中南大学学报（医学版）
J Cent South Univ (Med Sci)
2014, 39(2) htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,; htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,
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大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达
严思敏1，吴双1，孙丽2，蒋碧梅2，涂自智2，肖献忠2
(中南大学湘雅医学院 1. 2008级临床医学系；2. 病理生理学系，长沙 410078)
[摘要]目的：探讨腹主动脉缩窄致压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中核仁素的表达情况。方法：采用体质量180~220 g SD 大鼠40只，随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组，利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加心肌肥厚模型，分别于术后2周、4周观察心脏质量指数、左心室质量指数；采用RT-PCR 检测心肌组织中β-MHC mRNA 的表达；采用Western 印迹检测心肌、脑、肾组织中核仁素的表达情况。结果：腹主动脉缩窄模型组4周以后心脏质量指数、左心室质量指数较假手术组显著增加(P <0.01)；4周以后心肌组织中β-MHC mRNA 的表达较假手术组显著升高(P <0.05)；2周以后心肌组织中核仁素蛋白的表达较假手术组显著升高(P <0.05)，而在脑、肾组织中无明显升高。结论：核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达上调，表明核仁素可能参与了压力负荷增加心肌肥厚的发生发展。
[关键词] 核仁素；心肌肥厚；大鼠；压力负荷增加
Expression of nucleolin in pressure overload-induced
cardiac hypertrophy rats
YAN Simin 1, WU Shuang 1, SUN Li 2, JIANG Bimei 2, TU Zizhi 2, XIAO Xianzhong 2
(1. Clinical Medical Major, Grade 2008; 2. Department of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, China)
ABSTRACT Objective: To detect the expression of nucleolin in cardiac hypertrophy rats induced by pressure
overload.
Methods: A total of 40 SD rats with body weight 180 g and 220 g were recruited and randomly
divided into 2 groups: a transverse aortic constriction (TAC) group and a sham surgery group. Cardiac hypertrophy model was employed by transverse aortic constriction surgery. Th en 2 weeks and 4 weeks aft er the experiment, the heart mass index (HMI), left ventricle mass index (LVMI) were measured. β-MHC mRNA in the heart tissue was detected with RT-PCR. Nucleolin in the heart, brain and kidney was respectively detected with Western blot.
收稿日期(Date of reception)：2013-04-02
作者简介(Biography)： 严思敏，主要从事心肌的内源性保护的研究，现为湘雅二医院心胸外科硕士研究生。通信作者(Corresponding author)：蒋碧梅，Email ：jiangbimei@https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,
基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金(81170113)；教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-12-0545)。This work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (81170113) and Education Ministry's New Century Excellent T alents Supporting Plan, P . R. China (NECT-12-0545).
DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.02.003
htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,/xbwk/fi
leup/PDF/201402124.pdf
大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达严思敏，等125
心肌肥厚是心肌对各种心血管刺激因子如血流动力学负荷、生长因子以及激素等的适应性反应，是心肌细胞体积增大和蛋白含量增多为主要特征的代偿反应[1]。临床研究[2-5]发现预防或逆转心肌肥厚能明显改善患者的预后，但如何预防及逆转心肌肥厚的发生成为现在研究的热点。核仁素为一种重要的RNA结合蛋白，是目前发现的271种核仁蛋白质中含量最多的一种，约占核仁蛋白质总量的10%。它具有多种生物学功能，包括调控核糖体的生物合成与成熟，调控细胞增殖、生长、胚胎发生等过程。近年来的研究[1]发现核仁素是一个心肌保护蛋白，然而，核仁素在心肌肥厚的发生发展中是否起作用，目前还不清楚。本研究探讨核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达，为进一步研究核仁素在心肌肥厚发生发展中的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
RIPA中性裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗核仁素单克隆抗体购于美国Sigma-Aldrich公司，辣根过氧化物抗兔IgG，DAB显色试剂盒为武汉博士德生物技术公司产品。
1.2 动物及分组
清洁级雄性SD大鼠40只，体质量180~220 g，由中南大学实验动物中心提供，随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组(模型组)。腹主动脉缩窄模型组大鼠麻醉后(水合氯醛0.8~1.0 mL 腹腔注射)沿腹中线打开腹腔，将肠管轻轻推开，暴露后腹膜，于右肾动脉上方分离长约3 mm的腹主动脉，穿单线，放置1根7号针管，结扎腹主动脉，拔出针管，制备腹主动脉缩窄模型。假手术组除了结扎以外，其余操作均同模型组。
1.3 心脏质量指数(HWI)、左心室质量指数(LVMI)测定
末次给药后禁食24 h，称量体质量，麻醉后迅速开胸取出心脏，剪去心脏周围组织和血管称取全心质量，计算HWI=全心质量(HW)/体质量(BW)，然后去除左右心房、右心室游离壁，将左心室加室间隔准确称重作为左心室质量，计算LHWI=左心室质量/体质量，来判断心肌肥厚程度。
1.4 β-MHC 的mRNA 检测
用T R I z o l方法抽提心肌组织中总R N A[6]。以G A P D H为内参，通过R T-P C R 方法进行检测[6]。G A P D H上游引物为：5'-G C T G A G TAT G T C G T G G A G T-3'，下游：5'-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3'；β-MHC上游引物为：5'-CTGGCACCGTGGACTACAAC-3'，下游：5'-CGCACAAAGTGAGGATAGGGT-3'，扩增产物约270 bp，均由上海生物工程公司合成。
1.5 免疫印迹分析
称取组织质量，按每100mg组织加1m L的比例加入R I PA中性裂解液和PMSF(按每1 g组织30 μL)，冰上孵育30 min后，用组织匀浆器于冰上研磨。将研磨液移入离心管，于4 ℃以14 000 r/min 离心30 min，取上清液收集组织总蛋白。分装后置于-80℃冰箱保存备用。取30 μg蛋白裂解液，加入等体积2×SDS电泳加样缓冲液混合，100 ℃煮沸10 min。样品经12% SDS-PAGE电泳分离，电转移法将胶上蛋白质转至醋酸纤维膜上。用封闭缓冲液(2% BSA，50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH7.5)室温下封闭4 h。然后加入兔抗核仁素单克隆抗体(1:1 000稀释)于摇床上，室温下孵育2 h。
Results: Compared with the sham surgery group, HMI, LVMI in the TAC group increased significantly (P<0.01) 4 weeks after the surgery; the expression of β-MHC mRNA in the heart
tissue increased (P<0.05) in the TAC group 4 weeks after the surgery; and the expression of
nucleolin protein in the heart tissue of the TAC group was remarkably upregulated (P<0.05) 2
weeks aft er the surgery, with no change in the brain and kidney tissue between the 2 groups.
Conclusion: Expression of nucleolin protein has been upregulated in response to pressure overload, which may suggest that nucleolin plays a role in cardiac hypertrophy induced by pressure
overload.
