链霉菌室实验操作手册（2003年）
第一章培养基抗生素生长因子 (3)
常用抗生素及其使用浓度 (3)
LB（Luria-Bertani）培养基 (3)
LA (3)
基本培养基（MM） (3)
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4)
YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） (4)
TSBY （1L）（液体培养链霉菌） (4)
MS培养基 (5)
2CMY培养基（用于井岗的接合转移） (5)
YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5)
YD培养基 (5)
生长因子补充物的使用浓度 (6)
第二章DNA基本操作 (7)
大肠杆菌质粒的抽提 (7)
酶连反应 (7)
DNA片段凝胶回收 (8)
DNA纯化 (9)
E.coil总DNA的提取 (9)
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10)
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10)
AT克隆（详见说明书） (10)
Southern Blot (11)
第三章PCR及相关技术 (13)
PCR (13)
PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术） (14)
PCR定点诱变（DpnI法） (14)
第四章基因片段转移技术 (15)
大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 (15)
DNA转化 (15)
大肠杆菌质粒的快速检测 (15)
接合转移（详见英文《手册》249页） (16)
链霉菌原生质体的制备 (16)
链霉菌原生质体的转化 (17)
PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17)
第五章RNA操作技术 (19)
链霉菌总RNA的抽提 (19)
链霉菌的RT-PCR（promega RT kit） (19)
第六章蛋白质基本操作技术 (21)
SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色 (21)
大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： (21)
链霉菌总蛋白抽提： (22)
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： (22)
Western Blot (23)
第七章遗传作图相关技术 (25)
链霉菌孢子悬液的制备 (25)
链霉菌中NF的证明 (25)
孢子杂交 (25)
在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 (25)
第八章其他技术 (27)
链霉菌菌种保藏 (27)
检测链霉菌淀粉酶的活性 (27)
第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度
抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度
(mg/ml)
使用终浓度（μg/ml）
链霉菌大肠杆菌
M M2CM Y E M E L A或L B
氨苄青霉素氯霉素
潮霉素
卡那霉素壮观霉素链霉素
硫链丝菌素红霉素
阿泊拉霉素Ampicillin, Amp
Chloramphenicol, Cml
Hygromycin, Hyg
Kanamycin, Km
Spectinomycin, Spc
Streptomycin, Str
Thiostrepton, Thio
Erythomycin, Ery
Apramycin, Am
bla
cat
hyg
aac或aph
aadA
str
tsr
erm E
aac(3)IV
100
25(无水乙醇配)
50
25
50
50
25(DMSO配)
100
50
R
10
10
2?
50
10
5
100
10
R
－
25
50
50
25
10
－
50
R
－
－
－
50
－
2.5
－
50
50-100
25
50
50
50
25
不敏感
20
30-50
*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制
*此表仅供参考！！！
*R表示不敏感
*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio
LB（Luria-Bertani）培养基
胰蛋白胨10g，
酵母抽提物5g，
NaCl 5g，葡萄糖1g，
蒸馏水加至1000ml，
pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）
LA
LB中加入终浓度为 1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需
1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO4 0.5g,
MgSO4·7H2O 0.2g,
FeSO4·7H2O 0.01g,
蒸馏水至1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用
蔗糖103g
K2SO4 0.25g
MgCl2·6H2O 10.12g
葡萄糖10g
Difco酪蛋白氨基酸0.1g
微量元素溶液2ml
Oxoid酵母提取物5g
TES 5.73g
加蒸馏水至1000ml
称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：
KH2PO4(0.5%) 2.5ml
CaCl2·2H2O(5M) 1ml
L-脯氨酸(20%) 3.75ml
NaOH(1M)调pH至7.3
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）
YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）
Oxoid酵母提取物3g
Oxoid蛋白胨Tryptone 5g
麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g
葡萄糖10g
蔗糖＊340g
蒸馏水至1000ml
高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。）
MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L
制备原生质体时，还要加入：
甘氨酸（20%）＊25ml/L
＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
TSBY （1L）（液体培养链霉菌）
Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g
蔗糖＊340g
Oxoid酵母抽提物5g
蒸馏水至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
MS培养基
将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g 琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）
可溶性淀粉10g
胰蛋白胨2g
NaCl 1g
(NH4 )2SO4 2g
K2 HPO4 1g
CaCO3 2g
无机盐溶液* 1 ml
琼脂20g
蒸镏水1000 ml
PH7.2
无机盐溶液(每升)
FeSO4 .7H2 O 1g
MgCl.6 H2 O 1g
ZnSO4. 7H2 O 1g
YMS培养基（阿维，井岗产孢）
酵母抽提物4g
可溶性淀粉4g
麦芽糖10g
CoCl. .6 H2 O 5mg
琼脂20g
蒸镏水1000 ml
PH7.2
YD培养基
酵母抽提物4g
麦芽糖10g
葡萄糖4g
MgCl 2g
CaCl 1.5g
琼脂15g
蒸镏水1000 ml
PH7.2
生长因子补充物的使用浓度
天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表
生长因子补充物的使用浓度表
化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（μg/ml）
组氨酸（Histidine）10 50
其它氨基酸27.5 37
1.5 7.5
腺嘌呤，鸟嘌呤，
胸腺嘧啶，尿嘧啶
维生素0.1 0.5
1.储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4o C保存。
2.对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。
第二章DNA基本操作
大肠杆菌质粒的抽提
苯酚/氯仿溶液抽提法
1.接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2.离心，3000rpm，5min去上清
3.振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I
（50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4.加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合
均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5.加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离
心管中。
6.用120ul氯仿重复操作5。
7.加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8.沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，
-20℃保存。
氯化锂抽提法
1.前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）
2.加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。
3.用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O
（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4.12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离
心8min，去上清。
5.将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）
溶解，-20℃保存。
酶连反应
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶1μl ，连接酶缓冲液1μl ，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。
DNA片段凝胶回收
1试剂盒回收 (离心法)（详见说明书）
(1)在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.
