障及排除方法是什么?
习题参考答案
一、名词解释
1．流式细胞仪：是以激光为光源，集流体力学、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学和单克隆抗体等技术为一体的新型高科技仪器。
2．流式细胞术：应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。
3．狭缝扫描流式细胞仪：被检细胞直径大于激光光斑直径，当细胞通过光束时，细胞各部分被依
次先后扫描，得到一维的细胞轮廓组方图，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的
形态学信息的流式细胞仪。
4．测量区：鞘液流和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方
向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。
5. 样品流：将特异荧光染料染色的单细胞悬液放人样品管，在气体压力作用下，悬浮
在样品管中的单细胞经管道进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动所形成的流束称
为样品流。
6．鞘液流：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕样品流的流束称为鞘液流。
7．侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号。
8．延迟时间：由细胞通过测量区到小水滴分离的时间大约为几十毫秒，这个时间称为延迟时间。
9．荧光灵敏度：以能检测到最少的异硫氰酸荧光素分子来表示，即微球上最少标有多少个FITC分
子时刚好能被检测到，即为荧光灵敏度。
10．分选收获率：指被分出的细胞占原来溶液中该细胞的百分比。
11．分选速度：分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。
12．分选纯度：分选纯度指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。
13．长通滤光片：能使特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过的滤光片称为长通滤光片。
14．短通滤光片：与长通滤光片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光被吸收或返回。
15．带通滤光片：带通滤光片允许一定波长范围内的光通过，一般滤光片上有两个数值，一个为允
许通过波长的中心值，另一个为允许通过光波段的范围。如BP500/50表示其允许475nm～525nm波长的
光通过。
16．细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光。
17．零分辨率的流式系统：一般流式细胞仪的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数，不能对细胞形态以亚细胞形态进行分辨，所以
称之为零分辨率的流式系统。
二、选择题
【A型题】
1．B 2．B 3．B 4．A 5．C 6．C 7．A 8．A 9．C 10．B 11．C 12．A 13．D 14．E
15．D 16．C 17．A 18．E 19．A 20．D 21．B 22．E 23．C 24．B 25．E 26．D 27．B 28．E
29．A
【X型题】
1．ABCE 2．ACE 3．ABCD 4．ABCDE 5．AD 6．BCDE 7．AD 8．AC 9．ABCDE 10．ACE
11．ABC 12．ABE 13．B C 14．BD 15．ABD 16．CE 17．CDE 18．BCDE 19．ABCD 20．ABCD
21．ABCE 22．ABDE 23．ABCD
三、简答题
1．简述流式细胞仪生物学颗粒分析原理。
答：经特异荧光染料染色后的样品沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也
向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方
向的激光束垂直相交。染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管接收，经
过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗
原的性质等物理和生化指标。
2．简述流式细胞仪细胞分选原理。
答：当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含
有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电
荷的不同分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电的液滴不发生偏转，垂直落
入废液槽中被排出，从而达到细胞分类收集的目的。
3．流式细胞仪依据什么进行分类? 各类型有什么特点?
答：流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，仪器
的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。科研型既有分析功能又有分选功能，可
快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可将单个或指定个数的细胞分选到特定的容器里，同时可选配多种
波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究。
流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。前者的激光光斑
为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数，不能对细
胞形态和亚细胞形态进行分辨。狭缝扫描流式细胞仪是一种高分辨率的检测仪器，被检细胞直
径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描，根据荧光信号的先后，就可得到一
维的细胞轮廓组方图，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信
息。
4．流式细胞仪主要应用在哪些领域？
答：流式细胞仪主要有下面的应用领域：免疫学、血液学、细胞生物学、肿瘤学、AIDS病检测、
自身免疫性疾病相关HLA抗原的分析和药物学。
5．流式细胞仪的基本结构由哪几部分组成？
答：流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统，激光光源及光束成形系统，光学系统，信号
检测与存贮、显示、分析系统，细胞分选系统等五个部分。
6．流式细胞仪的液流系统的功能？
答：流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动的液体，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
7．流式细胞仪的流动室的作用是什么？
答：流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。
8．流式细胞仪的光源有什么特点？
答：激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，所以激光是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。
9．流式细胞仪的光学系统组成和各种滤光片的作用是什么?
