第一章基因工程概述
第一节基因操作与基因工程
基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。
基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。
第二节基因工程是生物科学发展的必然产物
一、基因是基因重组的物质基础
遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。基因工程的理论基础：
⑴. 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。
⑵. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。
⑶. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。
(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。
自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实
基因工程的技术基础：
⑴. DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的开始）。
⑵. 克隆载体的发展与应用。
⑶. 大肠杆菌转化体系的建立。
⑷. 琼脂糖电泳技术的应用。
⑸. DNA测序技术的应用。
⑹. 核酸杂交技术的应用。
从技术上为基因工程的诞生奠定了基础。
四、基因工程的内容
1、基因操作原理：
（1）DNA和RNA的操作。
（2）基因克隆与功能研究。
（3）基因组学与生物信息学的应用。
2、基因工程的应用：
（1）生物反应器（bioreactor）：大规模生产生物活性分子如生长激素、胰岛素等。
（2）遗传改良（genetic improvement）、分子育种（molecular breeding）、设计构建新物种。
（3）基因治疗（gene therapy）：人体转基因或基因组编辑。
第三节基因的结构——基因操作的理论基础
一、基因的结构组成对基因操作的影响
1、基因及其产物的共线性：一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一一对应。
N个氨基酸=3N个编码碱基。
2、基因及其产物的非共线性。间断基因。
内含子（intron）是指真核基因在RNA加工过程中从原初转录本中剪去而不进入成熟RNA结构、
不具有氨基酸编码能力的一段序列。
外显子（exon）：是真核基因转录本中剪去内含子后所保留的RNA片段，它们拼接并进行适当修饰后成为成熟RNA并执行相应功能。
3、基因的重叠性与可变性：
基因的重叠性：单个DNA序列可编码一个以上的蛋白质，它们在结构上可以具有序列重复性，也可以是相互完全不同的全新蛋白质。
原因：可变性转录起始位点、可变性起始位密码子、可变性编码终止位点、可变性剪接。
开放读码框（open reading frame，ORF）：成熟mRNA中从起始密码子A TG至终止密码子（TAA、TAG或TGA之一）之间形成的一个连续的氨基酸编码区间。
以起始密码子的第1个碱基作为+1，其5’方向的第1个碱基为-1。
4、启动子和终止子
启动子（promoter）：基因转录过程中控制起始的部位，通常是位于转录起始位点5’上游的一段DNA 区间，其上有许多顺式元件。
转录起始位点（transcription start site）：起始转录的第一个碱基，也是掺入到RNA中的第1个碱基。在转录研究中记为+1，其5’方向的第1个碱基（已属于启动子而非转录区）为-1。
侧翼序列（flanking sequence）：一条核酸单链上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。
上游（upstream）：一条核酸单链上位于某一碱基的5’方向。
下游（downstream）：一条核酸单链上位于某一碱基的3’方向。
终止子（terminator）：位于基因的3’部位、终止基因转录过程的一段DNA区间。有依赖不依赖ρ因子两种。
核糖体结合位点（ribosomal binding site, RBS）：位于mRNA起始密码子及其正上游的一段区间，是核糖体结合并起始翻译过程的位点。原核和真核的RBS显著不同。
转录单位（transcription unit）/转录本（transcript）：从转录起始位点直至转录的最后一个碱基之间被转录的RNA序列，可以包含一或多个蛋白编码框。
亚克隆（subcloning）：
1、将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段，然后分别克隆到新的载体中，供进一步研究。
初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。
2、通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个载体的过程。
亚克隆技术：泛指实验室中以DNA在大肠杆菌中经典克隆操作为核心的基本技术体系。
第二章分子克隆工具酶
第一节限制性内切酶
一、限制与修饰
1、限制与修饰现象：
限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶（restriction ednonuclease）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主范围受到限制。
限制作用实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。
修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（methylase）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。
修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嘌呤A成为N6-甲基腺嘌呤，胞嘧啶成为5’-甲基胞嘧啶。限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。
3.限制性核酸内切酶的种类
据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大
类。
Ⅱ型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。
二、限制酶识别的序列
1、限制酶识别序列的长度(n)：一般为4-8个碱基对，最常见为6bp。识别位点出现频率：4n
2、限制酶识别序列的结构：多数为回文结构（palindrome）即镜像对称结构。
一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的，
还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。
3、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有在外部、两端、两侧或单侧的。
三、Ⅱ限制酶的功能和产生的末端类型
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反向重复顺序，具有180°的旋转对称性，即回文结构。
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的末端类型。
1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5’突出和3’突出的粘性末端（cohesive/sticky end）两种。
2、平末端（blunt end）：任何平末端酶的酶切产物可以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右。
3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向性。
4、同裂酶（isoschizomer）：不同的酶识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、同序异切酶、同功多位酶和其它类型。
例：SmaⅠ(CCC↓GGG)和XmaⅠ(C↓CCGGG)
5、同尾酶（isocaudarner）：不同限制酶识别序可以相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构建中有较大用途。
例：XhoⅠ(C↓TCGAG)与SalⅠ(G↓TCGAC)、
BamHI(G↓GATCC)和BglⅡ(A↓GATCT)
6、归位内切酶（homing endonuclease）：一些线粒体、叶绿体、核DNA和T偶数噬菌体的内含子编码内切酶（称为I-prefix）或内含肽（intein）具有内切酶活性（称为PI-prefix）。它们识别序列很长，核心识别序列一般为10-12bp，识别位点极少。
四、DNA末端长度对限制酶切割效率的影响
限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序列两侧具有一定长度的DNA，否则会降低切割效率。
对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoRⅠ等，只要一个侧翼碱基即保证90%的效率。
对侧翼长度敏感性高的酶有AccⅠ、HindⅢ、PstⅠ等，侧翼3个碱基以上也未必理想。
设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列的选择也很重要。
限制酶的活性单位（unit）：1个单位的酶是指在建议的缓冲液及温度下，在20μl反应液中反应1h，使1μg DNA（多用λ）完全消化所需要的酶的量。
五、位点偏爱
某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏爱。
某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性不同。λ噬菌体DNA为48502bp，两端为12bp粘性末端。EcoRⅠ酶切割λ噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ对腺病毒2DNA不同位置切点的切割速率也不同。
由于位点偏爱性，λDNA用HindⅢ消化而制备的λHindⅢDNA marker中4.3kb条带甚至比2.0kb 条带还弱。
原因：切割时需要同时与2个识别位点作用（如NarⅠ等），或识别和切割时要求在DNA上有2个明显不同的结合位点，其中1个是另1个的被切割时起激活作用的变构位点。
应对办法：超量用酶、延长切割时间。
七、限制酶的星活性(star activity)
在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列不同但相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。
产生原因：
①反应体系中甘油的浓度大于5%。
②酶用量过大，大于100 U/μg DNA。
③低离子强度，小于25 mmol/L。
④高pH，大于8.0。
⑤含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。
⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。
易发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。
办法：对因改进。
八、单链DNA的切割
多数限制酶很难切割单DNA模板。
部分限制酶除切割双链DNA外，还可切割单DNA，但活性一般都不高。
切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要加一个N。
九、酶切位点的引入
现代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方便进向目标位置引入设计的酶切位点。
通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位点，对具体情况的分析在设计中有价值：5’突出末端补平后重连；
同尾末端连接；
平末端连接。
十、影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度
DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。
可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量，1μg DNA用10U酶
加大反应总体积
延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GA TC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、Mbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。
大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。
采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。
十一、基因组中酶切位点分布的不均一性
在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。
大肠杆菌中六碱基识别的酶SpeⅠ平均60kb才出现1次。
酵母中重复序列以外富含GC的识别序列较少。
哺乳动物基因组中CG序列只有随机概率值的1/5，且多数发生胞嘧啶甲基化，SmaⅠ位平均约65kb 才出现1次。
果蝇和线虫中CG基序虽然少，但不发生甲基化。
限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。
④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
⑤正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的DNA。
Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途
①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。
②建立DNA分子的限制酶图谱。
③构建基因文库。
④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。
⑤改建质粒。
第二节甲基化酶
一、甲基化酶的种类
原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase），又称甲基转移酶（methyltransferase），大肠杆菌中有3种。
三、甲基化对限制酶切的影响
1、修饰酶切位点：敏感的酶不能切开。
2、产生新的酶切位点：为依赖于甲基化的限制酶创造切点。
3、对基因组作图的影响：哺乳动物具有较多的m5CG序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的m5CG甲基化不彻底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响。
植物的基因组DNA的甲基化程度高，作图时也要求选用对m5CG甲基化不敏感的限制酶。
第三节DNA聚合酶
DNA聚合酶（DNA polymerase）的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTPs等情况下）及其相辅的活性。
真核生物有4种DNA聚合酶：α、β、γ、线粒体型。
原核生物有3种DNA聚合酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment)
（1）Klenow酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’核酸外切酶活性。
（2）Klenow酶的基本用途（可被T4 DNA聚合酶代替）：
补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹陷末端
抹平DNA的3′粘性凸出末端
DNA片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成