计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)
(2)根据凝胶的浓度,加DE-A 液
凝胶浓度DE-A溶液体积
≤1.0% 3个凝胶体积
≤1.5% 4 个凝胶体积
≤2.0% 5 个凝胶体积
混匀后于75o C加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45o C加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟). (3)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA
片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;
(4)吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高
速度,再离心1分钟,去滤液;
(5)将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
(6)将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有
酒精，应保证瓶子密封。）
(7)将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
(8)将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置
1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1.此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,
溶液的PH要调整到6.5以下.
2.勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴
露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3.2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4.步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热
到60゜C,可提高回收效率。（重要）
5.DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某
种抑制作用。）
2 silica回收
1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2. 加入2-3倍体积的6M KI或NaI（避光4度保存）;
1.65 o C温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;
2.加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀, 冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3.5000rpm离心3分钟, 弃上清;
4.加1ml预冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上洗盐2 分钟，
间断混合;
5.12000 rpm离心10s, 弃上清;
6.重复6,7步骤1次;
7.于50 o C烘箱烘干;
8.加10ul的去离子水用枪头打匀,65 o C水浴15分钟,间断混匀;
9.12000 rpm离心10 s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10.跑胶检测回收效率.
注意事项
＊4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。
＊NEW Buffer：（100ml）
1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。（-20度保存）
＊Silica配法见：TIG January 1995 V ol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.
DNA纯化
用苯酚:氯仿抽提
1.把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:氯仿,
2.混匀,使之成为乳浊状;
3.12000rpm离心, 5 分钟:
4.用枪头把水相移到另一离心管中.
5.加入等体积氯仿并重复2—4
6.用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长
时间沉淀可提高产量）
7.12000rpm离心5分钟,弃液体
8.70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，
9.重复8一次，再12000rpm离心弃液体.
10.50度烘干.
11.去离子水溶解。
LiCl 抽提
1把样品至置于离心管中,加4/5体积10M LiCl
2 室温下静置1分钟
3 12000rpm离心5分钟
4把液体转移到另一离心管中
5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟
往下的步骤同于上面的8-12
E.coil总DNA的提取
1 将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。
2 加500μl水重悬浮，加入500μl 2% SDS, 混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。
3 加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。
4 加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，
6 加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA 沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。
7 用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。
8 烘干，溶解DNA沉淀。
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）
1 将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr 左右至完全溶菌，
2 加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS），立即振荡混合完全，
3 打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min），然后于水浴中冷却至室温，
4 加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。
6 在上清液中加入1/10体积的3M NaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，
7用70%乙醇洗涤沉淀两次,
8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。
另：可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）注：CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5 ul即可。也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。
AT克隆（详见说明书）
所用的载体:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System
1. 酶连
(1)体系10ul
standard Reation Positive control Background control
2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul 5ul pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng) 1ul 1ul 1ul
PCR product Xul --- --- Control insert DNA --- 2ul ---
T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul) 1ul
Deionized water to a final volume of 10ul 10ul 10ul (2).反应4o C过夜
注:PCR产物和载体的摩尔比为:
(ng of vector x kb size of insert)/(kb size of vector)*(insert: vector ration)=ng of insert
一般外源和载体的摩尔比例为3:1
T载体大小为3bkb 50ng
2. 转化
(1)取大肠杆菌感受态细胞100ul, 连接产物2-5 ul 加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20
分钟.
(2)42o C热激90秒.(不要摇动)
(3)立即置冰上3-5分钟.
(4)加1ml SOC培养基(室温)
(5)37o C培养1.5小时(约150rpm摇动).
(6)离心,去上清,余下的混匀涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).
(7)37o C培养16—24小时,挑白斑.
＊所用的培养基:
SOC培养基
胰蛋白胨2g
酵母抽提物0.5g
1M NaCl 1ml
1M KCl 0.25ml
2M Mg2+储液1ml
2M 葡萄糖1ml
* Mg2+储液
MgCl.6H2 O 20.33 g
MgSO4.7 H2 O 24.65g
加双蒸水到100ml,过滤灭菌
* 葡萄糖过滤灭菌
Southern Blot
转膜
1. DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。（注意：TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%~1.0%，电压1~50v/cm）
2. 拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。
3. 去嘌呤：在室温下，把凝胶置于盛有0.25M HCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省略），再用无菌水摇动洗5min 。
4. DNA变性：把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。
5. 中和：把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。
6. 把凝胶放入盛有20x SSC的平皿中，平衡10min。
7. 印迹：用一玻璃板横放于盛有20x SSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20x SSC浸润的3MM 的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20x SSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使凝胶湿润再放膜）。再在尼龙膜上放两张与尼龙膜大小一致的3MM滤纸，然后放一叠吸水纸在滤纸上，再在吸水纸上一平板，平板上放一500g的重物，印迹时间大于2h。
8. 紫外交联：取下重物及吸水纸拿出尼龙膜放在一滤纸上，与胶接触面朝上，放入紫外胶
膜仪中胶联。
9. 用无菌水洗膜10min，如不立即杂交，自然烘干保存。
预杂交及杂交
1. 裁剪一张比尼龙膜稍大的杂交袋，把尼龙膜放入袋中，用封口机先封住三边，放入10ml 预杂交液，赶尽气泡，封口。把杂交袋放入杂交筒中，预杂交时间大于4h,温度65゜C 。
2. 加探针：把探针先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min ，然后把探针加入1ml预杂交液中，剪去杂交袋一角，除去绝大部分预杂交液，加入杂交液，除尽气泡封口，放入杂交筒中65゜C 杂交6~20h。
洗膜
1. 用2 x SSC, 0.1%SDS室温下轻轻摇动洗2 次，5min/次
2. 用0.5 x SSC, 0.1%SDS在68゜C条件下洗膜2 次，5min/次，轻轻摇动（可在杂交筒中进行）
Dig检测
1. 洗膜后，用washing buffer 摇动润洗5min。
2. 用100ml Blocking solution 温育30min，轻轻摇动。
3. 用20ml Antibody solution 温育30min，轻轻摇动。
4. 用washing buffer 轻轻摇动洗2 次，每次15min。
5. 在20ml Detection buffer 中平衡5min。
6. 把膜转到用铂纸包裹的盛有新配置的Colorsubtrate solution的平皿中显色。
7. 用PH 8.0 TE终止反应。
第三章PCR及相关技术
PCR
不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同，PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。
一般的反应体系如：
引物(50pmol/μl) 各1μl 反应终浓度: 各1pmol/μl
模板(约30ng/μl) 1μl 约30ng
Buffer(10?, 含Mg2+) 5μl 1?