答：流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电子探测器。
滤光片分三类，主要作用是：长通滤光片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过；短通滤光片使特定波长以下的光通过，特定波长以上的光被吸收或返回；带通滤光片允许一定波长范围内的光通过。
10．流式细胞仪所检测的信号有哪些？这些信号所代表的意义和作用是什么？
答：流式细胞仪所检测的信号有散射光和荧光信号。
⑴散射光信号：散射光分为前向角散射和侧向角散射，两个参数组合，可区分经裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
⑵荧光信号：一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的存在和定量。
11．流式细胞仪信号的测量方式和校正方法是什么？
答：流式细胞仪信号的测量方式和校正方法分三类：
（1）荧光信号线性测量和对数测量主要由电子线路完成；
（2）荧光信号的面积的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积，荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞；
（3）光谱重叠的校正采用双激光立体光路技术的四色FCM系统。
12．流式细胞仪分选器的组成和细胞分选原理是什么？
答：细胞分选器由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转三部分组成。通过压电晶体的振动使自喷孔喷出的流束形成水滴，分选逻辑电路根据分选细胞的参数，给含有此参数的细胞液滴充电，充电的液滴经过电极偏转板时，依所带电荷不同而偏向不同的电极板，在电极的下方放置收集容器，便可得到要分选的细胞。
13．流式细胞仪的主要性能指标有哪些?
答：流式细胞仪的主要性能指标有：
（1）荧光测量灵敏度；（2）仪器的分辨率；（3）前向角散射光检测灵敏度；（4）分析速度；（5）分选指标。
14．流式细胞仪操作技术的质量控制主要涉及哪几个方面？
答：流式细胞仪操作技术的质量控制主要涉及三个方面：
（1）光路与流路校正主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值；
（2）PMT校准采用质控品进行PMT校准，必要时进行电压补偿，以便仪器检测灵敏度不会因PMT的放大功率降低而改变；
（3）绝对计数的校准采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。
15.流式细胞仪通常出现的故障及排除方法是什么?
答：流式细胞仪通常出现的故障及排除方法见下表：
故障信息解决方法
清洗液高度错误加清洗液
数据处理速率错误稀释样品
存取数据时发生错误关开计算机重试
程序错误选择主菜单上的重建项
没有激光束检查电源，开激光器
激光器开启错误关激光器门
样品压力错误换一个样品管
建立样品压力错误检查连接，开关机重试
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
一、流式细胞仪技术参数 1 工作条件： 1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ 1.2 环境温度:16-30℃ 1.3 湿度：20-80% 2 用途：免疫分析、淋巴细胞亚群分析；细胞周期分析、凋亡分析；感染分析、肿瘤细胞分析；多重细胞因子分析等。 3 技术规格和参数 3.1 激发系统： 3.1.1 激发光源：405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器，固定光路，空间立体激发。 3.1.2 激光塑形：自动的多棱镜塑形系统，光斑大小：9x65um椭圆形光斑 3.1.3 流动室规格：180x430μm 3.2 荧光收集和检测 3.2.1 光胶耦合物镜，数值孔径1.2，大面积收集发射荧光。 3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元，光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元，避免光谱交叉。 *3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统 3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统，荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片，信号能量损失最小。 3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号，保证弱信号灵敏度。 *3.2.6 共计12个信号检测器，包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。 3.2.7 荧光通道组合：405nm紫色激光器对应3个检测通道，滤光片包