KEY WORDS nucleolin; cardiac hypertrophy; rat; pressure overload
中南大学学报(医学版), 2014, 39(2) htt
p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,; htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html, 126用洗膜液洗去一抗后，加入辣根过氧化物酶偶联
的抗兔IgG 二抗(1:1 000稀释)于摇床上，孵育1 h ，洗膜液洗去二抗。用DAB 显色，进行灰度扫描及定量分析。GAPDH 抗体作为内对照。
1.6 统计学处理
采用SPSS13.0 统计软件分析，所有数据以均数±标准差(x ±s )表示，两组间比较采用t 检验。检验水准为α=0.05，P <0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 大鼠尾动脉压、HWI 及LVMI 比较
与假手术组相比，模型组2周以后大鼠尾动脉压、心脏质量指数及左心室质量指数有所升高，4周以后明显升高(P <0.01，表1)。
表1 各组大鼠2周及4周尾动脉压、HWI 及LVMI 的改变(x ±s )
Table 1 Changes of tail artery blood pressure (TaBP), heart mass index (HMI) and left ventricular mass index (LVMI) in the rats at 2 and 4 weeks (x ±s )组别TaBP/kPa
HMI
LVMI
假手术组 2周
13.39±2.15 3.04±0.17 1.87±0.124周
14.14±2.56 2.94±0.21 1.93±0.11模型组 2周
17.84±2.39 3.39±0.22 2.24±0.16
4周
20.59±3.04**
3.96±0.25** 2.87±0.15**
与假手术组比较，**
P <0.01
2.2 心肌组织中β-MHC mRNA 的表达
与假手术组相比，模型组2周时心肌组织中β-MHC mRNA 的表达无明显增加，4周时心肌组织中β-MHC mRNA 的表达明显升高(图1)。
图1 RT-PCR 检测心肌组织中β-MHC mRNA 的表达
Figure 1 RT-PCR analysis shows the expression of β-MHC mRNA in cardiac muscles
**
P <0.01 vs the sham group
2.3 心肌组织、大脑、肾脏中核仁素的表达
收集各组的左心室心肌组织，提取总蛋白，采用Western 印迹检测，与假手术组相比，模型组2周、4周左心室心肌组织中核仁素的表达均明显上调(图2)。
图2 Western 印迹检测心肌组织中核仁素蛋白质的表达Figure 2 Western blot analysis shows the expression of nucleolin protein in cardiac muscles
**
P <0.01 vs the sham group
同时，收集各组的大脑及肾组织，提取总蛋白，采用Western 印迹检测，与假手术组相比，模型组2周、4周大脑及肾组织中核仁素的表达无均明显上调(图3，4)。
图3 Western 印迹检测大脑组织中核仁素蛋白质的表达Figure 3 Western blot analysis shows the expression of nucleolin protein in brain tissues
图4 Western 印迹检测肾组织中核仁素蛋白质的表达Figure 4 Western blot analysis shows the expression of nucleolin protein in kidney tissues
灰度比值：1.00±0.311.18±0.26 1.43±0.30
1.47±0.33
核仁素模型组GAPDH
2周2周4周4周
对照组灰度比值： 1.00±0.120.96±0.31
3.17±0.54
3.77±0.61**
核仁素模型组GAPDH
4周4周
2周2周对照组4周灰度比值： 1.00±0.26 1.08±0.11 1.37±0.48 3.11±0.42**
β-MHC GAPDH
模型组
4周2周2周
对照组0.95±0.22
灰度比值： 1.00±0.27 1.17±0.24
1.27±0.29
模型组
核仁素GAPDH
2周2周4周
4周对照组
大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达严思敏，等127
3 讨论
本研究采用腹主动脉狭窄，增加心脏压力负荷，制备大鼠心肌肥厚模型，发现腹主动脉狭窄增加压力负荷4周后，大鼠心脏指数、左心室指数明显增加，心肌组织中β-MHC mRNA的表达明显上调，说明压力增加大鼠心肌肥厚模型制备成功。
心肌肥厚是临床上多种疾病伴有的病理改变，逆转心肌肥厚能明显改善患者的预后[7-8]。因此，探讨心肌肥厚发生、发展的病理生理学机制，对临床诊断与治疗有重要意义。近年来，随着心肌肥厚发生和发展机制的深入研究，人们逐渐认识到心肌肥厚受多种因素的影响[7-10]，其中一个重要的因素是压力负荷的增加。压力负荷增加可促进cAMP增加，磷脂酶C激活、心肌细胞钙离子通道打开等机制促进基因的表达、蛋白质的合成增加及肌球蛋白重链改建而导致心肌肥厚的发生。然而心肌肥厚的发生机制复杂，是否有其他基因在心肌肥厚发生、发展中起作用，还有待于进一步研究。
本研究采用Western印迹检测了压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中心肌核仁素的表达情况，结果发现，与假手术组相比，模型组2周、4周时左心室心肌组织中核仁素的表达明显上调，此外，还发现脑组织、肾组织中核仁素的表达无明显增加。研究[3]发现核仁素在细胞增殖、生长方面发挥重要的功能。在健康的成年哺乳动物的心肌组织中，大部分的心肌细胞是不能够分裂的，所以压力负荷增加所致的心肌肥厚主要通过心肌细胞肥大来实现，这种适应性的变化则牵涉到细胞体积的增大，蛋白质合成的增加，某些基因(c-fos，c-jun，Egr-1，jun-B，Nur-7)表达的上调以及胚胎期基因的重新表达[11]。核仁素是一种RNA结合蛋白，可通过与多种基因的mRNA结合，从而调控mRNA的稳定性。在抑制氧化应激所致H9C2心肌细胞的凋亡中被证实可与Bcl-2，Bax，Bak，p53，HSP70，HSP25，HSP90，p21，XIAP，SURVIN，HOX1等多个凋亡相关基因的mRNA结合[6]；并通过与上述凋亡相关基因的mRNA相结合而发挥其抑制细胞凋亡的作用。由于核仁素具有促进细胞增殖、信号转导[12]、调控mRNA的稳定性[13-15]、参与细胞应激反应[11,16]等作用，而本研究发现核仁素只在肥大的心肌细胞中表达增高，在其余的组织中表达水平无明显改变，心肌组织中表达上调的核仁素必然会引起下游反应；提示核仁素可能在心肌肥厚发生早期发挥重要的作用，但核仁素在心肌肥厚中起什么作用及如何发挥作用，尚有待进一步深入研究。参考文献
1. Gradman AH, Alfayoumi F. From left ventricular hypertrophy to
congestive heart failure: management of hypertensive heart disease [J].
Prog Cardiovasc Dis, 2006, 48(5): 326-341.
2. Ginisty H, Sicard H, Roger B, et al. Structure and functions of
nucleolin[J]. J Cell Sci, 1999, 112 ( Pt 6): 761-772.
3. Srivastava M, Pollard HB. Molecular dissection of nucleolin's role in
growth and cell proliferation: new insights[J], FASEB J, 1999, 13(14): 1911-1922.
4. 王慷慨, 蒋磊, 鄂顺梅, 等. 核仁素表达下调对C2 C12细胞增殖与
凋亡的影响[J]. 中南大学学报: 医学版, 2005, 30 (2): 125-129.