dNTPs(10mM) 1μl 0.2μM
高温聚合酶(5U/μl) 0.2～1μl 1－5U
ddH2O
总体积50μl
PCR反应参考程序：
――――――――――――――――时间
Step 1 预变性95-96℃3-8min
Step2 变性94℃50sec
Step3 复性＊50sec
Step4 延伸72℃＊
Step5 2、3、4步骤循环（25次左右）；
Step6 延伸72℃10 min
4℃结束反应（4度长时间保温对PCR仪有较大损伤，一般不超过1小时便及时取出，绝对不允许过夜保温）。
注：
?引物应该用专门的软件（如Primer Premier）认真设计，注意两条引物的Tm值大致相等，GC含量较均一，引物自身以及之间不形成强的二级结构，特别是引物的3’ 端，引物不和模板其他位置形成强的配对（主要看引物3’端）。
?MgCl2浓度依不同的模板和引物而定。MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。
?链霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低复性温度）其浓度可在0~10%之间变化。
?模板为环形质粒时若一次没有扩增出来，可以考虑先用酶将其切成线性再作。
?对高GC含量的模板，预变性的时间也可适当延长，甚至先在沸水中煮5分种，然后迅速放入冰中。如果使用预变性温度高或时间长，一般要使用“热启动”，即在预变性后再加入酶，这样一是可以保护酶，二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。
?现在的PCR仪一般都有“热盖”装置，可以代替原来使用的矿物油，避免PCR过程中水份蒸发到管盖上。
?复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定，提高复性温度可提高扩增的特异性，而当无扩增条带时，可适当降低复性温度。
?延伸时间可根据扩增区域的长度确定，扩增区域越长，延伸时间越长。不同的聚合酶
的延伸速度不一样，具体看说明书，一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp，普通Taq酶每分钟延伸1kb。
?根据不同需要使用不同的聚合酶，尤其当用于扩增表达的基因序列时，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时，由于GC含量越高，模板和引物的二级结构越复杂，延伸和配对越难，PCR反应不好做，可以暂时（2003年7月－）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保证，但扩增效果很好。酶的用量可参考说明书，并不是越多越好。
?LA Taq酶的GC buffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。
PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术）
注：1. 两条模板的量无需太大，因尽量保证1:1。
2. 保证引物之间不会有干扰
3. 四条引物的PCR重组比三条引物的PCR桥重组容易操作。即分别设计引物对两个模板进行扩增，使扩增后两个模板有35-40bp的重叠序列，分别回收两个模板在只有两条外引物的条件下进行常规PCR.
PCR定点诱变（DpnI法）
1. 引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp，设计的突变位点需位于引物中部。
2. PCR反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶；循环次数少，一般为12个循环。
反应体系：
10x pyrobest Buffer 5 ul
dNTP Mixture(10mM) 1ul
模板DNA(5~50ng) 1ul
primer 1 (125ng) 1ul
primer 2 (125ng) 1ul
pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul
加无菌蒸馏水至50ul
3. PCR产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C 冰箱）5min，离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用DpnI酶切）
4. DpnI酶切：Buffer 2ul
BSA（100╳）0.2ul
DNA x ul
DpnI 0.5ul
加无菌去离子水至20ul
30゜C酶切1~4 h ；65゜C 水浴15min 终止反应。
5. 将酶切产物转化大肠杆菌DH5 菌株，利用抗生素筛选突变子。
6. 测序验证
第四章基因片段转移技术
法制备感受态细胞及DNA转化
大肠杆菌CaCl
2
1.挑取保存的感受态细胞在LA平板上划单菌落。
2.挑取长好的单菌落接入到装有5ml LB的universal瓶中，摇床过夜培养。
3.从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态
效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6
4.将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却
5.离心，4℃.5000rpm.3分钟
6.倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30
分或过夜。
7.离心，4℃.5000rpm.3分钟
8.弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。
以上步骤均需注意无菌和低温操作。
DNA转化
1.取100μl感受态细胞和5μl的酶连产物或1-2ul质粒混合
2.冰上静置30分钟
3.42℃热激90秒，然后在冰上放置5min
4.加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部
分上清。（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）
5.涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。
大肠杆菌质粒的快速检测
1.从转化子平板上挑取单菌落，在另一平板上划小方块，37℃扩大培养12小时
2.刮取适量（偏少）的菌体悬浮于30μl快检液I溶液中振荡均匀
3.加入15μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷时先使该溶液预热），立即振
荡混合完全。
4.在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min）水浴时间不宜过长。
5.冷却至室温，直接上样跑琼脂糖凝胶电泳检测（如果菌体过多，则点样时会发现样品很
粘，所以掌握不好时可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，离心的步骤。）
＊如果没有用苯酚处理，看胶时会发现很明显的总DNA的条带，但不影响实验结果的观察。
＊点样时注意点上质粒载体质粒对照，一般在快检时会出现质粒CCC构型的条带，有时也会出现OC构型的。
＊快检液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02％溴甲酚绿
接合转移（详见英文《手册》249页）
1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下,37 o C培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 0.1倍体积的LB悬浮.备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发（一般的接合转移只须做热激）
(1)新鲜孢子悬浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES;
(2)50oC水浴热激10分钟;
(3)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(4)37oC摇床分别培养2-３小时;
（5）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
（6）在振荡器上打散孢子
或只作热激按下面步骤：将适量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培养基，50度处理10分钟，离心，去大部分上清。
5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀(不一定)
6. 30oC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖
6. 30oC培养数天（一般2天）可得到接合转移子.