括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm；488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm； 640nm 红色激光器对应3个检测通道，检测滤光片包括：670/30nm、712/21nm、780/60 nm。通道之间最低光谱交叉，滤光片带有智能芯片，直接插拔，自动识别。 *3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF，PE<50MESF(提供英文原版参数)；CFDA检测结果FITC<5MESF，PE<5MESF（提供检测报告）。 *3.3 样本分析速率：>32,000个细胞/秒(提供英文原版参数)。 3.4 变异系数：全峰宽CV<3% *3.5 采用正压上样系统，非注射泵或蠕动泵。样本残留量<0.2%。 3.6 最小样本量：≤30ul 3.7 检测颗粒大小：0.5-50μm 3.8 数字信号处理：18bit动态范围，符合IEEE 32bit浮点分辨率。3.9 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,可区分多倍体细胞、粘连细胞。 3.10 可溶性蛋白分析：具备多重可溶性蛋白分析功能，包括：细胞因子、炎症因子、趋化因子等；可达单管数十重分析，包括：多重定量及动力学分析。 *3.11 液流车：独立液流车，避免振动影响仪器主机光路和液流；自动控制所有压力、鞘液、清洗液等，大体积液体储备保证长时间、稳定工作；鞘液桶20L，废液桶10L，清洗液桶5L，关机液桶5L。开关机自动清洗液路，正常状态鞘液消耗<1.10 L/h，待机状态鞘液消耗<1 mL/h。 3.12 配置淋巴细胞亚群自动分析软件，无需手动设置，实现淋巴细胞亚群分型的全自动化。 3.13 主软件：Windows系统，原版专业化流式数据收集及处理软件, 可按用户需求设置条件进行数据分析和报告。 3.14 临床自动软件：标配临床自动软件，拥有具CFDA认证的4色及6
流式细胞分选技术介绍 流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以每秒钟分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。其应用范围非常广泛，而且还在不断增加。当然，细胞分选也是它的重要应用之一。它能够根据每个细胞的光散射和荧光特征，将特定的细胞从细胞群体中分选出来。每次一个细胞。所以人们又常常将流式细胞仪称为荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activated cell sorter, FACS），其实FACS并不是流式细胞仪的通称，它是BD公司的注册商标。 细胞分选的原理 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 流式细胞分选的特点 1. 少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高（99%以上），速度快。目前，先进的流式细胞仪的分选速度可达25 000个细胞/秒以上，比传统的分选速度提高了很多倍，原来需要一天的工作现在只需要几小时就能完成。不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果细胞量超过109个，则需要耗费10小时以上，分选后细胞的活力会受到很大的影响， 2. 可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行。以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两路分选。现在的仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。 3. 不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光度（如细胞
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 ●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制） ●5L 无菌蒸馏水 ●5L 无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充 分洗涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup 。在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。 按液流控制键RUN。 10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复 操作直至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。 重复操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause，Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无 菌PBS/4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，
