第七章发酵染菌及防治
工业发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌、无污染的条件下进行生产。生产的环节比较多，既要连续搅拌和供给无菌空气，又要排放多余的空气、多次添加消沫剂、补充培养基、定时取样分析及不断改变空气量等。所有这些操作都会给防止发酵染菌带来了极大的困难。
所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。
从国内外的发酵工业的报道看，在生产中要做到完全不染菌是不可能的。目前能够做到的是提高生产技术水平，尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生染菌，要能尽快找出其中污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最低的限度。
第一节发酵染菌的分析
第二节染菌对发酵的影响
第三节杂菌染菌的挽救与处理
第四节杂菌染菌的途径和防治
第一节发酵染菌的分析
一、种子培养和发酵的异常现象
发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然会影响发酵水平，使生产蒙受损失。
异常现象为：
1、种子培养异常
2、发酵异常
1、种子培养异常
①、培养的种子不合格
②、菌体生长缓慢
③、菌丝结团
④、菌体老化
⑤、代谢不正常
2、发酵异常
①、菌体生长差
②、pH值过高或过低
③、泡沫过多
④、菌体浓度过高或过低
二、染菌的检查、判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。
生产上要求能用确切、迅速的方法检查出杂菌的污染。常用的检查方法有：
1、显微镜检查法(镜检法)
2、肉汤培养法
3、平板划线培养或斜面培养检查法
4、发酵过程的异常现象观察法
5、其他一些异常现象如：菌体生长不良、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下降、发酵周期的异常的拖长、发酵液的粘度异常增加等来判断。
三、发酵染菌原因
1、发酵染菌的规模分析
2、不同污染时间分析
3、染菌的杂菌种类分析
四、发酵染菌的分析
第二节染菌对发酵的影响
一、染菌对发酵过程的影响
由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。
一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到发酵产物的生成，使发酵产品的产量大为降低
例如：
①、青霉素的发酵过程中，由于染菌许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵的前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使发酵过程得不到目的产物，其危害十分严重。
②、核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需要的培养基营养丰富，因此极易受到杂菌的污染，且污染后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。
③、柠檬酸等有机酸发酵过程中，一般在产酸后，发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵的中、后期不太会发生染菌，因此主要是要防止发酵的前期染菌。
二、杂菌的种类和性质对发酵过程的影响
对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类和性质对该过程的影响是不同的。
如：
①、抗生素的发酵过程中
青霉素的发酵污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害更大；
链霉素的发酵污染细短杆菌、假单孢菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更有危害；
四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌。
②、柠檬酸发酵最怕青霉菌的染菌。
③、谷氨酸的发酵最怕噬菌体的染菌。
三、染菌发生的时间不同对发酵的影响
从发生染菌的时间看，染菌可分为四个时期，不同的染菌时期对发酵所产生的影响是不同的。
1、种子培养期染菌
种子培养主要是用于微生物细胞的生长与繁殖，此时，微生物菌体的浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。
如果将种子培养期的染菌的种子带进发酵罐中的危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，就经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
2、发酵前期染菌
前期微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢产物很少，相对而言，这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖和产物的生成。
3、发酵中期染菌
发酵中期的染菌将导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢、影响产物的生成。
发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现，快处理。
4、发酵后期染菌
由于发酵后期染菌，培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵的影响相对要小些，可以继续进行发酵。
从产物来看，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的。如：
①、抗生素、柠檬酸发酵，染菌对产物的影响不大；
②、肌苷、谷氨酸、赖氨酸等的发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。
四、染菌程度不同对发酵的影响
染菌的程度对发酵的影响是很大的。
1、染菌程度愈严重，进入发酵罐内的杂菌数量愈多，对发酵的危害也愈大。
2、当发酵过程中的生产菌已有大量的繁殖，并已在发酵液中占有优势，污染极少量的杂菌，对发酵不会带来太大的影响。这是因为进入发酵液的杂菌需要有一定的时间才能达到危害发酵的程度。
第五节杂菌染菌的挽救与处理
发酵过程一旦发生染菌，应根据污染微生物的种类、染菌的时间或杂菌的危害程度等进行挽救处理，同时对有关设备也应进行相应的处理。
一、种子培养期染菌的处理
二、发酵前期染菌的处理
三、发酵中、后期染菌处理
四、染菌后对设备的处理
一、种子培养期染菌的处理
1、一旦发现种子受到杂菌的污染，该种子就不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
2、弃之的种子罐同时应采用备用种子，选择生长正常无污染的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。