7. 挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上, 验证;
（作筛选双交换菌株时继续作下面步骤）
8. 直接将得到的接合转移子作影印，寻找单抗的菌株即为双交换菌株。如果得不到，就要通过单交换菌株的松弛培养来得到双交换菌株。得到的单交换接合转移子划线于合适的培养基(含萘啶酮酸，不含别的抗生素)松弛培养;
9. 得到的孢子或菌体稀释涂皿或划单菌落（for Bld菌株）, 影印筛选双交换.
注意事项:
1 不同的孢子热激的温度和时间不同,预培养的时间不同.
2 不同的链霉菌接合转移所用的培养基不同
预萌发培养基
Difco 酵母膏1%
Difco 酪蛋白氨基酸1%
CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)
链霉菌原生质体的制备
1. 在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30度摇床中培养36~40 hr（视具体情况，有时培养24h已足够。）。
2. 将培养物倒入universal中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm离心10 min。
3. 弃上清，将菌丝体悬浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm离心10 min，弃上清。同此法洗两次。
4. 取1 ml菌丝体，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液为50mg/ml P Buffer，终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释），于30度水浴30~60 min（间隔七八分种轻轻摇动）至上清呈乳
状。
5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸几次，继续温浴10 min。（使大量的原生质体释放出来。）
6. 用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000 rpm离心7 min（不用brake档防止其破裂）。原生质体沉淀呈黄色。
7. 弃上清，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm 离心7 min。（此步可省略）
8. 弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。
注：1.. P缓冲液（原生质体转化用）（Okanishi, 1974）
蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液2ml，蒸馏水800ml
灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 缓冲液(pH7.2) 10ml
2．溶菌时间不能过长，否则会使原生质体破裂。离心后若看到很粘的絮状物，则说明原生质体破裂。
链霉菌原生质体的转化
1. 将最多5 ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50 ul原生质体的指型管（1.5 ml）的管壁上（不与原生质体接触）。
2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG应先灭菌，再用P Buffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。
3. 将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。
4. 30度培养14~20 hr后（待原生质体再生后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1 ml 无菌水溶液覆盖。
5. 再培养1~2 d后，可以看到小的转化子菌落长出。
PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化
1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2法。（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30゜C 以下）
2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C摇床培养过夜。
3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4 培养基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌体终浓度为1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统。
4. 30゜C ，200rpm摇床培养3-5h 至OD600~0.6 。
5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C离心5min。
6. 弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,摇匀。
7. 4000rpm 4゜C离心5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作：4000rpm 4゜C 离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。（感受态细胞浓度越高电转效果越好）8. 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ul PCR产物（经纯化，可尽量浓，但不能加得过多），混匀后立即电击，电击条件：200Ω,25uF,2.5kv, 电击结果为4.5~4.9ms
较理想。（电转化杯在70％乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷，无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯，但电击的参数就得变为：1.8 k V，？Ω,?uF）
9. 立即加1ml预冷的SOC，37゜C诱导培养40min（如需在同一库斯质粒上中断基因，则30゜C诱导培养）。
10. 涂LA（含100ug/ml Amp及与电转片段携带的抗性标记相应的抗生素）平板，37゜C过夜培养。（转化子中含有两种质粒，分别是重组前和重组后的质粒，所以要抽质粒再转化一次DH5 ）
第五章RNA操作技术
链霉菌总RNA的抽提
1. 在MS平板上铺上已灭菌的玻璃纸，接种适量的孢子悬液，涂布均匀，30度培养适当时间，刮取菌丝体,在预冷的碾钵中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末状菌丝体小半勺于1.5 ml 的指型管中。加入250 ul的悬浮缓冲液混匀置于冰上。
2*.收集液体培养物(洗过的), 加入溶菌酶溶液（溶菌酶的终浓度为2 mg/ml，用P Buffer 稀释）使终体积250 ul。于30度水浴15 min(原生质体刚开始形成)。
3. 加入70 ul EDTA(0.25M) , 混匀。
4. 加入375 ul的裂解缓冲液充分混匀，溶液呈清亮状。
5. 加入等体积的热酚, 用手震荡混匀, 于65度水浴5 min。(a.水饱和酚应提前于65度加热, 高温下, 酚的溶解度加大。b. RNA在碱性环境中易分解。)
6. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。(室温下, 酚仍有少量与水混溶, 因而上清为乳白色。)
7. 再次加入等体积的热酚, 震荡混匀, 于65度水浴5 min. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。
8. 加入等体积酚/氯仿(1:1), 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。
9. 加入等体积的氯仿, 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。(一定要充分震荡, 以除尽残余的酚, 否则, 酚会对后续实验造成不良影响。)
10.加入1/5体积的LiCl(10M), 两倍体积的无水乙醇, 混匀, 于-20度放置2 hr。
11.于4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉淀。
12.用80%的冰乙醇洗两次（在冰上进行），以将盐离子去除干净。
13.冷冻真空干燥。
14.溶于适当的DEPC处理过的水中，于-70度保藏。
注：1. 所有的枪头、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水处理。DEPC为油状，不溶于水，应充分搅拌，使其均匀分散。
2. 所有操作必须戴上手套，而且手套要经常换。
3. 水饱和酚：将重蒸酚适量装于一密闭瓶中，加入酚的1/2体积的去离子水，混匀，于65℃温浴，使酚充分溶解于水。
链霉菌的RT-PCR（promega RT kit）
反转录：1. 反应体系（50 ul）
模板（去除了DNA的RNA）* ul
引物（可以只是下游引物）（50 pmol/ul） 1 ul
dNTP (10 mM) 1 ul
MgSO4 2 ul
5* buffer 10 ul
AMV 1 ul
H2O 至50 ul
2. 反应程序：
模板、引物和水混合后60(或65)度保温4 min（保证mRNA的强二级结构
完全打开），取出置于冰上再加入其他成分（避免AMV高温失活）。
48℃45 min
95℃ 2 min
4 ℃
5 min
产物于-20℃保藏。
反转录产物可不经纯化直接用于常规PCR扩增。
注：1. 引物设计见常规PCR扩增。但要保证引物之间不会有干扰。
2. 模板中的DNA要去除干净，做好阴性对照。（即以RNA为模板进行相同的反应。）
测序实验室操作手册 文件编号： 版次： 编制： 审核： 批准： 日期：