双脱氧末端终止法测定DNA序列
三、T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase)
（1）T4 DNA酶的基本特性：
有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3的DNA聚合酶活性。
在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切
－在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。
－在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。
四、T7噬菌体DNA聚合酶(T7 phage DNA polymerase)
持续合成能力最强
有3’→5’外切酶活性是Klenow酶的1000。
可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。
五、耐热性的DNA聚合酶（第八章详讲）
来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。
高温下具有5’→3’DNA聚合酶活性，一般在72℃最理想。
有5’→3’外切酶活性。
具3’→5’外切酶活性者具校正（proofreading）功能，如Pfu。否则无校正功能，如Taq。
用于PCR扩增。
反转录酶：是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板聚合cDNA链，具有5′→3′的DNA 聚合酶活性、5′→3′的RNA外切核酸酶活性和RNase H活性，但缺乏3′→5′RNA外切核酸酶活性，所以反转录过程中无校正功能。
末端转移酶：是不依赖于模板的DNA聚合酶，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。
可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末端标记。
第四节其它分子克隆工具酶
一、依赖于DNA的RNA聚合酶
依赖于DNA的RNA聚合酶A TP（DNA dependent RNA polymerase）包括SP6噬菌体和T4噬菌体RNA聚合酶。
活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。
用途：体外合成RNA分子作探针等。用于表达外源基因的mRNA，然后用于翻译蛋白。
二、DNA连接酶(DNA ligase)
DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。
1、T4 DNA连接酶的作用机制：
①A TP + DNA ligase (E)→E-AMP + PPi。
②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，释放出酶。
③活化的5’磷酸根与相邻的3′羟基形成3’,5’-磷酸二酯键，并释放出AMP。
3、平头双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多。
提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）。
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。
加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用。
加入单价阳离子（NaCl）,最终浓度150-200 mmol/L。
第三章基因工程载体
一、基本概念
利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆(gene cloning)。
克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。
基因文库(gene library)：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。
载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA 分子。
二、分类
按载体功能分：克隆载体、表达载体
按载体性质分：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体
表达体系载体宿主
原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌
酵母表达体系大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒酵母
转基因植物体系大肠杆菌-农杆菌穿梭载体（Ti质粒）、病毒等植株
哺乳细胞表达体系大肠杆菌-病毒穿梭载体、脂质体等培养动物细胞
基因直接导入DNA本身（基因枪微粒轰击法、注射法等）生殖细胞、体细胞、个体
三、基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点
※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点
※（3）具备合适的筛选标记
※（4）具备合适的拷贝数目
（5）分子量要相对较小
（6）在细胞内稳定性要高
（7）易分离纯化
※表示载体必须具备的条件
第一节质粒载体
一、质粒(plasmid)的基本特性
Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状DNA (covalently closed circular, cccDNA)，大小为1-200kb，可以持续稳定地处于游离状态，但一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制。
编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此应用广泛。
1、质粒的复制：由复制子(ori，复制起始区及与此相关的顺式作用元件)决定。质粒复制的机理请见教材。
2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMB1或ColE1。
pUC系列载体中的突变型pMB1复制子可达500-700个拷贝。
3、质粒的不亲和性(incompatibility)：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选择。不相容群。
4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌的接合(conjugation)的作用而转移到新的宿主细胞中。三亲杂交法。
质粒载体应具备的条件：
1 有特定的复制起始子。
2 有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；
2 有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；
3 有一定容量；
4 有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。
二、标记基因
1、转化子标记基因：用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。
Ampr（氨苄青霉素抗性基因）：水解β-内酰胺环。
Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。
Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移酶。
Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖苷磷酸转移酶。
supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性tRNA，可翻译UAG为酪氨酸。赭石突变（UAA），乳白突变（UGA）。
正向选择标记：蔗糖致死基因sacB。
2、重组子标记基因：用于将重组子与非重子区别开来。
α-互补(αcomplementation)：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段(lacZ’)，二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完全活性的LacZ酶。
多克隆位点(multiple cloning site，MCS)：载体上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体与外源片段的重组。
插入失活(insretional inactivation)：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。
蓝白斑筛选(white-blue screening)：空载体转化子经IPTG诱导表达后，由于α-互补而形成的功能性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载体的转化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑不显蓝色(白斑) ；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。
三、质粒载体的种类
质粒的发展阶段
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3、T7、SP6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成
含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。pUC18与pUC19只是多克隆位点的排列方向相反，其余一致。
表达载体：一般是在克隆的载体上添加和完善了用于外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯化标签、信号肽、诱导表达元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。
第二节λ噬菌体载体
一、λ噬菌体的分子生物学
λ噬菌体的组成结构和用途
噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。
λ噬菌体为线性双链DNA的细菌病毒，具有互补的12bp粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。
λ噬菌体基因大致分为4个区：
结构区：A～J 19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区。组区att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。调控区启动子、终止子和N、CI基因。裂解区：Q-R。
λ噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的λDNA，换入相应长度的目的基因。
基因文库构建常使用λ载体。
不少先进的质粒应用λ组件进行构建。
四、λ载体的克隆原理和步骤
1、通过裂解过程增殖λ载体。
2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、右臂，并进行去磷酸化处理。
3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。
4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白，包装过程对DNA大小有选择性。
5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过λ的复制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个λ的感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。
6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组λ，所有噬菌斑的集合就为一个文库。
pfu: plaque forming unit，噬菌斑形成单位，指每微克包装λDNA感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要求100万以上。
第四章人工染色体载体
第一节粘粒载体
一、粘粒的结构特征和用途
粘粒实际是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒。cos序列是l噬菌体DNA中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。粘粒的组成包括质粒复制起点、抗性标记、cos位点，因而能像质粒一样转化和增殖。
它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。
二、粘粒载体的工作原理
粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于l噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片段包装到l噬菌体颗粒中去。
允许插入片段为30-45kb。
三、粘粒克隆载体
粘粒pJB8、含双cos位点的粘粒载体、pcos1 EMBL等。
四、粘粒载体文库的扩增和贮存
噬菌体颗粒状的粘粒文库在含有几滴氯仿的SM溶液中可以保存几周。
可以采用影印到硝酸纤维素膜上保存、挑取所有菌落混合培养后深冷保存，等。
第二节酵母人工染色体载体
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome，YAC）：就是模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体。
一、YAC载体的复制元件
Y AC载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。
端粒重复序列：是定位于染色体末端的一段序列，用于保护线状DNA不被胞内的核酸酶降解，已形成稳定的结构。
着丝粒：是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。
二、YAC载体的工作原理
Y AC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图示是pYAC4载体的遗传结构图，当用BamHⅠ切割成现状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要順式元件。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。
允许插入片段大小：没有限制，一般为250-1500kb。
YAC的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，Y AC与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。YAC的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA片段有更强的容忍性，文库的代表性强，适合作真核染色体片段功能研究。
第三节细菌人工染色体载体
细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome，BAC）：就是基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。
F质粒：是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和结合过程的蛋白质。
一、BAC载体及其结构组成
BAC载体大小约7.5kb，其本质是一个质粒克隆载体。BAC载体与常见克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性。复制单元来自F质粒
二、BAC载体工作原理