3、如无备用种子，可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，保证生产正常进行。
二、发酵前期染菌的处理
1、如果发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热到规定的温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；
2、如果已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源消耗量比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。
3、也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。
三、发酵中、后期染菌处理
1、发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施，进行处理。
2、如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品含量若达到一定值，只要明确是染菌也可放罐。
3、对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、灭菌30分钟后才能排放。
四、染菌后对设备的处理
1、染菌后的发酵罐在重新使用前必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热无菌后才能使用；
2、可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12小时以上等方法进行处理。
第四节杂菌染菌的途径和防治
一、种子带菌及其防治
二、空气带菌及其防治
三、设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
四、培养基灭菌不彻底导致染菌
五、噬菌体染菌及其防治
一、种子带菌及其防治
种子带菌而发生的染菌率虽然不高，但它是发酵前期染菌的重要原因之一。是发酵生产成败的关键，所以对种子染菌的检查和染菌的防治是极为重要的。
1、途径
①、种子保存管染菌；
②、培养基和器具灭菌不彻底；
③、种子转移和接种过程染菌；
④、种子培养所涉及的设备和装置染菌等。
2、防治措施
①、严格控制无菌室的污染程度；
②、将种子的转移、接种等操作放在超净工作台上进行，从而保证不被杂菌污染；
③、防止杂菌进入到沙土管、斜面、三角瓶等种子的容器中；
④、对每一级种子的培养物均进行严格的无菌检查，确保任一级种子无污染；
⑤、对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理。
二、空气带菌及其防治
无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
生产上的防治措施
①、加强生产场地的卫生管理；
②、设计合理的空气预处理过程；
③、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器的失效。
三、设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
1、渗漏染菌
2、灭菌死角
3、防治措施
1、渗漏染菌：设备渗漏主要是指发酵罐、冷却盘管、管道阀门等由于化学腐蚀(如发酵代谢所产生的有机酸等发生的腐蚀作用)、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生的渗漏染菌。
2、灭菌死角：指的是由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的目的。生产常把这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”。
3、防治措施
管件的渗漏主要是指阀门渗漏，目前生产上使用的阀门不能完全满足发酵工程的工艺要求，是造成发酵染菌的主要原因之一。
①、生产上仔细清洗，检查渗漏，降低冷却水中Cl-1含量。
②、最易产生“死角”的管道通常要频繁更换或认真洗涤。
③、通过加强罐体的清洗，适当降低搅拌桨位置可以减少罐底的积垢，减少染菌。
④、尽可能减少或取消连接法兰等措施，减少死角。
⑤、采用加工精度高、材料好的阀门。
四、培养基灭菌不彻底导致染菌
1、途径
①、灭菌时温度与压力不对应造成的染菌；
②、灭菌过程中产生的泡沫造成的染菌；
③、连续灭菌维持时间不够而造成的染菌；
④、灭菌过程中的压力剧变而造成的染菌
⑤、一些探头等灭菌不彻底造成的染菌。
2、防治措施
①、在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内空气。
②、要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。
③、避免蒸汽压力波动过大，应严格控制灭菌的温度，过程最好采用自动控温。
④、冷却前需要先通入无菌空气维持罐内压力，然后进行冷却。
⑤、对淀粉质的培养基的灭菌采用实罐灭菌为好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；
⑥、对于有大颗粒存在时应先经过筛除，再进行灭菌；
⑦、对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量多的培养基，可采用罐外预先配料，再转到发酵罐内进行实罐灭菌。
五、噬菌体染菌及其防治
1、噬菌体与发酵工业
2、发酵液感染噬菌体后的症状
3、预防噬菌体的措施
4、感染噬菌体的补救措施
1、噬菌体与发酵工业
利用细菌或放线菌进行的发酵最容易受到噬菌体的污染。而且由于噬菌体的感染力相当的强，传播蔓延的速度惊人，因而，一旦发酵液感染了噬菌体，非常难于防治。最终给发酵业带来巨大的损失。
2、发酵液感染噬菌体后的症状
当发酵液受到了噬菌体严重污染时，会出现如下的现象：
①、发酵周期明显延长；
②、碳源消耗缓慢；
③、发酵液变清，镜检时，在大量异常菌体出现；
④、发酵产物的形成缓慢或根本不形成；
⑤、用敏感菌作平板检查时，出现大量的噬菌斑；
⑥、用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在，
3、预防噬菌体的措施
要防治噬菌体的危害，首先要建立“防重于治”的观念。预防的措施主要有：
①、绝不使用可疑的菌种；
②、严格保持环境卫生；
③、决不排放或随便丢弃活菌液，环境中存在着活菌，就意味着存在噬菌体赖以增殖的大量的宿主，其后果是极其严重的。
④、注意通气质量，空气过滤器要保证质量并经常进行严格的灭菌，空气压缩机的取风口应设在30到40米的高空。
⑤、加强管道及发酵罐的灭菌。
⑥、不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种。
⑦、严格执行会客制度。
4、感染噬菌体的补救措施
如果预防不成，一旦发生了噬菌体的污染时，要及时采取合理的措施：
1)、尽快提取产品