测序实验室标准操作手册 一、健康中心实验室介绍.............................................................................................. .. (2) 二、实验室管理 (2) 2.1 实验室行为管理 (3) 2.2 实验室出入管理 (4) 2.3 实验室清洁卫生管理 (6) 2.4 仪器试剂使用管理 (10) 2.5 实验室安全管理 (11) 2.6 实验室紧急事故处理 (14) 2.7 实验室物料管理 (15) 三、实验室保密制度管理 (17) 四、测序实验室仪器操作规程 (17) 超净台操作规程.....................................................................................................................18 微量台式离心机使用规程.....................................................................................................20 移液枪使用维护规程.............................................................................................................21 冰箱使用维护规程.. (26) PCR 仪使用规程 (29) 五、高通量测序标准操作规程 (32) 5.1 模板制备标准操作规程 (32) 5.2 上机测序标准操作规程 (41) 六、测序人员考核标准 (47) 七、实验室管理考核标准 (48) 八、测序实验室工作时间表 (50) 九、附录 (50)
供应商操作手册（询价采购）
目录 第一章供应商注册操作 (3) 一．注册操作 (3) 第二章机构管理员基本操作 (6) 一．主要权限 (6) 二．基本操作 (6) 1、初始登录 (6) 2、系统维护 (7) 3、机构资料修改 (8) 4、创建操作员 (9) 5、修改操作员密码 (9) 6、员工权限维护 (9) 第三章供应商操作员基本操作 (10) 一．主要权限 (10) 二．基本操作 (11) 1、初始登录 (11) 2、系统维护 (11) 3、网上申报 (13)
政府采购中心说明： A、实现网上政府采购的操作流程： 开始 机构注册 登记机构管理员用 户名和密码，录入 机构资料信息。 机构管理员登陆 以机构管理员用户 名和密码登陆后， 设置操作员用户名 等信息，并分配操 作员权限 操作员登陆 按机构管理员所分 配的权限，执行网 上查单、网上投标 报价等功能 采购中 心审核 B、阅读时，您可能会遇到以下几个名词： ●网站管理员：指珠海市政府采购网站的业务管理员，为采购中心的工作人员。 ●机构管理员：指各供应商指定本单位的一名工作人员，由其负责本机构在政府采购网站的管理工作，其功能 权权限详见本手册第二章。 ●操作员：各供应商负责网上政府采购具体操作业务的工作人员，可由机构管理员设置一个或多个操作员。 第一章供应商注册操作 一．注册操作 用户可在珠海政府采购网的主页上找到如图1所示的区域，点击注册进入图2所示页面。 图1 图2是一份用户注册的条例，用户注册前必须仔细阅读。在阅读后，如果同意条例的内容，点击“同意” 按钮，进入图3所示的页面。如果不同意条例的内容，点击“不同意”后返回网站首页，注册操作结束。 图2 在图3中，用户可点击页面左上方的链接（如：关于中采网、加盟条约、隐私条约等）查看相关的信息，
【供应链管理】SCM 平台操作手册
SCM智能一卡通管理平台软件操作手册
烟台威尔数据系统有限公司 目录［第一章］概述-1- ［第二章］软件安装-3- 第一节解压软件，安装数据库程序-3- 第二节配置数据库激活注册-4- 第三节配置数据库连接创建数据库-5- 第四节升级程序-7- 第五节执行软件主程序-7- 第六节远程登录系统-7- 第七节登录异常处理-8- ［第三章］人事管理-9- 第一节部门管理-9- 第二节人员管理-10- 第三节批量导入人员照片-12- ［第四章］卡管理中心-15- 第一节定义用户分类-15- 第二节创建账户-17- 第三节卡片初始化-21- 第四节发员工卡-22- ［第五章］消费管理-23- 第一节软件中创建场所-23- 第二节软件中创建设备-24-
第三节指定白名单-26- 第四节设备通讯-26- 第五节卡片充值、补贴-29- 第六节消费机进行消费-31- 第七节读取消费记录-31- 第八节设备交易报表-31- 第九节查看统计报表-32- ［第六章］挂失，提现，退款，退卡流程-33- 第一节卡片挂失-33- 第二节卡片退款-33- 第三节卡片退卡-34- 第四节卡片提现申请-36- 第五节提现审核-37- 第六节提现-38- ［第七章］考勤管理-39- 第一节在软件中建立考勤机-39- 第二节将人员档案写入考勤机-40- 第三节考勤机上为新人员发卡、采集指纹拍照-41- 第四节读取操作日志，将卡号、指纹等信息存入软件-42- 第五节将保存档案、指纹和照片等信息，重新写入考勤机-42- 第六节考勤机正常工作-43- 第七节月末读取考勤机存储的考勤记录和拍照-43-
实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30
注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
1.1系统登录方式 打开IE，在地址栏输入：http://221.232.137.23:3721回车，显示出系统登录页面，用自己的登录口令即可登陆。
1.2IE设置 1.2.1设置受信任站点 如遇到登陆不了的情况，请按以下步骤操作1．从IE的工具栏选择Internet选项 2．在安全标签，选择“可信站点”
3．鼠标点击“默认级别”按钮。点击击“站点”按钮。 4．输入EPMS的访问地址，点击“添加”按钮即可。 5．点击“关闭”按钮，再点击“确定”按钮，设置完成。 注意事项：VISTA下IE7具备一个特殊的保护模式方式，请确保此模式处于未启用状态，否则会对相关操作造成较大的影响。如果加入可信站点，默认是不启用保护模式的。
1.2.2允许文件下载 在安全标签，选择“可信站点”，点击“自定义级别”； 点击“确定”，再点“确定”就设置好了 1.2.3允许弹出窗口 设置允许弹出窗口一般很多IE使用助手都有拦截弹出窗口的功能，我们需允许IE弹出窗
口。IE7本身具有阻止弹出窗口的设置，可按照如下步骤把站点加入允许弹出窗口的列表中：在隐私页签中“弹出窗口组织程序”上，根据个人喜好决定是否启用IE自带的过滤弹出广告窗口功能，如果启用了“打开弹出窗口阻止程序”，请点击“设置”按钮，将需要使用的EPMS 服务器登陆地址添加到允许网站区域中来
1.3工作流基本概念 工作流是把我们需要做的工作分成一个一个的环节，每个环节由相应的人员去做，环节一次一个一个往下走，直到工作完成。 工作流的每个环节都有相应的参与者（也就是应该做这个事情的人），只有有权限做这个事情的人才能处理该环节。 每个环节只有等上一个环节结束后，下一个环节才会启动。 每个可以处理的环节，我们称之为一个工作单，工作单有待签收，待处理，已完成，已终止几个状态。 待签收的工作单：每当一个环节启动时，此工作单就是待签收的状态，这时，所有有权限处理该工作单的人员都可以在自己的任务列表里看到此工作单。 待处理的工作单：点击处理或者双击一个待签收的工作单，就签收了此工作单，此工作单的状态改为待处理，待处理的工作单只有签收人可以看到并处理，其他人看不到也不能签收。 当这个环节传递后，该环节的工作单置为已完成的状态。 费正常情况终止了该环节，该工作单将会是终止的状态。 当一个工作流的所有环节都完成了，该工作流也就结束了。 1.4订单状态 已制单:订单刚制定出来就是此状态 已下单：烟厂人员下单了，等待供应商回执 已确认：供应商回执了该订单，并传递了回执环节 执行中：供应商发货了，但是还没有全部入库 已终止：订单执行数量等于入库数量了，但是不等于订单数量，也就是发生了退货并且没有退的货都入库了 已完成：订单数量全部入库了 已作废：手工作废了订单 1.5结算相关定义: 结算入库单：每张入库单会生成一张结算入库单，是一一对应的关系，根据结算入库单通知供应商，仅用于通知供应商。 结算单：结算的依据，由供应商勾选已通知的结算入库单而生成。 结算入库单状态： 未通知：刚入库，还没有通知供应商的单据；
《生物制药技术》实验指导 实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型） 实验目的： 1、学会培养基的配制 2、掌握灭菌方法。 实验原理： 金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。 放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。 四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。四环素早在1948年即开始用于临床，至今已有50余年历史。现在四环素已被收入中国药典2005版，还被收入美国、英国、日本等许多国家的药典。上世纪70～80年代四环素产销处于全盛时期，我国有上百家企业生产，临床用量很大。多年来由于四环素类的广泛应用，临床常见病原菌对金霉素耐药现象严重。1950年，国外有报道四环素族药物引起牙着色，病因是在牙的发育矿化期服用四环素族药物，可被结合到牙组织内，使牙着色。四环素还可在母体通过胎盘引起乳牙着色。其后又后续报道四环素沉积于牙、骨骼以至指甲等，而且还能引起釉质发育不全。在这方面，国内直至70年代中期方引起注意。自20世纪80年代后期起，因细菌耐药性增加以及新的抗生素大量上市等原因，四环素产销逐渐萎缩，市场疲软。因为副作用大，只外用，用于治疗结膜炎、沙眼。 材料、试剂和器材： 试剂： NaBr母液（100 g／L） KCl母液（100 g／L） M-促进剂母液（2.5 g／L） 器材：