WANG Kangkai, JIANG Lei, E Shunmei, et al. Eff ect of nuleolin down-regulation on the proliferation and apoptosis in C2C12 cells[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2005, 30 (2): 125-129. 5. 邹江, 王慷慨, 刘可, 等. 核仁素反义寡核苷酸对RA W264. 7细胞
增殖与凋亡的影响[J]. 医学临床研究, 2005, 22(12): 1641-1644.
ZOU Jiang, WANG Kangkai, LIU Ke, et al. Eff ect of nucleolin antisense oligonucleotides on proliferation and apoptosis in RA W264.7 cells[J].
Journal of Clinical Research, 2005, 22(12): 1641-1644.
6. 张彬. 核仁素在大鼠缺血-再灌注损伤心肌中的表达及其抗心
肌细胞凋亡作用研究[D]. 长沙: 中南大学, 2009.
ZHANG Bin. Expression of nucleolin in rat heart subjected to ischemia-reperfusion injury and its anti-apoptotic role in cardiomyocytes[D].
Changsha: Central South University, 2009.
7. Bolognese L, Dellavesa P, Rossi L, et al. Prognostic value of left
ventricular mass in uncomplicated acute myocardial infarction and one vessel coronary artery disease[J]. Am J Cardiol, 1994, 73(3): 1-5.
8. Matthew J, Sleight P, Lonn E, et al. Heart Outcomes Prevention
E-valuation (HOPE) Investigatom Reduction of cardiovascular risk by regression of electrocardiographic markers of left ventricular hypertrophy by the angiotensin-converting enzyme inhibitor ramJipri1[J]. Circulation, 2001, 104(8): 1615-1621.
9. Stansfield WE, Tang RH, Moss NC, et al. Proteasome inhibition
promotes regression of left ventricular hypertrophy[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(2): H645-650.
10. Erami M, Galindo CL, Tassa AT, et al. Doxycycline attenuates
isoproterenol-and transverse aortic banding-induced cardiac hypertrophy in mice[J]. J Pharmacol Exp Th er, 2008, 324(3): 1196-203.
11. Katrina B, Gavin B, Pete K, et al. Nucleolin is regulated both at the level
of transcription and translation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 332(3): 817-822.
12. Sakaguchi M, Miyazaki M, Sonegawa H, et al. PKCalpha mediates
TGFbeta-induced growth inhibition of human keratinocytes via phosphorylation of S100C/A11[J]. J Cell Biol, 2004, 164(7): 979-984.
13. Otake Y, Sengupta TK, Bandyopadhyay S, et al. Retinoid-induced
apoptosis in HL-60 cells is associated with nucleolin down-regulation and
中南大学学报(医学版), 2014, 39(2) htt
p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,; htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html, 128destabilization of Bcl-2 mRNA[J]. Mol Pharmacol, 2005, 67(1): 319-326.
14. Singh K, Laughlin J, Kosinski PA, et al, Nucleolin is a second component
of the CD154 mRNA stability complex that regulates mRNA turnover in activated T cells[J]. J Immunol, 2004, 173(2): 976-985.
15. Zheng X, Zhang Y, Chen YQ, et al. Inhibition of NF-kappaB stabilizes
gadd45alpha mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 329(1): 95-99.
16. Kim K, Dimitrova DD, Carta KM, et al. Novel checkpoint response to
genotoxic stress mediated by nucleolin-replication protein a complex formation[J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(6): 2463-2474.
(本文编辑 彭敏宁)
本文引用： 严思敏, 吴双, 孙丽, 蒋碧梅, 涂自智, 肖献忠. 大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达[J]. 中南大学学报:医学版, 2014, 39(2): 124-128. DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.02.003Cite this article as: YAN Simin, WU Shuang, SUN Li, JIANG Bimei, TU Zizhi, XIAO Xianzhong. Expression of nucleolin in pressure overload-induced cardiac hypertrophy rats[J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2014, 39(2): 124-128. DOI:10.11817/
j.issn.1672-7347.2014.02.003
本刊常用词汇英文缩写表