BAC载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。不同的是，BAC载体装载的是大片段DNA，一般在100～300kb。对如此大的DNA片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另外，由于BAC载体的拷贝数小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将BAC载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。第四节P1噬菌体载体和P1人工染色体载体
一、P1噬菌体的分子特征：
双链线状DNA，110kb，末端具有10kb左右冗余序列，感染进入大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环状分子，cⅠ决定进入溶原或裂解状态。
包装方式与λ不同。
二、P1噬菌体载体元件：复制元件、环化和包装信号、标记基因、克隆位点、填充片段。
P1噬菌体载体工作原理：与粘粒相似。
三、P1人工染色体载体：
结合了P1噬菌体载体和BAC载体的最佳特性，如pCYPAC1，允许外源片段为130-150kb，采用电转化，外源片段的嵌合和重组现象较低，对重组序列的回文结构的忍受性强。
第五章表达载体
第一节大肠杆菌表达载体
一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。
均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。
1、表达元件(expression elements)：
1）启动子(promoter)：三类，即
lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。
T7噬菌体启动子
λ噬菌体的PL启动子。
2）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要，一般3-11bp。
2、表达形式
完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。
融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。
3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG
防渗漏表达系统：lacIq
PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。
4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。
信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。
四、表达产物的纯化
1、包涵体(inclusion body)的纯化：许多情况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胍、尿素和SDS溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。
有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后就没有活性了，但可作为抗原。
2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内呈可溶状态，也有少量进入细胞周质区。将细胞裂解物的上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
第二节穿梭载体
**穿梭载体(shuttle vector)：能够在两类不同的宿主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。
只要涉及大肠杆菌以外的细胞，绝大多数载体都装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。
一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽孢杆菌的穿梭。
二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，如磷酸化、糖基化等。
三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的Ti质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。
第三节整合载体
整合载体(integration vector)：用于将某个基因或某些基因插入到宿主的染色体中去工作，按整合方式可分为定点整合和随机整合两类，按作用可分为目的基因的插入/敲除或随机突变体库的构建。
一、基因插入/基因敲除
同源重组整合载体最为常用，不仅含有大肠杆菌克隆载体的骨架，还有一段便于同源重组的重组DNA 片段。
二、随机插入突变载体
用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。
随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入到基因组中而形成的众多基因突变体的集合。
1、微生物插入突变体库：如pEG922，需要借助转座子。
2、构建植物突变体库所用的载体：
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的T-DNA插入或植物转座子(transposon)标签是植物基因功能研究中常用的产生突变体的方法
1）T-DNA插入突变体：植物转基因过程中T-DNA区段如果插入到一个功能基因中，会导致该基因插入失活而产生性状变化，形成突变体。
还可以在T-DNA区段构建基因激活标签、基因陷阱(gene trap)、启动子陷阱(promoter trap)或增强子陷阱(enhancer trap)，用于直接克隆靶基因编码区、启动子、增强子等。
对于突变基因，只需要采用反向PCR或锚定PCR扩增或通过筛选文库，就可以直接克隆得到其序列。2）植物Ac-Ds转座子双因子插入突变：玉米Ac (activator)因子是一个转座子，含有完整的转座酶，Ds (dissociation)是Ac缺失转座酶基因的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac和Ds的质粒载体载体并分别转化植物，转基因植株杂交(Ac×Ds)后代中会发生转座事件而产生突变体。
利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因
3）构建动物随机突变体库常用载体：用基因陷阱。
基因陷阱的基本原理是通过携带有报告基因的载体随机整合到动物或其它生物染色体，干扰内源基因的功能，并标记被插入的基因，然后克隆之，方法同前面的植物的方法一样。
动物的转化方法与植物不同，一般采用电转化、反转录病毒转染、注射法等。
第六章基因操作中大分子的分离和分析
第一节DNA的分离、检测和纯化
**天然DNA来源:①染色体DNA。②病毒和噬菌体DNA。③质粒DNA。④线粒体和叶绿体DNA。
一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化
分离质粒DNA的方法众多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱裂解法、煮沸法、去污剂 (如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。
1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理
碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。
◆在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
◆通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
**碱抽提法所用试剂的作用
提取过程中所用的材料有LB培养基、TE缓冲液、溶菌酶液、溶液Ⅰ即葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/L Tris?HCl；pH8.0，lOmmol/L EDTA)、溶液Ⅱ即NaOH-SDS溶液、溶液Ⅲ即3mol/L乙酸钾溶液、酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇、异丙醇、100%乙醇、70%乙醇等。
①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。
葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。
②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2 mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R-O-S03-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。
③KAc: pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
高盐3mol/L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。
④无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
⑤酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
2 通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA
二、基因组DNA的分离
1、CTAB法
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇或异丙醇进行沉淀，即可使核酸分离出来。
该法的优点是适应面广，对任何生物的基因组DNA提取均有效，产量高，缺点是DNA沉淀如果乙醇漂洗不充分，污染在DNA产物中的CTAB对后续实验有明显的抑制作用。
2、SDS法
以含EDTA、SDS、RNA酶的裂解液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，通过乙醇沉淀，获得DNA。
该法的优点是简便，适应面也较强，效果也不错，缺点是DNA产量稍低，且DNA稍易氧化变黄。
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1、凝胶电泳的基本原理
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。
电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。
2、影响电泳迁移速率的因素：
1 ）分子筛效应
DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带
负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
2）相对分子质量
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
DNA样品与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。
3）构型
在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋(SC)的共价闭合环状(CCC)结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。
3、DNA的琼脂糖凝胶电泳
1）DNA的显示原理：
制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭(EB)在紫外光照射下能发射桔红色的荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5～lOng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1μg的DNA。
2）影响电泳迁移的主要因素：
◆DNA的大小
◆DNA的构象
◆琼脂糖浓度
◆缓冲液：乙酸盐缓冲液(TAE)、硼酸盐缓冲液(TBE)、磷酸盐缓冲液(TPE)。
**分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度
3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程
A、缓冲液制备
B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存
C、将点样梳洗净干燥放入胶板中
D、琼脂糖胶板的制备：
称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微波炉中融化。融化好后冷却到60℃左右，加入EB溶液，至最终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入放置好的点样梳的胶板中，排走气泡。室温放置30-45min。
E、加样和电泳：
将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，排出加样孔内的气泡，用微量移液枪加入DNA样品。接通电源，调好电压和电泳时间。可根据溴酚兰的位置结束电泳，关闭电源。
F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距拍照
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳
特点：
分辨率高
适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp
载样量大
回收DNA纯度高
五、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis PFGE)
与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。
六、紫外吸收法检测DNA的浓度和纯度
紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。特点是准确、简便。
衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。
当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。
双链DNA的OD260为 1时相当于浓度为50μg/mL。
单链DNA的OD260为 1时相当于浓度为40μg/mL。
寡核酸的OD260为 1时相当于浓度为20-40μg/Ml
七、DNA片段的纯化
根据实验要求不同，有时需要高纯度的DNA，对提取的DNA样品须进一步纯化并除去溴化乙锭(EB)。先后出现的DNA纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、“基因纯”试剂纯化、Glass Milk（bead）结合法、Qiagen柱纯化等，目前以后两种方法的试剂盒法最常用，简单且效果好。
**透析袋电洗脱法
?适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。
?DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。
?切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。
?吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。
?转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心
后上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。