实验室操作规范 本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规范的基础。在规划实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全 的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。下面列出了一些 最重要的概念。 进入规定 1在处理危险度2级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图1）。 2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。 3、实验室的门应保持关闭。 4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。 5、进入动物房应当经过特别批准。 6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。 人员防护 1在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。 2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物 的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。 3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。 4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。 5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆、员工休息室和卫生间）。 6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。 7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。 8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。 9、在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。 操作规范 1严禁用口吸移液管。 2、严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。 3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。 4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。 5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。 6、必须制订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。 7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。 8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。 实验室中标本的安全操作 实验室标本的收集、运输和处理不当，会带来使相关人员感染的危险。
供应链操作手册 1.1 系统参数....................................................................................................................... 1.1.1 供应链整体选项................................................................................................. 1.1.2 单据设置............................................................................................................. 1.1.3 打印设置............................................................................................................. 1.2 基础资料....................................................................................................................... 1.2.1 会计科目............................................................................................................. 1.2.2 计量单位............................................................................................................. 1.2.3 仓库..................................................................................................................... 1.2.4 客户/供应商........................................................................................................ 1.2.5 物料..................................................................................................................... 1.3 初始数据录入 ............................................................................................................. 1.4 结束初始化.................................................................................................................. 2.1主控台与主界面............................................................................................................... 2.1.1主控台编辑................................................................................................................. 2.1.2常用功能设置............................................................................................................. 2.2单据制作(以外购入库单为例) ..................................................................................... 2.2.1手工录入..................................................................................................................... 2.2.2关联源单生成............................................................................................................. 2.2.3下推生成..................................................................................................................... 2.2.4单据打印..................................................................................................................... 2.3单据查询(序时簿查询) ................................................................................................... 2.3.1...................................................................................................................................... 2.3.2序时簿维护................................................................................................................. 2.4报表查询 ............................................................................................................................ 3.1参数设置 ............................................................................................................................ 3.2采购管理流程 ................................................................................................................... 3.3日常业务处理 ................................................................................................................... 3.3.1单据录入..................................................................................................................... 3.3.2钩稽(入库成本确认) ..................................................................................................