III.实验动物心肌肥厚模型 A、压力超负荷/主动脉缩窄 压力超负荷引起的心脏肥厚常用的手术方法是主动脉缩窄（i.e.缩窄升主动脉）。 小鼠行主动脉缩窄（TAC）可以引起心脏机械性的压力超负荷，最终导致心肌肥厚、心衰（20,84）。TAC通常诱导方法采用在近胸骨端行小切口, 缩窄主动脉的这样的开胸手术。TAC模型虽然不能完全模拟人类的心室重构，但该模型可以用于肥厚发病过程中多种基因学的研究。主动脉缩窄模型能很好的模拟血流动力学超负荷引起左心室肥厚的发生发展。该动物模型在主动脉缩窄造成心肌肥厚几个月后会导致心衰。 B、容量超负荷 在静脉回流适当的情况下，心脏不能排出足够的血液满足全身组织代谢的需要就会引起CHF（充血性心力衰竭）。心内檐沟血或回心血量增加导致瓣膜闭锁不全就会引起心室容量超负荷。在慢性动脉和/或二尖瓣瓣膜回流疾病中的容量超负荷，我们会观察到“舒张期压力-容积曲线”整体右移,说明心脏僵硬度增加，即发生LVH (可见于主动脉瓣狭窄、高血压、肥厚性心肌病)（36）。通常情况下，容量超负荷CHF模型制备方法是腹主动脉-下腔静脉分流术。即于肾动脉上方分离出下腔静脉和腹主动脉，用血管夹在近肾动脉端夹闭主动脉阻断血流；用0.6-mm的针头由主动脉远端刺入，继续进针刺入下腔静脉，使动静脉联合。退针后，缝合血管壁伤口。4-5周后，就能复制出心肌肥厚模型，并具有左心室收缩力增强、舒张末期压力增加的特点（257）。 C、冠状动脉结扎 冠状动脉结扎常用于复制心衰动物模型。冠脉左前降枝（LAD）结扎后会阻断心脏的供养和营养输送，这种情况类似于人类心脏病发作时伴随的症状。血氧和营养供输阻断后，心肌细胞死亡，心脏整体功能受影响，最终导致心功能紊乱。由于这种动物模型非常接近临床心衰疾病的发生发展，研究证明该模型是心衰发病机制研究的重要手段（13）。 D、转基因型心脏肥大模型 几十年以来，一些心脏肥大和心力衰竭的转基因小鼠模型被学者们用于心肌肥厚和心衰这些致命疾病的可能的分子机制研究。受条件限制，在此不能针对于所有模型作一全面的综述，但在此文中，我们介绍一种转基因小鼠模型，该模型能成功模拟心肌肥厚的发生发展以及最终演变为心衰的过程。表1列举的是截止目前，研究学者们发现的较成熟的心肌肥厚/心衰模型。 表1：小鼠心衰模型 转基因小鼠模型代谢转变模型ECM紊乱转基因模型 肌侵蛋白，TNFα，G i，Gαq，PKCβ，PKA，β1AR, 磷酸化蛋白, 肌集钙蛋白, 钙调磷酸酶, L-型Ca2+ 通道 线粒体功能紊乱 氧化应激 脂肪酸氧化(FAO) 通路的受损 基质金属蛋白酶2/MMP2 基质金属蛋白酶9/MMP9 组织金属蛋白酶抑制剂 1/TIMP1
大鼠心肌梗死模型制作图解 庄瑜制作 南京市第一医院 南京医科大学附属南京第一医院南京市心血管病医院心胸外科 https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,/
制作前准备 1．器械：动物呼吸机，开胸制作心梗模型，维持呼吸至关重要。虽然据说某些牛人可以不用呼吸机，但是我想这是经验积累的结果，开始时必然要用；况且需要看此说明的人应该没有牛到这个程度。当然，如果你经费异常充足，不在乎死亡成千上万的大鼠也可以。 显微器械，最主要的是针持，大鼠胸腔、心脏均很小，常规器械无法进入胸腔缝扎。其他手术器械以眼科器械为主。 2．动物：应选择成年健康大鼠，耐受性较好。最重要的是要充分利用每一只动物，包括死亡的大鼠。许多人都知道制作大鼠模型需要多练习，但是练习不是买一大批大鼠，不停地缝扎，然后不停地扔掉死的大鼠；当然，制作心梗模型死亡一些大鼠是很正常的事情。练习的前提是对大鼠解剖及操作过程的熟悉，如果可能的话，最好先找一份大鼠的解剖图谱，熟悉手术区域的解剖结构；同时研究实验流程，熟悉每一个实验步骤。大鼠死亡后，不要急着扔掉，利用它练习每一个你不熟悉的操作步骤，直到熟练为止。 3．实验者：实验者必须具有一种平和的、耐得住寂寞的心态，制作模型需要时间，尤其是早期，需要耐心、仔细的摸索；必须对每一个步骤进行认真地研究。最熟练的制作者做一只大鼠模型也需要30到40分钟的时间，加上准备及扫尾的时间，制作十只模型就需要一天的时间，如果你废寝忘食多用用功也可能做到15只左右，这样一天下来腰酸背痛是必然的，你能坚持多久？不熟练的话，一只就要两、三个小时；同时还要看着大鼠在你的手中死亡，这是很揪心的事情。因此，实验者必须具备良好的心态，急于求成、难耐寂寞者不适合做此实验。 本人系气管切开插管，缝扎LAD制作模型。亦有人经口插管，液氮冷冻制作模型；不在本人讨论范围之内，哪位有经验的话可以传上来，一起讨论。最后祝各位早日成功！！
实验动物心肌肥厚模型 A、压力超负荷/主动脉缩窄 压力超负荷引起的心脏肥厚常用的手术方法是主动脉缩窄（.缩窄升主动脉）。小鼠行主动脉缩窄（TAC）可以引起心脏机械性的压力超负荷，最终导致心肌肥厚、心衰（20,84）。TAC通常诱导方法采用在近胸骨端行小切口, 缩窄主动脉的这样的开胸手术。TAC模型虽然不能完全模拟人类的心室重构，但该模型可以用于肥厚发病过程中多种基因学的研究。主动脉缩窄模型能很好的模拟血流动力学超负荷引起左心室肥厚的发生发展。该动物模型在主动脉缩窄造成心肌肥厚几个月后会导致心衰。 B、容量超负荷 在静脉回流适当的情况下，心脏不能排出足够的血液满足全身组织代谢的需要就会引起CHF（充血性心力衰竭）。心内檐沟血或回心血量增加导致瓣膜闭锁不全就会引起心室容量超负荷。在慢性动脉和/或二尖瓣瓣膜回流疾病中的容量超负荷，我们会观察到“舒张期压力-容积曲线”整体右移,说明心脏僵硬度增加，即发生LVH (可见于主动脉瓣狭窄、高血压、肥厚性心肌病)（36）。通常情况下，容量超负荷CHF模型制备方法是腹主动脉-下腔静脉分流术。即于肾动脉上方分离出下腔静脉和腹主动脉，用血管夹在近肾动脉端夹闭主动脉阻断血流；用的针头由主动脉远端刺入，继续进针刺入下腔静脉，使动静脉联合。退针后，缝合血管壁伤口。4-5周后，就能复制出心肌肥厚模型，并具有左心室收缩力增强、舒张末期压力增加的特点（257）。 C、冠状动脉结扎 冠状动脉结扎常用于复制心衰动物模型。冠脉左前降枝（LAD）结扎后会阻断心脏的供养和营养输送，这种情况类似于人类心脏病发作时伴随的症状。血氧和营养供输阻断后，心肌细胞死亡，心脏整体功能受影响，最终导致心功能紊乱。由于这种动物模型非常接近临床心衰疾病的发生发展，研究证明该模型是心衰发病机制研究的重要手段（13）。 D、转基因型心脏肥大模型 几十年以来，一些心脏肥大和心力衰竭的转基因小鼠模型被学者们用于心肌肥厚和心衰这些致命疾病的可能的分子机制研究。受条件限制，在此不能针对于所有模型作一全面的综述，但在此文中，我们介绍一种转基因小鼠模型，该模型能成功模拟心肌肥厚的发生发展以及最终演变为心衰的过程。表1列举的是截止目前，研究学者们发现的较成熟的心肌肥厚/心衰模型。 表1：小鼠心衰模型 转基因小鼠模型代谢转变模型ECM紊乱转基因模型 肌侵蛋白， TNFα，G i，Gαq，PKCβ， PKA，β1AR, 磷酸化蛋白, 肌集钙蛋白, 钙调磷酸酶, L-型Ca2+ 通道 线粒体功能紊乱 氧化应激 脂肪酸氧化 (FAO) 通路的受损 基质金属蛋白酶2/MMP2 基质金属蛋白酶9/MMP9 组织金属蛋白酶抑制剂 1/TIMP1