流式细胞仪分选技术的好处 流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度。那么流式细胞仪分选技术的好处有哪些?给大家详细的讲解一下。 流式细胞仪分选技术特点 1. 少量细胞分选时，流式细胞分选精确度高(99%不过流式细胞仪分离细胞的量还是有一定的限制，一次分离的最大合理量约为10个细胞。如果细胞量超过10个，则需要耗费10小时以前的流式细胞仪只能给液滴充上正电荷或负电荷，因此在电场中只能向左或向右偏转，即两路分选。仪器可以给液滴充以不同的电量，从而调整液滴的偏转角度，实现多路分选。BD的FACSAria流式细胞仪就可以进行四路分选。 3. 不仅仅限于表面抗原，流式细胞仪可以根据任何能检测到的发光
度(如细胞体积)或荧光(如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原)散射度差异来分离细胞。如果能保证流式细胞仪的无菌状态，那么分选后的细胞还可以进行培养或其他分析。 4. 如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式分选还是比较划算的，只需要准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费即可，不需要购买配套的设备。 流式细胞仪分选技术应用 1、干细胞组织工程在研究。 2、细胞增值、活性和凋亡研究。 3、疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究。
4、基因表达和表达调控研究。 5、细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究。 6、各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究。 7、药理药效和药物开发研究。 8、移植和细胞治疗研究。 9、生物材料对细胞结构、活性和功能的影响等。利用仪器的分选功能分选得到高纯度、高活性的稀有细胞，通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化和移植等进行更深一步的细胞功能和细胞治疗探索，还可以在此基础上逆向进行基因组合蛋白质组相关研究，寻找致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式。
流式细胞仪分析技术及应用题库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的（）. A.鞘液是辅助样本作正常检测的基质液 B.鞘液是用来与样本作对比的 C.鞘液是包裹在样本流周围 D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性 E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞 鞘液是辅助样本作正常检测的基质液，其主要作用是包裹在样本流周围，使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确，同时又防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关（）. A.细胞含量 B.细胞性质 C.细胞大小 D.有否胞膜 E.单核或多核 分选速度与细胞悬液中分选细胞的细胞含量直接相关。一般分析速度为5000～10000；分选速度掌握在1000以下。
问题： [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分，进行定量分析和分选的检测技术，它可以高速分析上万个细胞，并能从一个细胞中测得多个参数，是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的主要组成不包括（）. A.A.液流系统 B.光路系统 C.抗原抗体系统 D.信号测量 E.细胞分选 (天津11选5 https://www.doczj.com/doc/3816720586.html,)
问题： [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分，进行定量分析和分选的检测技术，它可以高速分析上万个细胞，并能从一个细胞中测得多个参数，是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的技术特点不包括（）. A.A.采用鞘流原理 B.以激光作激发光源 C.使用散射光检测 D.检测荧光信号 E.采用电阻抗及化学染色原理