发现污染时，此时的发酵液的代谢产物含量已很高，即应及时提取或补加营养并接种抗噬菌体的菌种后继续发酵，以挽回损失。
2)、使用药物抑制
目前防治噬菌体污染的药物还很有限，在谷氨酸发酵中：
①、加入某些金属螯合剂可抑制噬菌体的吸附和侵入；
②、加入1-2μg/ml金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或0.1-0.2%的“吐温60”、“吐温20”或聚氧乙烯烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增殖或吸附。
3)、及时改用抗噬菌体生产菌株
第一节发酵染菌的分析
第二节染菌对发酵的影响
第三节杂菌染菌的挽救与处理
第四节杂菌染菌的途径和防治
第一节发酵生产中杂菌的检查与防治 一染菌的检查与判断 凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查的方法要求准确、快速。目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种： 1．显微镜检查 一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。 优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。 缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难； （2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野； （3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。 2．平板检查 若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。 优点：（1）适于固形物多的发酵液； （2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。 缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时； （2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。 （3）检查过程需严格执行无菌操作技术。 3．肉汤培养检查法 此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨0.8%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，1%酚红溶液0.4%，pH7.2）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。 此法还可用于检查培养基灭菌是否彻底，取少量培养基接入肉汤中，培养后观察肉汤的浑浊情况即可。 4．根据发酵过程中的异常现象来判断是否染菌
工业发酵染菌的防治和灭菌试题 一、选择题 1.在化学消毒剂中，通过凝固蛋白作用杀菌的是（ ） A 新洁尔灭 B 乙醇 C 甲醛 D 拮抗 2.化学消毒剂（ ）是能损伤细菌外膜的阳离子表面活性剂 A 福尔马林 B 结晶紫 C 漂白粉 D 新洁而灭 3.下列抗生素作用机制中，抑制细胞壁合成的是（ ） A 利福霉素 B 四环素 C 两性霉素 D 青霉素 4.实验室常规高压蒸汽灭菌的条件是（ ） A 135℃—140℃，5—15秒 B 72℃、15秒 C 121℃，30分钟 D 100℃，5小时 5.使用高压锅灭菌时，打开排汽阀的目的是（ ） A 防止高压锅内压力过高，使培养基成分受到破坏 B 排尽锅内有害气体 C 防止锅内压力过高，造成灭菌锅爆炸 D 排尽锅内冷空气 6.出于控制微生物的目的，灭菌一词指的是( )。 A 除去病原微生物 B 降低微生物的数量 C 消灭所有的生物 D 只消灭体表的微生物 7.高压灭菌器杀死微生物需要下列所有条件，除了( )之外。 A 蒸汽温度121℃ B 15分钟 C 每平方英寸15磅压力 D 10个大气压的体积 8.消毒剂与防腐剂的差别是( )。 A 消毒剂仅用于非生物的物体，而防腐剂用在皮肤表面 B 消毒剂杀死细菌的芽孢，而防腐剂不能 C 消毒剂不能灭菌，防腐剂可以 D 消毒剂是化学物质，而防腐剂不是化学物质 9.干热法常用于( )灭菌。 A 盐溶液 B 细菌培养基 C 油料物质 D 医院的毛毯 10.紫外线辐射主要作用于微生物的( )。 A 糖类 B 酶类 C 核酸 D 细胞壁 11.环氧乙烯广泛用于( )。 A 灭菌塑料制品 B 消毒台面 C 杀死皮肤表面的细菌 D 灭菌化学溶液 12.为使醇类制菌效果显著，所用化学试剂必须( )。 A 用10％溶液 B 放溶液中5分钟 C 用丁醇 D 完全浸没在溶液中 13.所有下列情况均是抗生素抑制微生物的方法，除了( )之外。 A 抗生素抑制细胞壁合成 B 抗生素干扰细胞膜功能 C 抗生素阻止能量从ATP释放 D 抗生素抑制蛋白质合成 14.青霉素族的抗生素主要用于抗( )。 A 病毒 B 真菌 C 革兰氏阴性菌 D 革兰氏阳性菌 15.利用冷藏进行保存的一个缺点是( )。 A 冷藏不能杀死微生物 B 冷藏不能降低 微生物的代谢 C 冷藏能杀死可能存在的芽孢 D 冷藏降低微生物酶的活性 16.以下化合物都被批准用于食物的防腐，除了( )之外。 A 二氧化硫 B 山梨酸 C 硝酸 D 苯甲酸 17.对食品样品进行常规平板计数需要以下各项，除了( )之外。 A 细菌生长培养基 B 一些平皿
第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断 凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查的方法要求准确、快速。目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种： 1．显微镜检查 一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。 优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。 缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难； （2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野； （3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。 2．平板检查 若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。 优点：（1）适于固形物多的发酵液； （2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。
缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时； （2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。 （3）检查过程需严格执行无菌操作技术。 3．肉汤培养检查法 此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏%，蛋白胨%，葡萄糖%，氯化钠%，1%酚红溶液%，）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。 此法还可用于检查培养基灭菌是否彻底，取少量培养基接入肉汤中，培养后观察肉汤的浑浊情况即可。 4．根据发酵过程中的异常现象来判断是否染菌 （1）溶解氧水平异常变化显示染菌 每一种生产菌都有其特定的耗氧曲线，当杂菌污染时，如果污染的是好气性杂菌，会使溶解氧在较短的时间内下降，甚至接近零，且长时间不能回升；当污染的是非好气菌，生产菌的代谢由于受污染而遭抑制时，会使耗氧量减少，发酵液中的溶解氧就会升高。如味精生产上受噬菌体污染时，使菌体利用的氧气量减少，DO上升。 （2）排气中CO2的异常变化显示染菌
学生综述性论文 题目：发酵过程中染菌的分析、检测及预 防 姓名：刘莉学号：2008132114 专业：生物技术班级：083班 课程名称：微生物工程 指导教师：燕平梅 课程学期：2010至2011学年第一学期
发酵过程中染菌的分析、检测及预防 姓名：刘莉指导老师：燕平梅 （太原师范学院生物系083班学号：2008132114） 摘要：通过分析发酵过程中染菌的各种原因，总结检测染菌的方法，并提出染菌后应采取哪些措施及预防染菌的方法。 关键词：发酵；染菌；危害；检查；预防 前言：发酵工业生产中，污染杂菌造成发酵失败的事故时常发生，严重影响发酵生产，关于发酵过程是否污染杂菌，如何检测，染了菌后如何处理等等，这些问题的研究是十分有意义的。 内容： 1发酵染菌的危害 1.1不同种类的杂菌对发酵的影响 青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大 链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大 四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大 柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌 肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大 谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体 高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大 1.2不同染菌时间对发酵的影响 1.2.1种子培养期染菌 菌体浓度低、培养基营养丰富
1.2.2发酵前期染菌 杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成 1.2.3发酵中期染菌 严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成 1.2.4发酵后期染菌 如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐 1.3不同染菌途径对发酵的影响 种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性 空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐 培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性 设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大 1.4染菌对产物提取和产品质量的影响 1.4.1对过滤的影响 发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。 1.4.2对提取的影响 a.有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开 b.离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量 1.4.3对产品质量的影响 a.对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。 b.对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。 1.5染菌对三废处理的影响 使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。 2发酵过程中染菌的检查判断
第七章发酵染菌及防治 工业发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌、无污染的条件下进行生产。生产的环节比较多，既要连续搅拌和供给无菌空气，又要排放多余的空气、多次添加消沫剂、补充培养基、定时取样分析及不断改变空气量等。所有这些操作都会给防止发酵染菌带来了极大的困难。 所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵液，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。 从国内外的发酵工业的报道看，在生产中要做到完全不染菌是不可能的。目前能够做到的是提高生产技术水平，尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生染菌，要能尽快找出其中污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最低的限度。 第一节发酵染菌的分析 第二节染菌对发酵的影响 第三节杂菌染菌的挽救与处理 第四节杂菌染菌的途径和防治 第一节发酵染菌的分析 一、种子培养和发酵的异常现象 发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然会影响发酵水平，使生产蒙受损失。 异常现象为： 1、种子培养异常 2、发酵异常 1、种子培养异常 ①、培养的种子不合格 ②、菌体生长缓慢 ③、菌丝结团 ④、菌体老化 ⑤、代谢不正常 2、发酵异常 ①、菌体生长差 ②、pH值过高或过低 ③、泡沫过多