**DNA的浓缩
当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法有：
乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等
第二节RNA的分离、检测和纯化
细胞中的核酸：DNA和RNA。
RNA：rRNA、 tRNA、 mRNA 。
一个典型哺乳动物细胞约含10-5μg RNA。
－80%～85% rRNA(28S、18S、5S rRNA)。
－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核内小分子RNA等）。
－1%～5% mRNA，一般按2%计算。
?**实验成败关键：创造一个无RNase的环境
去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)
抑制内源性RNase的活性
RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非竞争性抑制剂）
氧铜核糖核苷复合物硅藻土
**RNA的抽提与纯化
总RNA的制备
1、酚-异硫氰酸胍抽提法（TRIZOL法）
Invitrogen公司产品，核心是利用胍盐使蛋白质迅速变性，RNA酶也迅速失活，因此RNA降解风险小，完整性好。由于是酸性溶液，DNA随杂质一起沉淀，而RNA则溶液在溶解在溶液中，通过离心去渣、上清乙醇沉淀、再离心后，得到RNA沉淀，稍事漂洗和干燥后，溶解即可。
2、硅胶膜纯化法
以Qiagen公司的Rneasy试剂盒为代表，将生物材料的异硫氰酸胍裂解液上到离心柱上，柱芯中的硅胶膜选择性地吸附RNA，而其它杂质则在随后的步骤中洗去，最后将RNA洗脱下来。
真核生物mRNA的纯
从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱（或磁珠）分离mRNA。可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA
**RNA的电泳检测
?RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断， OD260为 1时相当于浓度为40μg/mL。
?检测：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
第三节分子杂交
分子杂交 (molecule hybridization)
?分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质
分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。
?根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，及由此
简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。
?分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质
与蛋白质之间进行。
?核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同
源的核酸分子形成杂合双链的过程。
通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。
四菌落原位等其它杂交
（colony in situ hybridization）
1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理,对Southern印迹技术作了一些修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。
**菌落原位杂交的操作步骤
五 DNA微阵列分析（DNA microarry）
●又称基因芯片技术，是一种高通量的斑点杂交技术。将大量的DNA分子（一般为50-70nt的寡核苷酸）固定在支持物上，并与标记的样品杂交，然后通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量。
常采用Cy3和Cy5花菁类染料对样品进行荧光标记，它们的激发光为橙色和红色，为便于识别，在检测和分析过程中常将它们分别标记为绿色和红色，当二者等量重叠时为黄色。
●应用：
1、检测mRNA的表达水平或转录组，特别是检测两个样品间的差异表达谱。
2、比较基因组杂交研究，检测基因组中DNA拷贝数变化。
3、检测mRNA结构如剪接位点、转录起始位点、转录终止点等。
4、基因组重测序及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）分析。
**探针标记方法：
1）PCR标记：采用PCR扩增的方法将放射性或非放射性标记的dNTP整合进入双链PCR产物中。2）随机引物标记：采用短链随机引物指导探针DNA的合成，并完成标记的掺入。
3）缺口平移标记：采用DNase和DNA聚合酶进行探针合成，完成标记的掺入。
4）末端标记：采用末端转移酶（TdT）或多核苷酸激酶向DNA末端添加标记性的核苷酸，完成标记的掺入。
5）化学合成法标记：采用化学合成法合成探针的同时完成标记的掺入，常用在寡核苷酸探针的合成
上。
6）体内合成标记：将探针模板克隆到M13噬菌体或其它载体上，在大肠杆菌体内合成标记性的RNA 或DNA探针。
注：所有双链探针在杂交之间必须变性成单链后才能使用。
第四节重组DNA分子导入受体细胞
细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
●转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。
转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。
●转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程。
●转导(transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程。
一选择受体细胞的基本原则
1、便于重组DNA分子的导入。
2、便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。
3、遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
4、受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。
5、安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞
6、能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。
7、受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。
8、具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。
9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
二重组质粒DNA转化大肠杆菌
（一）氯化钙法
● 1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌体DNA。1972年美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。
●原理是：细菌处于0℃和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性增加,菌体膨胀成球形，此时转化混合物中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经短暂热休克(42℃)后，细胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内。
●如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得5×107～1×109个转化子。
**获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：
1、用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在A600为0.5左右为好。
2、制备受体细胞的整个过程在0～4℃进行,尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照受体菌应该在此培养基上不生长。
3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSB溶液。
二）电穿孔法
电穿孔法(electroporation):是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许DNA 等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。
最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功应用于大肠杆菌的转化。其基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA
的有效吸收。
电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每μg DNA可以得到109～1012转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡时，转化水平达到最高。
第七章基因操作中的核酸分析技术
第一节DNA和蛋白质相互作用分析
1、一、凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）
又叫DNA迁移率变动实验（DNA electrophoresis mobility shift assay, EMSA），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质间相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被作为鉴定或分离纯化与特定DNA结合的蛋白质的一种典型的实验方法。
2、二、DNaseⅠ足迹实验（footprinting assay）
是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。
3、甲基化干扰实验和体内足迹实验
三甲基化干扰实验、
根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。
DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。
具体操作如下页图所示。
四酵母单杂交技术
酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
缺点：由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录，因此往往产生假阳性结果。如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的Gal4AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD 融合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性结果。
五染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）
是基于体内分析发展起来的。基本原理是：在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它
能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
六DNA-蛋白质相互作用研究技术的新进展
1、SELEX与核酸适体技术：核酸适体（aptamer，源于拉丁语）指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。而体外筛选技术SELEX是指对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程。
2、荧光标记技术
3、扫描探针显微镜技术
4、表面等离子共振技术
第三节RNA干扰技术
RNAi（RNA interference ，RNA干扰）技术：利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断靶基因的表达，使细胞胞出现靶基因缺失、类似突变体的表型。
dsRNA：双链RNA；
siRNA：short interfering RNA，小分子干扰RNA。
第八章
4、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。
首先待扩增DNA?模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。?这种热变性-退火-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
5、PCR过程：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
6、PCR反应体系（1、缓冲液Mg2+是DNA聚合酶的激活剂（2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)
dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓度为0.2mmol/L左右。
（3、引物PCR 引物的设计一般原则
（1.）引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。
（2.）解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm 值计算公式见书，但比实际值往往偏低
（3.）避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。（4.）要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末端碱基序列互补的，
思修期末复习要点 绪论 1.新时代开始的时间：十八大开始 2.中国特色社会主义进入新时代意味着什么？ ○1意味着近代以来久经磨难的中华民族迎来了从站起来、富起来、到强起来的伟大飞跃；迎来了实现中华民族伟大复兴的光明前景； ○2意味着科学社会主义在21世纪的中国焕发出强大的生机与活力，在世界上高高举起了中国特色社会主义的伟大旗帜； ○3意味着中国特色社会主义道路、理论、制度、文化不断发展，拓展了发展中国家走向现代化的途径，给世界上那些既希望加快发展又希望保持自身独立性的国家和民族提供了全新选择，为解决人类问题贡献了中国智慧和中国方案。 3.时代新人应该怎么做？ ○1要以民族复兴为己任； ○2做有理想、有本领、有担当的时代新人； ○3提升思想道德素质与法律素养。 第一章 1.人生目的:是指生活在一定历史条件下的人在人生实践中关于自身行为的根本指向和人生追求； 2.人生目的的作用：人生目的是人生观的核心，在人生实践中具有重要作用；人生目的决定人生道路、人生态度和人生价值选择； 3．个人与社会的辩证关系 ○1个人与社会是对立统一的关系，两者相互依存、相互制约、相互促进； ○2个人与社会的关系，最根本的是个人利益与社会利益的关系； ○3在社会主义中，个人利益与社会利益在根本上是一致的； ○4社会利益体现了作为社会成员的个人的根本利益和长远利益，是个人利益得以实现的前提和基础，同时它也保障着个人利益的实现。 4.正确的人生目的：服务人民、奉献社会。 5.人生价值的评价方法： ○1坚持能力大小与贡献须尽力相统一； ○2坚持物质贡献与精神贡献相统一； ○3坚持完善自身与贡献社会相统一。 6.什么是人生观？ 人生观是人们关于人生目的、人生态度、人生价值等人生问题的总看法和总观点7.正确的人生观 ○1科学高尚的人生追求：服务人民、奉献社会； ○2积极进取的人生态度：认真、务实、乐观、进取。 8．三种错误的人生观：拜金主义、享乐主义、极端个人主义.