流式细胞仪主要技术参数 1.光学系统： 1.1*激光配置:配置488nm和638nm两根全固态激光器，激光功率均大于等于 50mW以上； 1.2检测参数：可同时激发和检测6色荧光. 1.3光路设计：固定校准的光路设计，智能监控确保激光稳定工作。光学滤光 片可由用户根据实际应用自行更换，无需专业人员调校； 1.4采用专利的FAPD（Fiber Array Photo Detector）能够达到5倍于传统高 性能PMT的光电转换效率； 1.5检测器电压可以调节，以适应不同特性样品的检测，提高实验灵活性； 1.6光信号收集系统, 能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中， 最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集； 1.7*系统具备进一步升级的能力，最高可升级至3激光13色。 2.分析性能： 2.1*颗粒检测能力：可准确区分0.1um、0.2um和0.3um的细胞或微粒； 2.2*荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度少于30 MESF，PE的荧光灵敏度少于10 MESF； 2.3荧光分辨率：CV<3%（G0/G1期最高峰）； 2.4无需微球的绝对计数功能，在检测的同时即可自动计算样本浓度，结果准 确。 3.电子系统： 3.1信号处理精度：24比特原始信息量； 3.2高达107的线性动态范围，可以将强信号和弱信号都完全显示在一张图上；3.3*支持多色荧光信号共同采集，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/ 秒； 3.4荧光补偿：全矩阵荧光补偿，可脱机补偿，离线分析； 4.液路系统： 4.1半自动化上样系统，具有自动混匀和自动清洗功能，降低样本间交叉污染； 4.2液流系统日常维护简单、清洗简便，自带开关机程序；
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞仪主要技术参数： 1.光学系统： 1.1激光器配置:配置488nm ,638nm和405nm固体激光器，功率均≥50mw，激光功率可由 软件实时监控，空间独立排列 1.2▲检测通道设置：488nm激光可激发五色荧光，638nm激光可激发三色荧光， 405nm 激光可激发五色荧光，共13色荧光通道，以及前向角散射光检测通道（FSC）和侧向角散射光检测通道(SSC)。 1.3光路设计：固定校准的光路设计，每根激光间信号独立传播。用户可自行安装开机， 无需专业人员调校 1.4采用最新的的FAPD（Fiber Array Photo Detector）检测器，能够达到5倍于传统高 性能PMT的光电转换效率 2.分析性能： 2.1 ▲荧光灵敏度：FITC的荧光灵敏度≤30 MESF，PE的荧光灵敏度≤10 MESF 2.2 荧光分辨率：CV≤2%（G0/G1期最高峰） 3.电子系统： 3.1 信号处理精度：24比特（16,777,21道）数字信号精度 3.2 高达107的线性动态范围，可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上 3.3 ▲支持多色荧光信号共同采集，15个参数检测时，信号获取速度（上样速度）达到30,000个/秒以上 4.液路系统： 4.1自动化上样系统，具有自动混匀和内外管壁自动清洗功能，降低样本间交叉污染 4.2可支持多种常用的进样管，如5 mL的聚苯乙烯和聚丙烯流式管,1.5 mL 和 2 mL EP管4.3内置自动化的液流系统维护程序，例如开关机程序、启动（初始化）、每日清洗、排气 泡、反冲等全部由自动软件控制。 5.软件功能： 5.1操作系统：Window 7或以上版本 5.2▲支持中英文操作界面，全部采用图形化参数调节 5.3全自动质控程序：内置的质控程序自动检测仪器配置，激光器功率、激光延迟、每个 通道的rCV值、增益值和平均荧光强度等
流式细胞分选技术 一、定义 流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。【晶莱生物】 二、实验原理 当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 三、实验流程（以分选有核红细胞为例） 1.采抗凝血10 ml。 2.密度梯度分离单个核细胞层 （1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 （2）取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000 rpm×20分钟。 （3）离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。 （4）用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 3.免疫荧光染色 将上一步得到的单个核细胞层按1×10/1的比例加入异硫氰酸(FITC)标记的CD71单克隆抗体(鼠IgM)，孵育30 min后重悬于0.5 ml PBS 液中进行荧光染色。 4.FACS分选CD71阳性细胞。[晶莱生物]
流式细胞分选仪（BD Influx） 工作指南 暨南大学生物医药研究院周玉英 2012年06月