④、菌体浓度过高或过低 二、染菌的检查、判断 发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。 生产上要求能用确切、迅速的方法检查出杂菌的污染。常用的检查方法有： 1、显微镜检查法(镜检法) 2、肉汤培养法 3、平板划线培养或斜面培养检查法 4、发酵过程的异常现象观察法 5、其他一些异常现象如：菌体生长不良、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下降、发酵周期的异常的拖长、发酵液的粘度异常增加等来判断。 三、发酵染菌原因 1、发酵染菌的规模分析 2、不同污染时间分析 3、染菌的杂菌种类分析 四、发酵染菌的分析 第二节染菌对发酵的影响 一、染菌对发酵过程的影响 由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。 一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到发酵产物的生成，使发酵产品的产量大为降低 例如： ①、青霉素的发酵过程中，由于染菌许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵的前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使发酵过程得不到目的产物，其危害十分严重。 ②、核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需要的培养基营养丰富，因此极易受到杂菌的污染，且污染后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。 ③、柠檬酸等有机酸发酵过程中，一般在产酸后，发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵的中、后期不太会发生染菌，因此主要是要防止发酵的前期染菌。
发酵过程中染菌的有效控制及预防 邢攀科 摘要：针对微生物发酵过程中的染菌现象，分析了导致发酵染菌的几种主要原因，并提出了有效控制方法，以预防为主，及时观察分析，杜绝发酵染菌的隐患。 关键词：发酵染菌微生物发酵 前言：杂菌感染，简称染菌，普遍存在于微生物发酵工业生产中。特别是夏季，随着气温的不断升高．在丙酮、醇粮食发酵法工业生产中尤其突出[5]。发酵过程是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。 1 发酵过程对设备的要求 1.1发酵罐 发酵罐在使用之前，需要进行认真检查，以消除染菌隐患，如搅拌系统转动有无异常;机械密封是否严密:罐内的螺丝是否松动;罐内的管道有无堵塞;夹层或罐内盘管是否泄漏;罐体连接阀门严密度等等。机械密封目前在发酵罐上得到广泛应用，取代了以前搅拌轴采用的填料密封形式，但是由于安装精度不高或选用的机械密封不合适，仍然会由于轴封泄露造成染菌，因此在安装搅拌轴时要注意对中，为了便于观察罐内发酵情况，在人型发酵罐内一般设置有冲洗视镜的蒸汽管道，但是蒸汽一旦冷凝在管道中，冷凝水并不能完全保证无菌，因此冲洗视镜的蒸汽管道要去除，杜绝染菌隐患。如果罐内雾气大看小清楚，可以采用更高亮度的视镜灯[6]。 1.2发酵罐附属设备 发酵罐附属设备有空气净化系统，温度、压力流量等控制系统及相应的管道阀门。哪一个环节出问题都会造成发酵失败[3]。 1.2.1空气净化系统 传统的空气净化使用活性炭、棉花、超细玻璃纤维纸做过滤器Ul，过滤效果差，操作复杂。目前国内的膜过滤技术比较成熟，用偏二氟乙烯((PVDF)制成的折叠微孔滤膜滤芯，过滤精度高，流量大。使用时只要注意过滤器前压缩空气除湿脱油，并按规范对过滤器灭菌，空气保证无菌还足没有问题的。而且PVDF膜对压缩空气中的水分不敏感，膜本身的疏水性强，使用中注意过滤器排水，解决了以前当空气湿度过大导致棉花过滤器不能使用的问题[3]。 1.2.2温度、压力流量等控制系统 发酵罐实消是对发酵培养基进行彻底的灭菌处理，利用高温过饱和蒸汽的强穿透能力使
第八章发酵过程染菌及其防治 张海龙 山东教育学院生物系 Shan Dong Institute of Education
发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。 据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5％，谷氨酸发酵噬菌体感染率1％～2％。
一、一、染菌对不同发酵过程的影响 染菌对不同发酵过程的影响二、二、染菌发生的不同时间对发酵的影响 染菌发生的不同时间对发酵的影响三、三、不同染菌途径对发酵的影响 不同染菌途径对发酵的影响四、四、染菌对产物提取和产品质量的影响 染菌对产物提取和产品质量的影响五、五、染菌对三废处理的影响 染菌对三废处理的影响第一节第一节 染菌对发酵的影响 染菌对发酵的影响
一、染菌对不同发酵过程的影响 ?由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。 ?不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。
例 1)青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发 生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。 2)核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生 物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。 3)柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌 生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。 4)谷氨酸发酵过程：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少 污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。
第八章发酵过程染菌及其防治 教学目的：1、掌握发酵染菌的影响、判断、防治及处理；2、掌握噬菌体污染的症状及防治方法。 教学方法：讲授 教学手段：使用多媒体课件 教学内容： 发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。 第一节染菌对发酵的影响 一、染菌对不同发酵过程的影响 1、青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。 2、核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。 3、柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。 4、谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。 二、染菌发生的不同时间对发酵的影响 1、种子培养期染菌 种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基地营养十分丰富，比较容易染菌。 若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。 一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。 2、发酵前期染菌 在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。 染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。 3、发酵中期染菌 发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。 有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止； 有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。 从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理。 4、发酵后期染菌 由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果