1.再现论与表现论 再现论：文学是对现实的模仿，具有实践性。亚里士多德是再现论的奠基人。在中国，最早的文学作品是《二言弹歌》，“断竹续竹，飞土逐肉”再现当时人类的生存环境。 优点：①对文学艺术的源泉做出了唯物主义的解释。 ②十分重视文学艺术的认识价值。 ③引导作家深入生活。 缺点：①没有分清艺术与科学的界限，认为两者的本质都是给人以真知，只不过科学是以概念来把握生活，文学以形象来反映生活。 ②艺术创作的目的是为了逼近生活，以忠于现实，逼肖现实作为创作于批评 的最高标准，忽视作者对生活的情感体验。 表现论：文学是心灵的表现。如中国文论中意境的范畴，有我之境与无我之境。外国文论应追溯到柏拉图，他的“迷狂说”是表现论的理论基础，认为文学艺术陷入迷狂。真正对此理论作出贡献的是康德，认为知、情、意三者同样重要，作者主要表现情感。康德的表现论是是有审美标准的，理性的。此外还有弗洛伊德的“冰山理论”。 优点：重视创作主体的能动作用，揭示了文学与科学的区别，指出文学不属于认识而属于情感领域。 缺点：①把主观与客观完全对立起来，割断情感与外部世界的联系，导致创作中情感源泉的枯竭。 ②把情感与认识对立起来，割断了情感与理智的联系，导致创作中一味的情 感的宣泄。 ③把表现与规范对立起来，把表现等同于天才、灵感。 2.文学审美的特殊性 文学审美的特殊性表现在： 1)整体性：表现在两个方面，在文学中，生活是一个有机的整体；在文学中，人是一个活 生生的生命整体。例如《杜十娘怒沉百宝箱》，以外写内的文学手段，通过人物行动、外貌等表现人物的心理，杜十娘的出身青楼，对爱情的渴望，以及遇人不淑的事件决定了杜十娘必死的结局。又如在《红楼梦》中，林黛玉身在封建社会，其地位与性情以及过分看重爱情，注定她的宿命。在列夫·托尔斯泰的《安娜·卡列尼娜》中安娜未得到爱情暗示了她的死亡。 2)形象性：事物的外形是怎样的，抓住外在具体的东西。可以以外写内，例写“愁”，将 情感化具体形象，切忌将情感抽象化，或长篇大论，应找具体“意象”，融入主体感情。 3)情感性：文学以人为中心，人是有思想有感情的。而且文学形象带有主体创作色彩，文 学是有情感的价值趋向与判断，没有纯客观的形象。例如“一切景语皆情语”。审美主体将情感移情到审美客体上。 4)无功利性：文学有求真、从善的功能，最终为了求美，这里的美指的是崇高的美，壮美。 例如悲剧，美在其悲剧性，表现主人公的抗争性。文学不追求直接的功利性，而是追求情感的体验，例如歌德诗体小说《少年维特之烦恼》，艺术影响很大，艺术追求积极健
文学观念与文学本体 1、美国学者艾布拉姆斯在哪部着作中提出了文学四要素，分别是什么 《镜与灯——浪漫主义文论及批评传统》 艾布拉姆斯的文学研究座标：强调文学研究要从世界、作者（艺术家）、作品、读者（欣赏者）四个角度进行，这就是着名的“四要素”说。 2、模仿说与表现说 模仿说：【从文学与生活的关系上界定文学的特点，西方有古老的“模仿说”。模仿最初是指祭祀活动中祭司表演的歌舞，后来从祭典术语转化为哲学术语，表现对外在世界的再造或复制，“模仿说”就是在这个意义上解释什么是文学的。】 模仿说的文学观在亚里士多德的《诗学》中得到了详尽、系统的阐述。亚里士多德认为，模仿是艺术的本质，一切艺术都是模仿的产物，并强调不同的艺术在模仿的对象、媒介和方式上具有各自的特点。在这个基础上，他进一步提出，史诗与戏剧的模仿对象是人，是人的“行动和生活”。显然，与前人偏重于模仿自然的说法相比，他更关注文学与社会生活的联系。 表现说：“表现说”的文学观认为，“一件艺术品本质上是内心世界的外化，是激情支配下的创造，是诗人的感受、思想、情感的共同体现。因此，一首诗的本原和主题，是诗人心灵的属性和活动，如果以外部世界的某些方面作为诗的本质和主题，那必须先经诗人心灵的情感和心理活动由事实而变为诗”。 表现说认为文学是对主体心灵与情感的表现和抒发。中国古代文论倾向于表现说。中国古代的“诗言志”和“诗缘情”的理论与上述的观点非常接近，特别是“诗缘情”的认识，不仅注意到主体在文学创造中的作用，而且把情感视为文学表现的主要对象，这大大推进了中国古代文论对文学特质的认识。（1）“言志说”。《庄子天下篇》最早提出：“诗以道志”。（2）“缘情说”。陆机《文赋》：“诗缘情而绮靡”。 由于叙事文学长期居于主导地位，表现说的文学观在西方产生的比较晚，直到18世纪末随着浪漫主义运动的兴起，才对文学实践发生广泛的影响。表现论是近现代西方占主导地位的文学观。（1）情感表现说。华兹华斯：诗是强烈情感的自然流露。（2）本能表现说。弗洛伊德：“艺术即做梦”，是作家愿望的实现。合理性与不足：本能表现说重视创作主体的能动性、自主性，和丰富的心理蕴涵，对文学的性质和规律有不少新的发现。但片面强调艺术的自我表现性，忽视了文学与广阔社会生活的密切关联。
绪论 一．社会主义核心价值观： 富强、民主、文明、和谐（国家层面） 自由、平等、公正、法治（社会层面） 爱国、敬业、诚信、友善（公民层面） 二．社会主义核心价值体系的基本内容？ 答：1. 马克思主义指导思想。 2. 中国特色社会主义共同理想。 3. 以爱国主义为核心的民族精神和以改革创新为核心的时代精神。 4. 社会主义荣辱观。 第一章追求远大理想，坚定崇高信念 一．理想的含义与特征 P17-18 理想是人们在实践中形成的、有实现可能性的、对未来社会和自身发展的向往和追求，是人们的世界观、人生观和价值观在奋斗目标上的集中体现。 理想具有时代性（受时代条件制约，随时代的发展而发展）、阶级性（所处阶级关系与地位不同，形成的理想也不同）、超越性、现实性、预见性（理想源于现实又超越现实。理想是人们一定社会实践的产物，同时它又超越了今天的实践；理想必须通过人们的实践活动才能实现，同时又指明了进一步实践的方向。实践产生理想，理想指引实践） 二．信念的含义与特征 P18-19 信念是认知、情感和意志的有机统一体，是人们在一定的认识基础上确立的对某种思想或事物坚信不疑并身体力行的心理态度和精神状态。 信念具有层次性和多样性。 三．在实现中国梦的实践中放飞青春理想 P34-35 立志当高远，立志做大事，立志须躬行。 第二章弘扬中国精神，共筑精神家园 一．民族精神 是指一个民族在长期共同生活和社会实践中形成的，为民族大多数成员认同的价值取向、思维方式、道德规范、精神气质的总和。 二．民族精神的基本内容 P42-44 以爱国主义为核心的团结统一、爱好和平、勤劳勇敢、自强不息伟大精神。 三．爱国主义的科学内涵和基本要求 P44-45 爱国主义体现了人们对自己祖国的深厚感情，反映了个人对祖国的依存关系，是人们对自己故土家园以及民族和文化的归属感、认同感、尊严感和荣誉感的统一。 基本要求：爱祖国的大好河山、爱自己的骨肉同胞、爱祖国的灿烂文化。 心系国家的前途与命运，把国家和人民的利益摆在首位。 四．爱国主义的时代价值 1.爱国主义是维护祖国统一和民族团结的纽带； 2.爱国主义是实现中华民族伟大复兴的动力； 3.爱国主义是实现人生价值的力量源泉。 五．做忠诚的爱国者 P52-57 1.推进祖国统一：坚持一个中国原则，推进两岸交流合作，促进两岸同胞团结奋斗，反对台独分裂图谋
文学概论知识点整理
1.再现论与表现论 再现论：文学是对现实的模仿，具有实践性。亚里士多德是再现论的奠基人。在中国，最早的文学作品是《二言弹歌》，“断竹续竹，飞土逐肉”再现当时人类的生存环境。 优点：①对文学艺术的源泉做出了唯物主义的解释。 ②十分重视文学艺术的认识价值。 ③引导作家深入生活。 缺点：①没有分清艺术与科学的界限， 认为两者的本质都是给人以真 知，只不过科学是以概念来把握 生活，文学以形象来反映生活。 ②艺术创作的目的是为了逼近生 活，以忠于现实，逼肖现实作为 创作于批评的最高标准，忽视作 者对生活的情感体验。 表现论：文学是心灵的表现。如中国文论中意境的范畴，有我之境与无我之境。外国文论应追溯到柏拉图，他的“迷狂说”是表现论的理论基础，