心肌肥厚动物模型建立方法研究进展 摘要目的：综述心肌肥厚（CH）动物模型的建立方法，为CH类疾病的研究和临床治疗提供参考。方法：以“心肌肥厚”“动物模型”“Cardiac hypertrophy”“Model”等组合作为关键词，在中国知网、 PubMed等数据库中检索相关文献，筛选2004－2014年有关CH动物模型建立方法的内容，综述常用模型的基本原理、制备方法及特点等。结果与结论：共查阅到376条文献，其中有效文献29条。目前常用的CH动物模型建立方法有物理法（包括压力超负荷法致CH、容量负荷法致CH、心肌梗死致CH、运动诱导致CH）、化学法（包括药物诱导法致CH）和生物法（包括转基因型CH、自发性高血压大鼠模型致CH）等。其均可模拟CH，而CH原理、制备方法和模型特点各异。在CH动物模型中，大鼠易饲养、经济、抗感染力强，常作为首选造模动物，常用鼠种为SD大鼠及小鼠，雌雄均可。在现有成模方法中，压力超负荷法制作慢性CH模型，手术操作简单方便、重复性好、造价低廉，最为常用；转基因动物模型对人类疾病的模拟程度更高，但耗时长，费用昂贵，可能成为未来的发展方向。 关键词心肌肥厚；动物模型；建模方法；转基因 心肌肥厚（CH）是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应。在早期，CH因心室壁增厚、心肌收缩功能改善而被视为代偿性过程 [1]；但在持久病理性应激情况下， CH伴随间质纤维化、收缩功能失调以及基因表达、能量代谢和电生理特征异常，最终导致失代偿性心功能衰竭，严重危害人体健康。目前认为， CH是心血管疾病的一种常见并发症，已被列为引起心血管疾病发生率和病死率显著升高的独立危险因素[2]。其发生机制复杂，至今仍未完全阐明，而对CH的发生机制及治疗方法等研究常用动物实验进行，因此复制动物模型成为目前国内外从事CH研究的常用手段。本文拟以“心肌肥厚”“动物模型”“Cardiac hypertrophy”“Model”等组合作为关键词，在中国知网、 PubMed 等数据库中检索相关文献，筛选2004－2014年有关CH动物模型建立方法的内容。结果共查阅到376条文献，其中有效文献29条。现根据物理法、化学法和生物法等基本造模方法，对常用CH动物模型的基本原理、制备方法及特点等进行综述，为CH类疾病的研究和临床治疗提供参考。 1 物理法 物理法是指通过外界机械力、气压、温度、光和声音等条件的改变，诱发动物形成某一疾病的造模过程，主要包括压力超负荷法、容量负荷法、心肌梗死致CH和运动诱导致CH。其中，前3种均采用手术方式复制CH模型，具有成模时间短、操作方便、重复性好、价格较低等优点，但会给动物造成极大的痛苦；后者通过有规律的运动复制CH模型，能较好地模拟人类CH疾病发展过程，但造模时间较长、操作较烦琐。
型肥肌厚模实验动物心主动脉缩窄压力超负荷/A、缩窄升主动脉）。小鼠行主动脉缩.压力超负荷引起的心脏肥厚常用的手术方法是主动脉缩窄（通常诱导TAC）可以引起心脏机械性的压力超负荷，最终导致心肌肥厚、心衰（20,84）。窄（TAC模型虽然不能完全模拟人类的TAC方法采用在近胸骨端行小切口, 缩窄主动脉的这样的开胸手术。心室重构，但该模型可以用于肥厚发病过程中多种基因学的研究。主动脉缩窄模型能很好的模拟血流动力学超负荷引起左心室肥厚的发生发展。该动物模型在主动脉缩窄造成心肌肥厚几个月后会导致心衰。容量超负荷B、 （充CHF在静脉回流适当的情况下，心脏不能排出足够的血液满足全身组织代谢的需要就会引起 血性心力衰竭）。心内檐沟血或回心血量增加导致瓣膜闭锁不全就会引起心室容量超负荷。在慢性动脉和/或二尖瓣瓣膜回流疾病中的容量超负荷，我们会观察到“舒张期压力-容积曲线”整体右移,说明心脏僵硬度增加，即发生LVH (可见于主动脉瓣狭窄、高血压、肥厚性心肌病)（36）。通常情况下，容量超负荷CHF 模型制备方法是腹主动脉-下腔静脉分流术。即于肾动脉上方分离出下腔静脉和腹主动脉，用血管夹在近肾动脉端夹闭主动脉阻断血流；用的针头由主动脉远端刺入，继续进针刺入下腔静脉，使动静脉联合。退针后，缝合血管壁伤口。4-5周后，就能复制出心肌肥厚模型，并具有左心室收缩力增强、舒张末期压力增加的特点（257）。 C、冠状动脉结扎 冠状动脉结扎常用于复制心衰动物模型。冠脉左前降枝（LAD）结扎后会阻断心脏的供养和营养输送，这种情况类似于人类心脏病发作时伴随的症状。血氧和营养供输阻断后，心肌细胞死亡，心脏整体功能受影响，最终导致心功能紊乱。由于这种动物模型非常接近临床心衰疾病的发生发展，研究证明该模型是心衰发病机制研究的重要手段（13）。 D、转基因型心脏肥大模型 几十年以来，一些心脏肥大和心力衰竭的转基因小鼠模型被学者们用于心肌肥厚和心衰这些致命疾病的可能的分子机制研究。受条件限制，在此不能针对于所有模型作一全面的综述，但在此文中，我们介绍一种转基因小鼠模型，该模型能成功模拟心肌肥厚的发生发展以及最终演变为心衰的过程。表1列举的是截止目前，研究学者们发现的较成熟的心肌肥厚/心衰模型。 表1：小鼠心衰模型 转基因小鼠模型代谢转变模型ECM紊乱转基因模型 G，，2/MMP2 线粒体功能紊乱TNF肌侵蛋白，基质金属蛋白酶αiβPKCβ，，PKA，基质金属蛋白酶9/MMP9 氧化应激AR, Gαq1组织金属蛋白酶抑制剂通路的受损, , 磷酸化蛋白肌集钙蛋白(FAO) 脂肪酸氧化 2+ 通, L-钙调磷酸酶型Ca1/TIMP1 道
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
麝香保心丸、脉平对腹主动脉狭窄高血压大鼠心肌肥厚的作用 发表时间：2013-10-24T09:19:25.250Z 来源：《医药前沿》2013年第28期供稿作者：柳玲1 石磊2 黄杲1 梁绪国2(通讯作者) [导读] 高血压心肌肥厚是心律失常、心衰和猝死等发生的主要原因之一，故如何控制左室肥厚形成是一个十分重要的课题。 柳玲1 石磊2 黄杲1 梁绪国2(通讯作者) （1 山东省烟台白石肛肠医院山东烟台 264001） （2 山东省烟台毓璜顶医院山东烟台 264000） 【摘要】目的在腹主动脉狭窄高血压大鼠模型上观察了心肌肥厚的变化，并探讨其与多种细胞因子、基质金属蛋白酶、心肌细胞凋亡率、凋亡调控基因表达等多种因素之间的关系及中药麝香保心丸、脉平对心肌肥厚和各种影响因素的作用。方法双抗夹心ELISA法测定MMP-2、MMP-9和IL-6、IL-10；放免法检测TNF-α；流式细胞法测心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因表达。结果腹主动脉狭窄6周后，大鼠左室重及室重/体重比值明显增加；同时多种细胞因子、基质金属蛋白酶、心肌细胞凋亡率、凋亡调控基因表达等均发生了相应的变化；麝香保心丸和脉平对心肌肥厚和各种影响因素有较好的治疗和预防作用。结论心肌肥厚可能与多种因素有关；麝香保心丸和脉平对预防和治疗心肌肥厚有一定的作用。 【关键词】心肌肥厚麝香保心丸脉平细胞因子基质金属蛋白酶凋亡 【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）28-0151-02 Effect of Shexiangbaoxinwan and Maiping on Left Ventricle in Pressure-Overloaded Hypertrophy Rat 【ABSTRACT】 AIM：To explore the effect of Shexiangbaoxinwan and Maiping on left ventricle in pressure-overloaded hypertrophy rats. And also the relationship between left ventricular hypertrophy (LVH) and cytokines, matrix metalloproteinases, apoptosis, and apoptosis genes. METHODS: IL-6, IL-10, MMP-2, MMP-9 were evaluated by ELISA means. TNF-alpha was measured with radioimmunoassays. Flow cytometer was used to measure the apoptosis ratio and the expression of Fas , Bcl-2 and Bax. RESULTS: 6 weeks after abdominal aortic coarctation operation, compared with the sham operated group, the weight of the left ventricle (0.995±0.320g) and heart weight/body weight (0.369±0.149) were