第一章流式细胞仪管理使用守则 1. 优先权原则： 本流式细胞分析分选仪器由暨南大学“211”重点学科“生物技术与生物工程药物”学科组所用并使用，故在同一时间段内： ●本校优先于外校使用； ●学科组优先于外单位使用； ●学科组内各单位使用优先权采用轮流制，相关单位优先权周可优先使用。 2. 专人使用原则： ●流式细胞分析仪（Calibur）必须由已培训合格的的实验技术老师或学生严格按照操作规程进行操作。 ●对于流式分选仪Influx，只能由培训合格的课题组负责老师操作，严禁学生操作。 ●课题组负责老师或学生需定期接受培训，培训后合格后若两个月之内未使用仪器，必须再次培训合格后才可使用流式仪。 3. 预约原则： ●请与操作老师沟通后至少提前一天预约，预约时先提交有导师签字的预约表，再由管理人员统一在网上预约。 ●不能按预约时间使用流式时，至少提前一天取消预约，否则将正常收费。 ●不接受提前超过2周以上的预约。 4. 做好使用登记： ●仪器使用完毕后，切记如实进行仪器使用记录登记，管理人员会核对是否与预约记录的一致性。 5. 随时保持清洁： ●进入流式房请更换拖鞋，离开流式房时，请将拖鞋放回鞋柜内。 ●禁止随手乱放杂物（如一次性手套、塑胶手套，用完的样品等）。 ●走前请带走制造的垃圾（包括细胞垃圾、耗材垃圾和生理盐水瓶等）。 ●实验老师在课题组的优先权周实验老每周二、周五下午清洁流式房卫生，包括清洁地面、桌面、倒掉除湿机水箱中的水。
6. 刻录数据： ●刻录数据只能用一次性的CD盘或DVD盘，严禁用自备U盘或可擦写光盘进行数据刻录。 7. 安全使用原则： ●必须严格按照培训时的流式使用规程操作仪器，严禁违规操作。 ●对有毒或有污染的样品需提前对操作老师说明，严禁随处乱放有毒、有污染的样品。 ●仪器使用完毕后，离开房间时，锁好门窗，包括流式房门和725房间的玻璃门。 8. 处罚措施： 请遵守上述规则，管理人员将对使用者进行监督和规范，对违规将进行登记并通报，连续三次违规者，停用整个课题组使用权一周。
高速分选型流式细胞仪 用途 1.临床免疫学的应用：免疫状态的评价、免疫功能监测等。 2. 临床血液学的应用：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、干细胞移植等。 3. 临床肿瘤学的应用：肿瘤患者的免疫功能、粘附分子、细胞的DNA倍 体、细胞周期、肿瘤预后、疗效监测、多药耐药性检测。 4. 血栓与止血的应用：血小板活化、血小板膜糖蛋白、血小板抗体等分析。 5. 骨髓与器官移植的应用：骨髓或脐血的干/祖细胞测定、移植前配型、移植 后的免疫监测。 工作 电力：100/115/230 VAC, 50或60 Hz, 最大功率1500 w 条件 1．检测性能 技术 参数 荧光灵敏度FITC: <125 MESF; PE: <125 MESF 荧光分辨率PI染色CEN样本, G0/G1期全峰宽PI-Area CV < 3.0% (488 nm)； Hoechst染色CEN样本, G0/G1期全峰宽PI-Area CV < 3.5% (407 nm) 荧光线性度：P I染色CEN样本, 双粘体/单细胞比率2 ± 0.05 (488 nm); Hoechst染色CEN样本, 双粘体/单细胞比率2 ± 0.05 (407 nm) 散射光灵敏度：可以有效区分固定血小板和噪音信号, 辨别细菌和0.5 micron 微球 分析速度：100,000细胞/秒。 2. 分选性能 分选速度：70,000细胞/秒 振荡频率：1-100,000 Hz 喷嘴规格：多规格喷嘴 固定位置喷嘴，可拆卸, 可超声清洗，保证液流稳定 分选纯度和回收率：在分选条件70 psi, 90 kHz，获取速度25,000/秒时,做四 路分选: 纯度> 98%, 回收率> 80%。提高分选速度，纯度不受影响。 分选细胞活性：在不同鞘液压力下分选细胞系和人外周血单个核细胞, 分选所 得细胞培养数天后, 细胞均存活, 并有增殖 分选细胞收集：二路分选: 收集管可以使用微量管, 12 ? 75 mm管, 15 mL管; 四路分选: 收集管可以使用微量管, 12 ? 75 mm管;
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用 本章要点 1.流式细胞仪的分析及分选原理 2.数据的显示与分析 3.流式细胞仪免疫分析的技术要求 4.流式细胞术在免疫学检查中的应用 概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 第一节流式细胞仪的分析及分选原理 流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。 一、工作原理 （一）基本组成结构 1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G 水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ，为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
浙江求是招标代理有限公司关于 杭州医学院 流式细胞仪及流式细胞分选仪 招标文件 项目名称：流式细胞仪及流式细胞分选仪 项目编号：QSZB-H-CHZYXZ 采购人：杭州医学院 采购代理机构：浙江求是招标代理有限公司
目录 第一章投标邀请 第二章采购需求 第三章投标人须知 第四章评标办法及评分标准 第五章拟签订的合同文本 第六章投标文件格式