认为文学艺术陷入迷狂。真正对此理论作出贡献的是康德，认为知、情、意三者同样重要，作者主要表现情感。康德的表现论是是有审美标准的，理性的。此外还有弗洛伊德的“冰山理论”。 优点：重视创作主体的能动作用，揭示 了文学与科学的区别，指出文学 不属于认识而属于情感领域。 缺点：①把主观与客观完全对立起来， 割断情感与外部世界的联系，导 致创作中情感源泉的枯竭。 ②把情感与认识对立起来，割断 了情感与理智的联系，导致创作 中一味的情感的宣泄。 ③把表现与规范对立起来，把表 现等同于天才、灵感。 2.文学审美的特殊性 文学审美的特殊性表现在： 1)整体性：表现在两个方面，在文学中，生活是 一个有机的整体；在文学中，人是一个活生生的生命整体。例如《杜十娘怒沉百宝箱》，以外写内的文学手段，通过人物行动、外貌等表
2013年思修期末考试重点（ 一、填空题重点 1、社会主义道德建设的核心与原则 核心：以服务人民为核心原则：以集体主义为原则 2、维护社会公共秩序的手段 道德、法律 3、公民最基本的政治权利 选举权和被选举权（还有多余的空就填：言论、出版、集会、结社、游行、示威自由的权利） 4、刑法的基本原则 1、罪刑法定原则 2、罪刑相适应原则 3、法律面前人人平等原则 5、环境律法的基本原则 (1)经济建设与环境保护协调发展的原则(2)预防为主、防治结合、综合治理的原则(3)全面规划、合理布局的原则(4)谁污染谁治理、谁开发谁保护的原则 附加：环境立法的基本原则 第一，它的内容必须在环境立法中有所体现，是对国家环境保护基本方针、政策的描述，并且贯穿于整个环境立法之中。 第二，它的交力必须全面贯彻于环境法律规范的始终，并且可以弥补环境立法之局限性。 6、爱国主义的基本要求 (1)爱祖国的大好河山. (2)爱自己的骨肉同胞. (3)爱祖国的灿烂文化. (4)爱自己的国家. 7、法律思维方式的特征 第一，通过程序进行思考，运用法律术语进行观察，思考和判断； 第二，遵循向过去看的习惯，表现得较为稳妥，甚至保守； 第三，注重缜密的逻辑，谨慎地对待情感因素（即客观公正，以事实为根据，以法律为准绳）； 第四，法律思维追求的程序中的真，不同于科学中的求真； 第五，判断结论总是非此即彼，不同于政治思维的权衡特点。 Or 1、法律思维是主体认知客体的一种方法。 2、法律思维是主体从现象到本质以达至法律真实为最低标准的一个思考过程。 3、法律思维以法律职业者的法律知识和经验阅历为前提。 4、法律思维以法律规范和客观事实为思考质料。 5、法律思维以法治理念为价值指引，以定分止争为目的。 Or课本上： 法律至上、权力制约、人权保障、正当程序
名词解释 1.文艺学：研究文学及其规律的学科统称文艺学，它是一门以文学为研究对象，以揭示文学基本规律，介绍相关知识为目的的学科，属于人文学科的范畴。 2.文学理论：文艺学的分支之一，以文学的基本原理、概念、范畴以及相关的研究方法为研究对象，并将分析研究文学的普遍规律作为其根本任务。 3.文本：文本是指由作者写成，而有待于阅读的单个文学作品本身。艾布拉姆斯提出文学作为一种活动是由作品、作家、世界、读者等四个要素组成的。 4.文学价值：文学价值是文学作品满足人和社会需要的属性，是由作家和读者共同创造的，主客观统一的产物，主要包括认识价值、伦理价值、审美价值等。 5.文学价值的“真”：文学价值的真，是指文学要通过合乎艺术规律的方式，将社会的真实状况、人生的真正面目、作家的真诚体验等表现出来。 6.文学价值的“美”：文学价值的美，是指文学在真和善相统一的基础上，满足人们对美的追求和需要，给人精神上的愉悦。 7.文学的功能定义：文学功能是文学价值属性的实际反映和体现。文学功能存在的内在依据是文学的价值。文学的功能不是孤立地存在的，它存在于功能的系统之中。 8.文学创作（创作过程）：是指作家从产生创作动机和创作冲动到完
成艺术构思和艺术传达的过程。（这也是一部文学作品从内在心理体验到外在形式的形成过程。） 语言呈现：是作家将构思成熟的艺术形象用语言表达出来的过程。（eg ：眼中之竹到胸中之竹到手中之竹。眼中之竹山是指客观存在的竹子，而胸中之竹则是艺术构思过程中的艺术形象，至于手中之竹，已经是经过艺术传达之后的竹子，是画在纸上的画图，是最终完成的作品。） 王国维的隔与不隔：“隔”意思则是指艺术技巧使用的很拙劣，以致不能有效地调动读者情感，并使之升华为艺术情感。“不隔”第一层含义是说文字运用得恰到好处，是读者能够直接体会到诗词中蕴含的内涵而感不到丝毫的文字障碍。第二层含义是指用直书其事的方式作诗，不堆砌典故，使人不劳猜想就直接感知诗中蕴含的情感。（池塘生春草不隔，“谢家池上，江淹浦畔”，隔） 文学创作过程（创作动因、艺术构思、语言呈现）、文学创作心理机制（艺术直觉、艺术情感、艺术想象、艺术理解）、文学创作的主体条件和追求（作家与生活体验、思想道德修养与文化艺术素养、创作个性与独创性、创作自由和社会责任） 创作动因：创作动因是指作家生活体验积累到一定程度时产生的创作内驱力，包括创作动机和创作冲动。这是文学创作的开端。 9.创作动机：创作动机是指作家从事具体创作活动的目的。作家有某种思想感情需要传达，或要赞美、批评某种现存事物，或要互换某种新的社会变革等，心中有所积郁，不吐不快，于是产生了创作动机。
文学概论期末考试总结 一、选择填空 1.文艺学是一门以文学为对象，以揭示文学基本规律，介绍相关知识为目的的学科，包括三个分支，即文学理论、文学批评和文学史。 2.美国当代文艺学家M.H.艾布拉姆斯在《镜与灯——浪漫主义文论及批评传统》一书提出文学四要素的著名观点。 3.文学文化学又可以说是一种最新的文学理论形态。 4.首先是列宁用“反映”这个词说明了文学是对于生活的反映。 5.伊瑟尔提出“隐含的读者”的概念。 6.在魏晋以前，文学的文化含义是居于主导地位的。 7.查理斯·巴托作出一个意义深远的区分：诗与绘画、雕塑、音乐、艺术和修辞等纳入七种“美的艺术”之中。 8.话语的要素：说话人、受话人、文本、沟通、语境。 9.话语蕴藉的典范形态：含蓄和含混。 10.文学定义：文学是一种语言艺术，是话语蕴藉中的审美意识形态。 11.精神生产的概念最初见于《德意志意识形态》。 12.诗人的职责不在于描述已经发生的事，而在于描述可能发生的事。 13.文学创造的主题是具体的社会人。（马克思） 14.创作主体对客体审美价值的把握以感性直观为思维特征。 15.材料是文学创造的第一要素。 16.“诗意的裁判”是恩格斯评价巴尔扎克时使用的一个概念。 17.高尔基曾不无道理地把文学称之为“人学”。
18.克莱夫·贝尔提出了“有意味的形式”。 19.文学作为认识活动，以内在尺度创造艺术真实，要义是求“真”，体现为“历史理性”。 二.名词解释 1.文学本体论：文学本体论认为，文学活动的本体在于文学作品，而不是外在的世界或作者。作为本体的作品，并不是指传统理论中的内容或内容与形式的统一，而是仅仅指作品形式，即所谓“肌质”、“隐喻”、“复义”、“含混”、“语境”、“反讽”等语言学或修辞学因素。 2.话语蕴藉：话语蕴藉是指文学活动的蕴蓄深厚而又余味深长的语言与意义状况，表明文学作为社会话语实践蕴含着丰富的意义生成可能性。有两层意思：第一，整个文学活动带有话语蕴藉属性。第二，在更具体的层次上，被创造出来以供阅读的特定文本带有话语蕴藉属性。 3.艺术概括：简括地说，就是作家依据自己的体验和认识，以主体的审美价值追求能动介入的方式，对富有特征的事物给予独特艺术处理，从而在主体与客体相统一的基础上，创造既具有鲜明的独特个性又具有相当普遍意义、体现着一定审美价值取向的艺术形象之方法。 4.审美理想：也称美的理想，是指审美主体在长期社会实践和审美活动中形成的、由个人审美经验和人格境界所肯定的、融合了特定历史文化传统的关于美的理想观念或范型。特征：首先，审美理想是以理念形式存在的鉴赏的原型和最高典范。其次，审美理想是直观形象与理性观念的结合。第三，审美理想是个体性与群体性的统一。 三.简答