链霉菌室实验操作手册（2003年） 第一章培养基抗生素生长因子 (3) 常用抗生素及其使用浓度 (3) LB（Luria-Bertani）培养基 (3) LA (3) 基本培养基（MM） (3) R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4) YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） (4) TSBY （1L）（液体培养链霉菌） (4) MS培养基 (5) 2CMY培养基（用于井岗的接合转移） (5) YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5) YD培养基 (5) 生长因子补充物的使用浓度 (6) 第二章DNA基本操作 (7) 大肠杆菌质粒的抽提 (7) 酶连反应 (7) DNA片段凝胶回收 (8) DNA纯化 (9) E.coil总DNA的提取 (9) 链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10) 去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10) AT克隆（详见说明书） (10) Southern Blot (11) 第三章PCR及相关技术 (13) PCR (13) PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术） (14) PCR定点诱变（DpnI法） (14) 第四章基因片段转移技术 (15) 大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 (15) DNA转化 (15) 大肠杆菌质粒的快速检测 (15) 接合转移（详见英文《手册》249页） (16) 链霉菌原生质体的制备 (16) 链霉菌原生质体的转化 (17) PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17) 第五章RNA操作技术 (19) 链霉菌总RNA的抽提 (19)
说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50mg/ml的母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10mg/ml的储存液。 3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1）Day1：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；
实验室生物安全实施标准操作规程 1、目的：预防与控制院感管理工作达到预期目标，防止医务人员发生职业暴露。 2、适用范围：检验部门工作人员。 3、定义：无 4、管理要求： 4.1进入规定 4.1.1在实验室入口处应贴生物危害警告标志。注明病原微生物、实验室生物安全等级和负责人电话。 4.1.2未经许可，非授权人员不应进入实验室。 4.1.3. 实验室门应保持关闭状态。 4.1.4. 与实验室工作无关的动物、个人衣物不应带入实验室。 4.2.个人防护 4.2.1.工作服 4.2.1.1. 在实验室工作时，应穿着工作服。 4.2.1.2. 不应穿着实验室工作服离开实验室。 4.2.1.3. 实验室工作服不应与日常服装放在一起。 4.2.2.手套 在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性材料的操作时，应戴上合适的手套。脱手套后应洗手。用过的一次性手套应丢入感染性医疗废物袋内。 4.2.3.洗手 脱手套后以及离开实验室前，都应洗手。 4.2.4.其他防护 4.2.4.1. 当有可能受到喷溅物污染、碰撞或人工紫外线辐射伤害时，应戴合适的护目镜。 4.2.4.2. 不应再实验室内穿露脚趾的鞋子。 4.2.4.3. 不应在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理接触镜（隐形眼镜）。 4.2.4.4. 不应在实验室工作区域内储存食品和饮料。 4.3.实验室工作区 4.3.1. 实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。 4.3.2. 每天工作结束后，应消毒工作台面和生物安全柜台面。活性物质溅出后要随时消毒。 4.3.3. 所有受到污染的材料、标本和培养物应废弃于医疗废物容器内，不得与普通垃圾混放。需要清洁再利用的材料，应先压力蒸汽灭菌处理。 4.3.4. 需要带出实验室的手写文件应保证在实验室内没有受到污染。 参考文献：[1] WHO. 实验室生物安全手册,第3版.2004. 5、标准无 6、流程（无） 7、表单（无） 8、相关文件 8.1参考文献：[1] 中华人民共和国卫生部. 公共场所集中空调通风系统卫生规范[S].2006. [2] 中华人民共和国卫生部.医院空气净化管理规范[WS/T 368-2012].
实验室管理和使用操作手册
实验室管理和使用操作手册 一、做好实验室的布置 1、门牌 2、管理制度 3、标语 4、课程表、座位表 管理规范 实验室内的各种配套设施要巧安排，要适合实验室管理与使用的要求，做到布局合理，整齐划一。如在实验教学及仪器药品保管过程中会产生各种有害气体，因此实验室都要建立良好的通风排气装置，以便及时把有害气体排出室外。中小学一般采用比较经济的排气扇通风装置，有条件的学校应采用先进的、吸气能力强、噪声低的管道汇流式通风装置。实验教师要经常检查通风设施，检查是否完好，发现问题及时采取相应措施。实验室应配备废液处理装置，实验中废液应收集，经集中处理后排入污水管道；防火设施到位；实验室前后标语与环境相符；实验室有关制度齐全；课程表、座位表张贴醒目。 二、做好实验设备的管理 1、安全管理：水、电、消防、危险品、防
潮、防尘、防霉 2、实验设备管理:教师演示台学生分组实验台、准备台、凳子、水槽、综合布线、仪器柜、药品柜、标本柜 管理规范 （一）仪器橱窗的管理 存放仪器的橱柜要色调一致，摆放整齐，仪器橱摆放时应注意采光、通风、美观和方便等要求，同时还应考虑便于仪器分类存放。一般情况下仪器橱呈一字形排列，橱门要与窗户垂直，便于通风。各排仪器橱之间要留有不少于1 米的通道，便于取放。仪器橱一般不要靠墙摆放，非靠墙不可的，橱与墙之间应留有10cm 左右的通风空间。一般新旧仪器橱要相对分开，高矮、式样相近的仪器橱要放在同一排或同一室。仪器橱定位后要编序号，序号一般编在仪器橱正面上方。 （二）实验桌凳的管理 学生实验桌应排列整齐，色调一致，每张实验桌应编有序号。要教育学生爱护实验桌、凳，不要在实验桌、凳上乱涂乱写，实验完成后要保持桌面的洁净。 （三）实验室水电设施的管理
用友U8＋V12.1财务及供应链 （总账报表固定资产应收/应付款管理采购销售库存存货核算） 操作手册 2016年5月28日星期六