significantly increased in modern group. And also IL-6 (213.56±83.41pg/ml), TNF-α(1.997±0.812ng/ml), MMP-2 (72.91±35.59), MMP-9 (60.15±26.43), and apoptosis genes (Fas, Bax, Bcl-2, Bcl-2/Bax) expression were increased；apoptosis ratio (9.81±5.03), IL-10 (91.07±38.74pg/ml) decreased compared with sham operated group. The 2 groups with drugs (SB,MP) decreased the increasing weight of LV and ventricular weight/body weight; and inhibited the changes of influencing factors (IL-6, IL-10, TNF-α, MMP-2, MMP-9, apoptosis ratio, apoptosis genes expression). CONCLUSION: LVH might be related with many influencing factors. Shexiangbaoxinwan and Maiping may have the positive importance in the treatment and prevention of LVH. 【KEY WORDS】 LVH Shexiangbaoxinwan Maiping Cytokines Matrix metalloproteinases Apoptosis 近年来的研究已证实高血压的发病与许多因素有关，进而完善和发展了传统的高血压发生、发展的机制，为彻底地阐明高血压的发病机制、发展和转归机理以及人类最终完全控制高血压奠定了分子生物学机理。但其发生机理以及与心室重构和心肌肥厚的关系尚未完全阐明。本研究采用腹主动脉狭窄大鼠高血压模型，观察了麝香保心丸和脉平对高血压大鼠心肌肥厚的作用及对血清中细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α）、基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）水平变化以及大鼠心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因（Bcl-2、Fas、Bax）表达的影响。 1 材料与方法 1.1 动物模型的制备 取健康SD大鼠60只，（雌雄各半，2月龄，体重160～180g）术前禁食12小时，自由饮水。用3%巴比妥钠腹腔注射麻醉后，随机分为腹主动脉狭窄手术组（45只）和假手术组大鼠（15只）。参照文献并对手术方式加以改进，于左肋弓下缘0.5cm、脊柱前0.5cm处行1.5～2.0cm纵切口，逐层分离皮下组织，于左肾后上方分离肾动脉，在左右肾动脉分支之间的腹主动脉下方穿入2.0手术缝线，沿血管走行方向放置针尖磨钝的7号注射针头与腹主动脉一起结扎，这时可触摸到结扎点下方腹主动脉搏动明显减弱，小心拔出针头，腹腔滴入青霉素（40万U/ml）适量，逐层关腹，缝合。术后肌注青霉素10万U。假手术组不结扎腹主动脉，其余同手术组。术后正常饮食，定时观查体征。 1.2 实验动物分组和程序 造模7天后，腹主动脉狭窄手术组随机分为3组，即模型对照组（模型组），麝香保心丸组（SB组），脉平组（MP组）。假手术组、模型组每日饮用水10ml/kg灌胃；SB组，SB100mg/kg、MP组，MP60mg/kg。将上述药物溶解于饮用水中，按10ml/kg每日一次胃管灌入，共6周。实验过程中动物均自由饮食。 治疗6周后，禁食12小时，称体重。麻醉后从腹主动脉抽取6ml血液，高速离心后分离出血清，-70℃保存待用。立即摘取大鼠心脏，剪断肺静脉，从肺动脉瓣之上2mm处将肺动脉切断，在心包的脏层转折处剪断主动脉和上、下腔静脉。取出心脏后用0.1mol/L、PH7.4 PBS洗涤，滤纸吸干，称重；沿二尖瓣平面分离心房与心室，去右心室，称重。计算大鼠左室重/体重（g/100g）比值。 1.3 检测方法 1.3.1 双抗夹心ELISA法测定MMP-2、MMP-9和IL-6、IL-10（分别严格按各试剂盒说明书操作）。 1.3.2 放免法检测TNF-α：采用液相竞争法，分管加样后充分混匀，4℃放置24h，加入分离剂后充分混匀，室温放置20min，4℃离心3500rpm 25min，吸弃上清夜，在自动γ计数器上计算标准曲线和TNF-α浓度。 1.3.3 流式细胞法测心肌细胞凋亡率和凋亡调控基因表达用机械法分散心肌组织,收集单细胞悬液,经300目尼龙网过滤离心沉淀 2min后,加生理盐水洗涤,再次离心沉淀后,置于70%乙醇中备用。加入碘化丙啶（promide iodine，PI）工作液0.5 ml，终浓度为10 mg/L，室温避光30 min后上机进行流式细胞仪（FACScan型流式细胞仪，美国BD公司生产）检测。 上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用CellQuest Plot 软件（BD公司提供）分析数据，由HP1200 c/PS打印结果。 心肌细胞凋亡及凋亡基因表达量以标记阳性细胞百分率表示：=标记阳性细胞数/受检细胞数×100%-非特异结合细胞%[1]。 1.4 主要药品和试剂麝香保心丸（Shexiangbaoxinwan, SB）由上海和黄药业公司提供；脉平原粉（maiping，MP）由甘肃独一味
常见大鼠心肌梗塞模型建立方法对比 心肌梗塞是危害人类健康的主要疾病之一，主要是由于某支冠状动脉持续缺血，其所支配的心肌发生不可逆转坏死而形成的病理过程。90%以上的心肌梗塞是由于冠状动脉粥样硬化病变基础上血栓形成而引起的，较少见于冠状动脉痉挛，少数由栓塞、炎症、畸形等造成管腔狭窄闭塞，使心肌严重而持久缺血达1小时以上即可发生心肌坏死。心肌梗塞的发生常有一些诱因，包括过劳、情绪激动、大出血、休克、脱水、外科手术或严重心律失常等。美国每年约有150万人发生心肌梗塞。而在中国，近年来心肌梗塞发生率呈明显上升趋势，每年新发至少50万名患者，现存至少200万名患者。 为了更好地筛选有效治疗心肌梗塞的药物并研究心肌梗塞的发病机理，实验人员常以大鼠、兔和实验用小型猪来建立标准化的心肌梗塞模型。相对于其他动物，大鼠有许多优势： 1.大鼠的品系纯正，组内差异较少； 2.大鼠饲养成本低，造模前后管理较容易； 3.大鼠的冠脉系统侧支循环比较少，结扎后易出现一个比较固定的缺血区，能很大程度上提高造模的成功率； 4.大鼠心肌梗塞模型手术较小，单人就能操作。 下面我们将就较常见的几种大鼠心梗造模方法来进行一一详细介绍。 a.传统冠状动脉结扎法 冠状动脉结扎是最常选用的大鼠心肌梗塞造模方法，其具体操作步骤为：将大鼠用氯氨酮麻醉后接上小动物呼吸机，经左侧第4肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，打开胸腔并剪开心包膜，挤压出心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间穿线，结扎左冠状动脉前降支（于分支的起点处约1～2mm），用Ⅱ导生理记录仪记录心电