毛概期末复习重点知识总结 题型 单选(30 x 1 =30 多选(15 x 2 =30 简答(4 x 5 =20 材料分析(2 x 10 =20 第一章 1:中国特色社会主义理论体系包括哪些? 邓小平理论、“三个代表”重要思想(始终代表中国先进生产力的发展要求、代表中国先进文化的前进方向、代表中国最广大人民群众的根本利益、科学发展观 2::1938年,毛泽东在六届六中全会上作题为《论新阶段》的政治报告中最先提出“马克思主义中国化”这个命题。 3.马克思主义中国化的科学内涵及重大意义(大题 马克思主义中国化,就是将马克思主义基本原理同中国具体实际相结合。具体地说,就是把马克思主义的基本原理更近一步地同中国实践、中国历史、中国文化结合起来,使马克思主义在中国实现具体化。 科学内涵: 第一,马克思主义中国化就是运用马克思主义解决中国革命、建设和改革的实际问题。 第二,马克思主义中国化就是把中国革命、建设和改革的实践经验和历史经验提升为理论。
第三,马克思主义中国化就是把马克思主义植根于中国的优秀文化之中。 重大意义: 第一,马克思主义中国化的理论成果指引着党和人民的伟大事业不断取得胜利。 第二,马克思主义中国化的理论成果提供了凝聚全党和全国各族人民的强大精神支柱。 第三,马克思主义中国化倡导和体现了对待马克思主义的科学态度和优良学风,不断开拓着马克思主义在中国发展的新境界。 4. 20世纪上半叶,帝国主义战争与无产阶级革命的时代主题,是毛泽东思想形成的时代背景。中国共产党领导的革命和建设的实践,是毛泽东思想形成的实践基 础。遵义会议以后,毛泽东发表《新民主主义论》,标志着毛泽东思想的成熟。 19 45年,党的七大,毛泽东思想被确立为党的指导思想。 5.毛泽东思想理论内容及其活的灵魂: 主要内容: 一,新民主主义革命理论。 二,社会主义革命和社会主义建设理论 三,革命军队建设和军事战略的理论。 四,政策和策略的理论。 五,思想政治工作和文化工作的理论。 六,党的建设理论。
大一思修期末考试试题（选择题） 一、单项选择题（本大题共20小题，每小题2分，共40分）在每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的 ⒈人生观的核心是（ A ） A、人生目的 B、人生价值 C、人生态度 D、人生理想 ⒉世界观是人们对（ D ）的最根本看法和总和。 A 社会 B 人生意义 C 自然界 D 整个世界 ⒊人生观是（ C ）的反应。 A 自我认识 B 政治关系 C 社会存在 D 自然条件 ⒋人生的目的是对（B）这一人生根本问题的认识和回答。 A 人为什么发展 B 人为什么活着 C 人为什么工作 D 人为什么努力 ⒌人生的社会价值是个人的人生对（D）的意义。 A 自我与社会 B 集体与社会 C 自我与他人 D 社会与他人 ⒍人生的价值趋向是对（D）的意义。 A 自我价值 B 社会价值 C 价值质量 D 价值目标 ⒎理想是人在实践中形成的具有（D）的对美好未来的追求和想法。 A 实现豁然性 B 不可能性 C超越客观性 D 实现可能性 ⒏理想人的确立于（D） A 中年 B 童年 C 青年 D 青年时期 ⒐处于核心地位的理想类型（B） A 生活 B社会理想 C 道德理想 D职业理想 ⒑信念突出的本质特征（A） A“信” B“诚” C “真” D“疑” ⒒社会主义的核心是（A） A 为人民服务 B尊老爱幼 C ⒓道德是由一定的社会经济基础所决定的为其服务的（D） A 政治制度 B 文化传统 C 传统习惯 D 上层建筑 ⒔道德核心问题是( C) A物 B 自然 C 人 D 社会 ⒕为人民服务低层次的要求（A） A人人为我，我为人人 B 全心全意为人民服务 C 毫不利己，专门为人 D 人人为自己，上帝为人家 ⒖反应阶级民族或社会利益的道德( B) A 狭义 B 广义 C 高尚 D 法律规定 ⒗在一定职业生活中所遵循的具有自身职业准则的（D） A 职业规范 B职业行为准则 C 职业守则 D 职业道德 ⒘我国职业道德的本质特征( 奉献社会) ⒙伴随道德认识所表现出来一种内心体验是（C） A 道德评价 B 道德意志 C 道德情感 D 道德习惯 ⒚法律主要体现（统治阶级）的意志 ⒛法律以（B）为基础。 A 意志 B 经济关系 C 政策 D 政治
1.文艺学：研究文学及其规律的学科统称文艺学，它是一门以文学为 研究对象，以揭示文学基本规律，介绍相关知识为目的的学科，属于人 文学科的范畴。 2.文学理论：文艺学的分支之一，以文学的基本原理、概念、范畴以 及相关的研究方法为研究对象，并将分析研究文学的普遍规律作为其根 本任务。 3.文本：文本是指由作者写成，而有待于阅读的单个文学作品本身。艾布拉姆斯提出文学作为一种活动是由作品、作家、世界、读者等四 个要素组成的。 4.文学价值：文学价值是文学作品满足人和社会需要的属性，是由作 家和读者共同创造的，主客观统一的产物，主要包括认识价值、伦理价值、审美价值等。 5.文学价值的“真”：文学价值的真，是指文学要通过合乎艺术规律 的方式，将社会的真实状况、人生的真正面目、作家的真诚体验等表现 出来。 6.文学价值的“美”：文学价值的美，是指文学在真和善相统一的基础 上，满足人们对美的追求和需要，给人精神上的愉悦。
7.文学的功能定义：文学功能是文学价值属性的实际反映和体现。文
学功能存在的内在依据是文学的价值。文学的功能不是孤立地存在的，它存在于功能的系统之中。 8.文学创作（创作过程）：是指作家从产生创作动机和创作冲动到完 成艺术构思和艺术传达的过程。（这也是一部文学作品从内在心理体验到外在形式的形成过程。） 语言呈现：是作家将构思成熟的艺术形象用语言表达出来的过程。 （eg ：眼中之竹到胸中之竹到手中之竹。眼中之竹山是指客观存在的竹子，而胸中之竹则是艺术构思过程中的艺术形象，至于手中之竹，已经是经过艺术传达之后的竹子，是画在纸上的画图，是最终完成的作品。） 王国维的隔与不隔：“隔”意思则是指艺术技巧使用的很拙劣，以致不能有效地调动读者情感，并使之升华为艺术情感。“不隔”第一层含义是说文字运用得恰到好处，是读者能够直接体会到诗词中蕴含的内涵而感不到丝毫的文字障碍。第二层含义是指用直书其事的方式作诗，不堆砌典故，使人不劳猜想就直接感知诗中蕴含的情感。（池塘生春草不隔，“谢家池上，江淹浦畔”，隔）文学创作过程（创作动因、艺术构思、语言呈现）、文学创作心理机制（艺术直觉、艺术情感、艺术想象、艺术理解）、文学创作的主体条件和追求（作家与生活体验、思想道德修养与文化艺术素养、创作个性与独创性、创作自由和社会责任）创作动因：创作动因是指作家生活体验积累到一定程度时产生的创作精品文档
1、艺术产生：是一种特殊的生产形态，即精神生产。具有生产的一般性质。但决定艺术生产的本质的，并不是其物质生产性质，而是他的精神生产性质。 马克思对艺术生产有两方面含义的阐述：是艺术活动的生产实践性质。 艺术活动是作为与物质生产相对应而存在的精神生产的一种特殊生产方式。 2、寓教于乐：即诗应带给人乐趣和益处，也应对读者有所劝谕、有所帮助。 3、文学语言：文学语言是经过作家精心选择和加工、用来创造艺术世界、具有艺术魅力的语言。 4、文学风格：是文学作品中所呈现的作家创作个性，创作个性是作家的气质、人格、人生观、审美趣味、艺术才华、语言敏感等个体素质在艺术表现中形成的独特性。 5、诗可以观：诗歌可以反映社会的的盛衰、民风的好坏。 6、创作冲动：指一种迫使作家进入具体创作过程的愿望和心理。 7、二度创作：是指阅读者在阅读作品过程中在心里层面展开的再创造活动。 8、文学消费：是指购买并阅读文学作品以满足精神需求的社会过程。 9、文学：具有审美意识形态性质的、凝结个体体验的、沟通人际交流的语言艺术。 10、文学批评：也叫文学评论，是指对具体文学现象的分析、阐释、评价。换而言之，文学批评就是在鉴赏的基础上产生的带有评论性质的活动。 11、文学经典：是指在文学史上具有独创性，蕴含社会与历史意义，凝聚着很高的审美价值，具有长久生命力的典范作品。 12、潜在的文学作品：未经阅读者的文学作品作为“物”客观存在，仅具有潜在的审美意义，未被阅读之前，它的价值还处在睡眠状态，只有经过阅读、欣赏，潜在的文学作品的意义才被唤醒，成为活的文学作品。 13、文学象征：是文学形象的理想状态之一，是以表达观念和哲理为目的、以暗示为基本艺术手段、具有荒诞性和审美求解性的艺术形象。 14、艺术直觉：是指创作主体在瞬间直接把握客体审美意蕴的思维方式或能力。 15、艺术变形：是作家有意将描写对象用于不同于生活常态的变异形式表现出来，以达到某种艺术效果的过程。