第一章投标邀请 根据《中华人民共和国政府采购法》等有关规定，经浙江省财政厅[]号确认书批准，浙江求是招标代理有限公司受杭州医学院委托，现就流式细胞仪及流式细胞分选仪进行公开招标，欢迎国内合格的供应商前来投标。 一、项目名称：流式细胞仪及流式细胞分选仪 二、项目编号：QSZB-H-CHZYXZ 三、采购组织类型：分散采购委托代理 四、招标项目概况: 项目名称数量单位 简要规格描述 或标项基本概况介绍 预算金额 (万元人民币) 最高限价 (万元人民币) 流式细胞仪套 详见采购需求 流式细胞分选仪套 五、采购需求：详见附件 六、投标人资格要求: 符合《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定的投标人资格条件： （一）具有独立承担民事责任的能力； （二）具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度； （三）具有履行合同所必需的设备和专业技术能力； （四）有依法缴纳税收和社会保障资金的良好记录； （五）参加政府采购活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； （六）法律、行政法规规定的其他条件。 投标人特定资格条件：本项目不接受联合体投标。 七、招标文件的报名/发售时间、地址、方式及售价: .报名/发售时间：年月日至年月日(双休日及法定节假日除外) 上午：:-:、下午：:-: .报名/发售地址：浙江求是招标代理有限公司（杭州市西湖区玉古路号中田大厦楼H室） .方式：现场领售或电子邮件报名 .标书售价：每本元整（售后不退） 备注：招标文件发售截止之后有潜在投标人提出要求获取招标文件的允许其获取，如对招标文件有质疑的应在规定的质疑期限内提出。 八、投标人购买标书时应提交的资料： .报名表（通过电子邮件报名投标人提供word电子版） 报名表下载地址：求是招标网（https://www.doczj.com/doc/3816720586.html,）； .有效的法人或者其他组织的营业执照等证明文件（复印件加盖公章）、自然人的身份证明。 备注： .投标人注册：非浙江政府采购网注册的投标人或发生变更且未及时更新的投标人，应当在规定时间内按照《浙江省政府采购供应商注册及诚信管理暂行办法》（浙财采监字［］号）的相关规定及时办理更新或投标人注册事项; .投标人未在采购代理机构办理报名手续的投标文件予以拒收。 九、投标截止时间：年月日上午:: 十、投标地址：杭州市西湖区玉古路号中田大厦楼求是招标会议室，投标人逾期送达或者未按照招标
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞
流式细胞仪工作原理与应用范围 2008-11-01 10:30 流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开
流式细胞分选术的应用进展 【摘要】流式细胞分选技术具有检测速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点，因而应用广泛。本文简要概述了流式细胞术的概念及流式细胞分选的原理，并对其在肿瘤干细胞分选、外周血细胞分选、染色体分离、稳定细胞转染株筛选等方面的应用进展作一综述。 【关键词】流式细胞；分选；应用 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术，它不仅可以对细胞、微生物等进行检测分析，而且还可以根据颗粒特性进行分选，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大等特点，因而被广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学、药物开发、环境检测、食品卫生防疫等科学研究和工作中[1]。 1 流式细胞术的概念 流式细胞术是20世纪60年代末开始发展起来的技术，它是集激光技术、光电测量技术、电子生物技术、电子计算机技术、流体力学以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。流式细胞仪是应用流式细胞术的有效工具，它使细胞或微粒在鞘液包裹下流动，逐个通过激光聚焦区，并用高灵敏度的光学系统收集各散射光及荧光信号，再经过计算机系统对采集的信号进行存储、显示，从而得以对粒子进行多参数分析，包括诸如粒子颗粒度和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、多分子复合体排列、多价反应动力学等[2]。分选型流式细胞仪一般还有筛分的作用，可以根据所检测颗粒的某种性质进行分选和回收，用于后续功能实验。并且，如果整个分选的过程是在无菌条件下进行的，分选下来的细胞还可以用来继续培养。在我国，20世纪90年代初已开始研发应用流式无菌分选的技术[3]。 2 流式细胞分选的原理 分选型流式细胞仪一般由液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统4部分组成。流式的分选功能是通过鞘液流形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装有一个高速振荡器，该装置在充电后以每秒几万次的振动频率，使鞘液流成为上万个液滴；目前，先进的分选型流式细胞仪震荡速度可以达到10万/s。此时，细胞的荧光和散射光信号已被测量（即判断液滴是否该被分选），这时给鞘液流一个充电脉冲信号，待分选的液滴就全部带上了电荷。流式细胞分选仪的检测分析系统通过分选设门特性迅速判定其是否为靶细胞。当充以不同电荷的含细胞的鞘液滴流经带有正负几千伏恒定静电电场的偏转板时，就根据自身所带的电荷性质产生偏转而落入各自的收集管中，不带电荷的液滴就进入废液槽中，从而实现了细胞的流式分选[4]。 现代高端型流式细胞分选仪每秒可以实时检测定量分析、分选数万个细胞，