目录 一、总账日常业务处理 (4) 1.1 进入用友企业应用平台 (5) 1.2 填制凭证 (6) 1.3 修改凭证 (9) 1.4 作废删除凭证 (10) 1.5 审核凭证 (10) 1.6 取消审核 (11) 1.7 主管签字 (12) 1.8 凭证记账 (12) 1.9 取消记帐 (13) 1.10 月末结转收支 (14) 1.11 结帐 (14) 1.12 取消结帐 (15) 1.13 账薄查询 (15) 1.13.1 总账查询 (15) 1.13.2 明细账查询 (16) 1.13.3 往来账查询 (16) 1.13.4 多栏账查询 (17) 1.13.5 余额表查询 (17) 1.13.6 科目汇总表查询 (18) 1.13.7 凭证查询 (18) 1.14 财务报表 (18) 二、固定资产管理 (21) 2.1 系统概述 (21) 2.1.1 功能概述 (21) 2.1.2 固定资产管理系统与其他系统的主要关系 (21) 2.1.3 固定资产管理系统的业务处理流程 (21) 2.2 固定资产管理系统日常业务处理 (22) 2.2.1 初始设置 (22) 2.2.2 日常处理 (23) 2.2.3 期末处理 (26) 三、应收/应付管理 (28) 3.1 设置 (28) 3.1.1 基本科目设置 (28) 3.1.2 期初余额录入 (29) 3.1.3 账套参数设置 (30) 3.2 应收单据处理 (31) 3.2.1 应收单据录入 (31) 3.2.2 应收单据的审核 (32) 3.3 收款单处理 (32) 3.4 核销处理 (35) 3.5 转账处理 (35) 3.6 汇兑损益 (37) 3.7 制单处理 (39) 3.8 凭证查询 (43) 3.9 账表管理 (45)
1. 链霉菌总DNA提取 讲义 1。1 菌丝体 用YEME、TSB、TSBY培养，蔗糖浓度：34% SCO, Slividans，分散菌丝体; 10 % 其他菌种，有的不适于在高糖条件下生长。 是否污染：闻气味；看清汤。 1。2 DNA提取 NaOH使线形DNA变性 苯酚不能除去多糖，使上清不澄清，此时可用盐析法除多糖和蛋白质。 注意：菌丝体用量不能多。 SDS量：2%SDS与溶菌酶溶液等体积。 乙醇（2X）沉淀：特异性优于异丙醇，然而体积大。-20?C，1 hs, 或 4?C，O/N，时间越长越好，可用于长距离携带。 异丙醇沉淀时间：=< 10 MIN,room temperature,不能置于 4?C， -20?C A 溶菌：菌丝体用量不能多！需溶菌酶，作用时间可长可短，溶菌完全即可，但不能O/N 溶菌酶溶液用缓冲液配，高渗或等渗：原生质体同步裂解，在不需要时不裂解。 菌丝体培养基中加入甘氨酸，使肽聚糖骨架变松，对溶菌酶更敏感。 B CDEFGHIJ SDS法
2.9.1 链霉菌总DNA少量快速提取 收集链霉菌菌丝体并用10.3%蔗糖洗涤1次，将100ul菌丝体在eppendorf离心管中用TE洗涤1次, 于菌体沉淀块中加入500ul溶菌酶溶液, 用自动移液器吸管头快速、强烈抽吸以悬浮和裂解细胞直到溶液变粘稠。加入50ul 20% SDS,（或100ul 10% SDS）混匀, 37℃保温10分钟后, 加入0.5倍体积的中性苯酚/氯仿, 混匀后离心, 向上清液加入0.1倍体积NaAC(pH4.8)和等体积异丙醇, 颠倒混匀, 将白色絮状沉淀挑出到70%乙醇中洗涤, 离心, DNA沉淀块再分别用70%乙醇和无水乙醇洗涤后溶解在适量TE缓冲液中。 2.9.2 大片段链霉菌总DNA提取(用于构建基因文库) 适量的菌丝体(50ml液体培养物), 溶于10ml含2mg/ml溶菌酶的LRTE溶液(2mg/ml溶菌酶, 25mM Tris-HCl pH8.0), 100mM EDTA (pH8.07, RNase 50ug/ml)中, 37℃溶菌至溶液清澈透亮。加入蛋白酶E至终浓度为0.2mg/ml, 小心轻轻混匀, 30℃, 30分钟, 加入20%SDS 至终浓度为1%, 立即轻轻倾斜混匀, 37℃水浴2小时。冷却至室温, 加入等体积中性苯酚, 轻轻混匀(约需10分钟), 使液体均一相形成乳浊液, 5000g离心15分钟, 用大口径移液管转移上清液, 根据中间蛋白质的多少, 重复使用中性苯酚抽提。经中性苯酚抽提了的上清液, 再用氯仿抽提两次。最后向上清液中加入0.4倍体积的7.5M NH4AC和两倍体积的无水乙醇, 小心转动离心管以充分混匀, DNA立即形成白色絮状沉淀。小心挑出絮状沉淀团到5ml 70%乙醇中洗涤两次, 再用无水乙醇洗涤1次, 自然风干(勿使沉淀完全干燥, 否则极其难溶), 加入适量TE缓冲液, 4℃过夜溶解DNA。经脉冲电场凝胶电泳检测发现用这种方法提取的总DNA片段在90-160kb之间。
实验四细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的细胞形态与菌落形态观察 实验四细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的细胞形态与菌落形态观察 一、实验目的 1．观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。 2．放线菌、酵母菌和霉菌的细胞形态观察。 二、实验原理 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、实验材料和用具 圆褐固氮菌，枯草芽孢杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉的单个菌落平板，白色葡萄球菌（Staphyloccus albus）；Bouin氏固定液， 0．01％结晶紫溶液，酒精等。 显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环。 四、操作步骤 （一）四大菌落的形态观察 观察圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉的单个菌落特征，并按实验菌落特征描述的方法记录结果。 （二）放线菌的形态观察 用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。
然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 （三）霉菌的形态观察 1．粘片观察： 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。 2．假根观察： 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。 （四）酵母菌的形态观察 酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定 1．以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。 2.取 0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。 3.在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 死亡率=死细胞总数／死活细胞总数×100% 五、注意事项