第八章 工业发酵染菌的防治
发酵染菌能给生产带来严重危害，防 止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重 要工作内容。尤其是无菌程度要求高 的液体深层发酵，污染防止工作的重 要性更为突出。
主要内容
工业发酵染菌的危害； 染菌的检查、判断及染菌原因分 析； 防治染菌的措施。
第一节
工业发酵染菌的危害
染菌：发酵过程污染杂菌的现象；
大量原材料浪费、经济巨大损失； 扰乱生产秩序，破坏生产计划； 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往 会影响人们的情绪和生产积极性； 影响产品外观及内在质量。
生产不同的品种，可污染不同种类和性质的 微生物； 不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌 量，不同培养基和培养条件又可产生不同后 果 。
发酵染菌对不同品种的影响； 不同种类的杂菌对发酵的影响； 不同时间染菌对发酵的影响； 不同染菌途径对发酵的影响； 发酵染菌对提炼、产品质量、三废治理的影 响。
1 发酵染菌对不同品种的影响
放线菌由于生长的最适pH7左右，因此染细菌为 多，而霉菌生长pH5左右，因此染酵母菌为多； 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青 霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生 青霉素酶； 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉 菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用，故容易染 细菌； 疫苗生产：一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内 外毒素，都应全部废弃。
2
不同种类的杂菌对发酵的影响
（1）污染噬菌体：
感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危 害极大。
（2）污染其它杂菌：
有些使生产菌自溶产生大量泡沫，影响通气搅 拌；有的使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使 不耐酸的产品破坏。 染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一 次染菌后会反复染菌。
染菌的检查、原因分析和防止措施 1.染菌的检查与判断 在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种： （1）显微镜检查 通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。 （2）平板划线培养或斜面培养检查法 先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。 噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。 培养基（PH7.0） 葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%） 上层0.5 1.0 1.0 0.5 1.0 下层0.5 1.0 1.0 0.5 2.0 （3）肉汤培养检查法 将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。 葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。 用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。
发酵染菌 什么是染菌？发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖 几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。 生物反应过程染菌的分析 种子培养异常主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。 发酵异常主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，以及糖、 氮、pH、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参数不正常。 （一）染菌对发酵的影响 生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。 不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果 1、发酵染菌对不同品种的影响 放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。 疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。 2、污染不同种类和性质的微生物的影响 1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。 （2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。 例如： 青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大 链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大 四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大 柠檬酸发酵：污染青霉菌 肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌谷氨酸发酵：污染噬菌体 高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体 3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