图，心电图ST段弓背抬高示心肌梗塞造模成功。然后迅速将心脏放回胸腔，随即缝合胸腔及皮肤。假手术组（阴性对照组）除不结扎冠状动脉外，其余操作与手术动物相同，术后给予庆大霉素局部处理。 b.异丙肾上腺素注射法 除冠状动脉结扎法之外，药物注射法也常用于大鼠的心肌梗塞模型的建立。将大鼠用1%的戊巴比妥钠20～25mg/kg体重给予大鼠腹腔注射麻醉，直接按5mg/kg 体重，皮下注射4%异丙基肾上腺素（ISO），或直接将药物注入腹腔均可造模，每天注射1次，连续注射2-8天，可造成心梗、心衰、冠状动脉痉挛。一般在注射后4-8周发病。 c.反复冷冻法 沿大鼠胸骨左缘前外侧第4肋间进入胸腔打开，充分暴露心脏，用浸过液氮的直径6mm铜棒充分接触左室游离壁，持续时间5s/次，随即闭合胸腔，待自主呼吸恢复正常后，按分组情况再次原位反复共3、5次或8次进行心肌冷冻损伤。 这三种大鼠的心肌梗塞模型的建立方法各有优缺点，通过对这三种方法所建立疾病类型、手术实验技术要求、实验室仪器要求、术后死亡率及造模稳定性等方面的对比，我们对比总结了这三种造模方法(如表1所示)。 表1.三种心肌梗塞造模方法对比 模型类型造模类型实验技能要求仪器要求死亡率造模稳定性 冠状动脉前降支结扎法急性心梗高需要小动物 呼吸机 较高高 冷冻法急性心梗较高需要小动物 呼吸机 较高低 药物注射法慢性心梗低无要求低较高从上表可见，冠状动脉前降支结扎法与冷冻法类似，均会造成大鼠的急性心肌
心肌肥厚是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的靶器官反应，见于高血压心脏病、肺动脉高压及慢性充血性心力衰竭等。心肌肥厚的基本变化不仅是心肌细胞的肥大与增生，也有非心肌细胞如成纤维细胞、胶原细胞、血管细胞及蛋白质、酶等的生成、增殖与增生，伴有心室形态与结构的改变和心肌机械功能的减退等。心肌肥厚中最常见的是高血压病引起的左室肥厚(LVH)，为高血压的主要靶器官损害之一。中医学中虽无心肌肥厚的名词，但有“阳化气，阴成形”，“阳生阴长”等论述。现代研究表明，LVH是一种极其重要的、独立的心血管危险因素，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和淬死的几率增加6—10倍[1~3]。所以有关左室肥厚的动物模型研究有助于了解本病的病因，病机，对探讨其诊治办法，开发有效的防治药物有重要意义。现就近几年有关左心室肥厚的动物模型研究进行简单总结，以供大家参考。 1.实验动物的选择 进行心肌肥厚研究的动物以SD大鼠、白发性高血压大鼠、WKY(Wistar—kyoto)大鼠最为常用，仓鼠[4]及转基因小鼠也可制作动物模型。 2.动物模型 2.1压力负荷性心肌肥厚模型[5~7] 体重200g左右的大鼠，雄雌兼用，戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉，背位固定于手术台，手术野剪毛，皮肤消毒，腹正中切口，打开腹腔。在左肾动脉分叉处上方分离腹主动脉，将腹主动脉与7号或9号注射器针头(磨去针尖)共同结扎(3-0号丝线)，然后抽出注射器针头，使该部位动脉形成狭窄(狭窄程度65％~70％)，然后逐层缝合腹部切口、关腹。假手术组除不用丝线结扎腹主动脉外，其余操作步骤相同。术后每天用青霉素5万U/只肌内注射一周。一般术后3~4天大鼠心肌开始肥厚，2~3周达稳定高峰。 该模型通过缩窄部分腹主动脉，造成心脏后负荷增加而导致心肌肥厚，此外，由于肾血流量相对减少，血管紧张素Ⅱ等体液因素也参与心肌肥厚形成。 该模型形成心肌肥厚时间较短，操作方便，重复性好，应用较多。但是术后早期动物死亡率较高(约20％~30％)，可能与急性心功能不全有关。 2.2肾型高血压大鼠心肌肥厚模型[6,9] 体重200g左右的大鼠，雄雌兼用，戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻
模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 （1）术前12小时给动物禁食 （2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上 （3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml （4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1 （5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2
（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3
（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4
（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5 （9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6
（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7
（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果，图8 结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：
中南大学学报（医学版） J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(2) htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,; htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html, 124 大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达 严思敏1，吴双1，孙丽2，蒋碧梅2，涂自智2，肖献忠2 (中南大学湘雅医学院 1. 2008级临床医学系；2. 病理生理学系，长沙 410078) [摘要]目的：探讨腹主动脉缩窄致压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中核仁素的表达情况。方法：采用体质量180~220 g SD 大鼠40只，随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组，利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加心肌肥厚模型，分别于术后2周、4周观察心脏质量指数、左心室质量指数；采用RT-PCR 检测心肌组织中β-MHC mRNA 的表达；采用Western 印迹检测心肌、脑、肾组织中核仁素的表达情况。结果：腹主动脉缩窄模型组4周以后心脏质量指数、左心室质量指数较假手术组显著增加(P <0.01)；4周以后心肌组织中β-MHC mRNA 的表达较假手术组显著升高(P <0.05)；2周以后心肌组织中核仁素蛋白的表达较假手术组显著升高(P <0.05)，而在脑、肾组织中无明显升高。结论：核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达上调，表明核仁素可能参与了压力负荷增加心肌肥厚的发生发展。 [关键词] 核仁素；心肌肥厚；大鼠；压力负荷增加 Expression of nucleolin in pressure overload-induced cardiac hypertrophy rats YAN Simin 1, WU Shuang 1, SUN Li 2, JIANG Bimei 2, TU Zizhi 2, XIAO Xianzhong 2 (1. Clinical Medical Major, Grade 2008; 2. Department of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, China) ABSTRACT Objective: To detect the expression of nucleolin in cardiac hypertrophy rats induced by pressure overload. Methods: A total of 40 SD rats with body weight 180 g and 220 g were recruited and randomly divided into 2 groups: a transverse aortic constriction (TAC) group and a sham surgery group. Cardiac hypertrophy model was employed by transverse aortic constriction surgery. Th en 2 weeks and 4 weeks aft er the experiment, the heart mass index (HMI), left ventricle mass index (LVMI) were measured. β-MHC mRNA in the heart tissue was detected with RT-PCR. Nucleolin in the heart, brain and kidney was respectively detected with Western blot. 收稿日期(Date of reception)：2013-04-02 作者简介(Biography)： 严思敏，主要从事心肌的内源性保护的研究，现为湘雅二医院心胸外科硕士研究生。通信作者(Corresponding author)：蒋碧梅，Email ：jiangbimei@https://www.doczj.com/doc/3812834632.html, 基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金(81170113)；教育部新世纪优秀人才支持计划(NECT-12-0545)。This work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (81170113) and Education Ministry's New Century Excellent T alents Supporting Plan, P . R. China (NECT-12-0545). DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.02.003 htt p://https://www.doczj.com/doc/3812834632.html,/xbwk/fi leup/PDF/201402124.pdf
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
大鼠心肌梗死模型研究进展 发表时间：2016-05-24T11:39:08.117Z 来源：《健康世界》2015年12期作者：徐陶锐1 李保2（通讯作者）王家璞1 闫文婷1 [导读] 山西医科大学山西省心血管病医院心肌梗死是现临床的多发病，是由于冠状动脉发生了闭塞，导致心肌缺血从而引起心肌细胞发生死亡。 1山西医科大学山西太原 030001 2山西省心血管病医院山西太原 030001心肌梗死是现临床的多发病，是由于冠状动脉发生了闭塞，导致心肌缺血从而引起心肌细胞发生死亡，已经成为中老年人群死亡的主要病因之一。心肌梗死动物模型是研究梗死性心脏病病理机制和相关治疗药物疗效评价的一个重要手段。目前心肌梗死的临床治疗有很多种方法，譬如药物治疗、细胞技术等。这些治疗方法在临床使用之前都要进行大量的动物实验，只有在动物实验出现了治疗的效果才能进而在临床应用。其中大鼠心肌梗死模型是研究心肌梗死病理生理变化的重要模型，它能够客观的反应治疗效果以及在心肌梗死过程中心电活动、室壁运动的变化，对临床进一步揭示心肌梗死的发病机理及对心肌缺血损伤防治具有重要的理论意义和实用价值。本文章就大鼠心肌梗死模型的建立进行一个简单的叙述。 1.结扎法 1.1麻醉方法的选择 大鼠的麻醉方法常见的有腹腔注射、静脉注射、吸入麻醉等方法，在实验中所用的麻醉药物常见的有水合氯醛、戊巴比妥钠、乙醚等。其中戊巴比妥钠或水合氯醛通过腹腔注射给药可以达到理想的麻醉效果【1】，它的优点是给药途径便利、麻醉起效快、麻醉深度适中，但在麻醉时要对麻醉剂量的选择要非常谨慎，应当按公斤体重来计算，从低剂量开始给药，譬如10%的水合氯醛按照0.3ml/100g为起始量，5~10min起效。麻醉太浅，大鼠容易清醒发生挣扎，不利于手术操作；麻醉太深，则术后大鼠不易清醒，呼吸道分泌物过多堵塞气道，会导致大鼠难以恢复正常的自主呼吸【2】，拔呼吸机插管较困难，容易导致实验大鼠的肺水肿、感染、呼吸肌麻痹等，会大大增加大鼠围手术期死亡率。 1.2建立气道的方法 有研究表明，在建立AMI模型过程中可以不进行气管插管，但要在短时间内迅速开胸并进行结扎，手术难度较大。这个方法在实际操作过程中有许多很难克服的技术弊端：操作难度大、围术期存活率低。现如今AMI模型制作时多采用小动物呼吸机维持呼吸，比较常用的大鼠气管插管方法有经口气管插管和气管切开插管。经口气管插管所造成的创伤较小，术后对大鼠的呼吸功能影响也比较小，但需要操作者有较高的操作技术。若一次插管不成功，操作者进行反复尝试，或者在插管时所用力度过大均可造成喉头黏膜急性水肿，最终导致窒息死亡。因此新手在使用这个方法时会增加大鼠死亡率。目前针对此法已有一些改良方法，增加了插管的成功率【3】。气管切开插管和经口气管插管相比较有以下优点，手术视野较好，非常直观，具有较高的成功率，但是在气管切开时非常容易损伤到血管，导致血管出血过多，这样可以造成术后呼吸道分泌物增多，气管容易塌陷，如果清理不及时将会导致大鼠发生窒息死亡。上述两种方法各有优劣，只要熟练操作死亡率并无明显差异。 1.3开胸体位及方法 在造模过程中大鼠的体位多为背位固定，于第4~5肋间开胸，挤压右侧胸壁将心脏挤出或用小匙将心脏舀出【4】。还有一些人在操作时将肋骨剪断，用手挤压胸腔或腹腔将心脏从胸腔内挤出，结扎冠脉后再将心脏放回，同时抽出胸腔内的气体，这种方法在操作过程中非常容易导致心脏和大血管在受到外力的牵拉下而发生变形，可增加恶性心律失常的发生率，同时对胸腔内空气的排空以及剪断的肋骨容易对肺部造成进一步的损伤，增加术后大鼠的死亡率【5】。近年来，有研究表明有部分操作者在造模过程中让大鼠保持右侧卧位固定，用眼科剪沿肋骨方向作斜行切口，并不剪断肋骨及肌肉组织，所造成的创伤较轻，在使用开胸器暴露心脏的过程变的非常容易，术后可保持大鼠胸部的正常结构，不影响呼吸功能，有利于其存活【4，6，7】。 1.4冠脉结扎部位 观察大鼠心脏解剖图可知，左冠状动脉前降支位于心肌组织中，肉眼观察不易分辨。在暴露心脏后，肉眼可观察到左冠状静脉主干位于心脏表面走形，它与左冠状动脉前降支相互伴行，位于于左心耳和肺动脉圆锥之间，可作为定位标志。结扎冠脉位置的高低对心梗模型的存活率有着至关重要的作用。结扎位置较低时，可能会导致模型建立不成功，心梗面积小，对实验的稳定性有一定的影响；结扎位置较高时，模型成功率高，但动物死亡率也明显提高【8】。 1.5术后护理 术后的护理是非常重要的，对大鼠的呼吸和温度进行有效的管理可以减低手术的死亡率。造模后，放回鼠笼单独饲养，保温灯照射，待大鼠完全清醒后转至普通鼠笼中，置于空调房内正常饲养。术后连续肌注青霉素钠5d（40万U/d）防止切口感染。 2.药物法 药物法制作心梗模型，常用是异丙基肾上腺素和垂体后叶素，它们可导致血管发生强烈的收缩，导致冠状动脉痉挛，从而形成血栓导致心肌梗死。这个造模方法操作简单，但是对冠状动脉选择性较差，容易引起心肌弥漫性损伤，不能对梗死区域进行有效的固定，所以不能进行一些定量的研究。 3.血栓法 通过血栓法来制作心肌梗死模型的操作方法有很多，譬如电刺激法、机械损伤法等。其中电刺激法是这些方法中使用较多的一种。在操作过程中，术者将电极放置于左冠状动脉前降支的开口处，增大电流强度，通过刺激冠脉血管外膜导致损伤形成，进而形成血栓发生堵塞，最终导致心肌梗死形成。电刺激法能够准确定位所需要堵塞的血管，造成的梗死区域较固定，同时对大鼠的损伤较小，比较真实的模拟了心肌梗死的发生过程。 4.高脂饮食法