2017毛概期末考试重点汇总 第一章 1.如何正确认识提出马克思主义中国化的重要意义? ⑴马克思主义中国化的理论成果指引着党和人民的伟大事业不断取得胜利。 ⑵马克思主义中国化的理论成果提供了凝聚全党全国各族人民的强大精神支柱。 ⑶马克思主义中国化倡导了对待马克思主义的科学态度和学风，开拓着马克思主义在中国发展的新境界。 2.怎样正确理解马克思主义中国化的科学内涵? 马克思主义中国化，就是将马克思主义的基本原理同中国的具体实际相结合。具体地说，就是要使马克思列宁主义这一革命科学更进一步地和中国革命实践、中国历史、中国文化深相结合起来，使马克思主义在中国实现具体化。 ⑴马克思主义中国化就是用马克思主义来解决中国革命、建设和改革的实际问题 ⑵马克思主义中国化就是把中国革命、建设和改革的实践经验和历史经验提升为理论。
⑶马克思主义中国化就是把马克思主义植根于中国的优秀文化之中。 3.怎样正确把握毛泽东思想、邓小平理论和“三个代表”重要思想各自形成发展的时代背景和实践基础? ⑴毛泽东思想：时代背景:20世纪上半叶帝国主义战争与无产阶级革命的时代主题 实践基础:中国共产党领导的革命和建设的实践， ⑵邓小平理论：时代背景：时代主题的转换 实践基础：社会主义建设正反两方面的历史经验，我国改革开放以来社会主义现代化建设新的实践，是邓小平理论形成和发展的历史和现实根据。 ⑶“三个代表”：时代背景：当今国际局势和世界格局的深刻变化 实践基础：改革开放以来特别是十三届四中全会以来党和人民建设中国特色社会主义的伟大探索。 4.怎样正确把握毛泽东思想、邓小平理论和“三个代表”重要思想各自的科学体系和主要内容 ⑴毛泽东思想：马克思主义中国化的第一个重大理论成果是毛泽东思想。它是马克思列宁主
大一上学期思修期末考试试题及答案 1．大学生怎样尽快适应大学新生活？ 在学习要求，生活环境，社会活动都有变化的大学中首先要认识大学生活的新特点。要培养自主学习的能力，独立思考问题解决问题的能力：要学会过集体生活也要独立：要积极参与社会活动。 提高独立生活能力。树立独立生活的意识。 虚心求教，细心体察。 大胆实践，不断积累生活经验 实力新的学习理念。树立自主学习的理念。树立全面学习的理念。树立创新学习的理念。树立终身学习的理念。 培养优良的学风。勤奋。严谨。。创新。 树立远大的理想。 2.结合实际谈谈学习“思修”课的意义和方法。 这是一门融思想性，政治性，知识性，综合性，实践性于一体的学科。 意义：（1）有助于当代大学生认识立志，树德和做人的道理，选择正确的成才之路。 （2）有助于当代大学生掌握丰富的思想道德和法律知识，为提高思想道德和法律素养打下知识基础。 （3）有助于当代大学生摆正“德’与“才”的位置，做到德才兼备，全面发展。 方法：注重学习科学理论。 注重学习和掌握高思想道德和法律修养的基本知识。 注重联系实际 注重行知统一。 3.谈谈你对社会主义核心价值体系的科学涵及重要意义的理解？ 科学涵；马克思主义指导思想，中国特色社会主义共同理想，以爱国主义为核心的民族精神和以改革创新为核心的时代精神，社会主义荣辱观，构成社会主义核心价值体系的基本容。 巩固马克思主义指导地位，坚持不解地用马克思主义中国化最新成果武装全党，教育人民。 用中国特色社会主义共同理想凝聚力量 用以爱国主义为核心的民族精神和以改革创新为核心的时代精神鼓舞斗志 用社会主义荣辱观引领风尚，巩固全党全国各族人民团结奋斗的共同思想基础。 这四个方面容相互联系，相互贯通，相互促进，是有机统一的整体。 重要意义；是党在思想理论建设上的一个重论创新。是我们党深刻总结历史经验，科学分析当前形势提出的一项重大任务。
文学概论知识点总结 1、文学四要素美国学者艾布拉姆斯，文学四要素图示，文学实际上由四种不同要素构成的完整系统，四要素分别是作品、世界、作家和读者，他们之间具有确定的结构关系。 2、意识形态法国哲学家特拉西创造，根据威廉斯归纳的马克思主义经典作家那里，意识形态至少三层意思：第一，意识形态是指特定阶级或集团的信念体系。第二，意识形态是各种幻觉的信念体系，尤其是说位的虚假观念或意识，与真知或科学形成对照。第三，意识形态是意义和观念的一般产生过程。 3、艺术构思是指作家在特定创作动机的指引下，在已然激起的创作冲动的驱使下，在选定创作对象的基础上运用艺术概括，艺术变形等手法塑造艺术形象，构织故事情节，最终形成完整艺术世界的思维过程。 4、文学批评是在文学接受的基础上，以一定的理论、方法对文学作品为中心的各种文学现象进行研究和评价的文学活动。 5、陌生化以作者或者人物似乎都未见过此事物，以陌生的眼光描写，以消解“套板反应”，使读者产生某种新奇感的构思方式。如曹雪芹与刘姥姥 6、文学材料文学材料是指作家有生以来从社会生活中有意接受或无意获得,因而具有主体性的一切生动丰富却相对粗糙的刺激和信息。
7、意境指抒情性作品中呈现的那种情景交融,虚实相生，活跃着生命律动的韵味无穷的诗意空间。 8、话语蕴藉是对文学活动的特殊的语言与意义状况的概括，指文学作为社会性话语活动蕴涵着丰富的意义生成可能性。 9、文学消费是指人们为了满足自身文化，审美与娱乐等方面的精神需求而对文学产品加以占用，利用，阅读或欣赏的一项活动。 10、隐含的读者指作家本人设定的,能够把文本加以具体化的预想读者。叙述者讲述故事是一种语言交流行为，叙述者在叙述时心目中存在者潜在的接受着，这种由叙述者所设定的隐含在叙述动作中的接受者就是隐含的接受者。简答与论述： 一、文学消费的二重性指什么？①文学消费具有特殊商品消费性质在马克思恩格斯看来，文学艺术不仅具有商品属性，更具有意识形态属性，因而是一种特殊的精神产品消费，具有二重性质。文学消费之所以不等同于一般商品消费，其理由在于：首先，文学产品的消费价值对不同的消费主体来说具有不同衡量标准。其次，文学消费者所支付的货币与其中寓含的作家创造性劳动难以等价。再次。文学产品的消费具有超时空性甚至价值增值性。最后，文学产品的消费是一种文化信息的传播与接受，且具有再创造的性质，它要求消费者本人的积极参与。②文学消费具有一般商品消费性质从文化流通领域来看，文学产品具有明显的商品性质，文学消费也随之深深烙下了一般商品消费的印迹。文
1．比较文学作为一门独立学科在19世纪70年代末至90年代得以诞生。比较文学作为一个学科成立的一个标志是法国学派强调影响研究的国际文学关系史理论的提出。 2．比较文学的代表性人物及其著作： ●最早使用比较文学这一术语的是英国批评家马修阿诺德。 ●最早使比较文学一词进入比较文学学科理论的是波斯奈特，1886年，他出版世界上第一部比较文学理论专著《比较文学》。 ●在意大利，1871年，桑克蒂斯开始主持比较文学的讲座。 ●1827年，最早提出“世界文学”观念的是歌德。 ●1877年，世界上第一本比较文学杂志创刊于匈牙利的克劳森堡，名为《世界比较文学报》。 ●1887年，德国学者马克斯·科赫创办《比较文学杂志》，1901年创办《比较文学史研究》。 ●意大利学者克罗齐对比较文学的学科和理性发起挑战。 ●1937年，戴望舒译梵?第根《比较文学论》。 ●我国第一部比较文学理论专著——卢康华、孙景尧的《比较文学导论》，也是内地第一部比较文学概论性著作。 ●在西方著名的比较文学学者中，巴斯奈特是宣判比较文学夭折的第一人。 ●翻译文本研究：勒菲弗尔“操控理论” 3. 法国学派的四大代表人物：巴尔登斯伯格、梵.第根、卡雷、基亚，他们提出了要去掉比较文学的随意性，加强实证性；放弃无影响关系的平行比较，而集中研究各国的关系史；摆脱不确定的美学意义，而取得一个科学的含义（关键所在） 4．法国文学批评家布吕奈尔最早把实证主义用于文学研究，强调把一部作品对另一部作品的影响提到首位。 5．影响研究的本质特性实证性。法国比较文学影响研究的本质特性实证性的文学关系研究。6．基亚在《比较文学》一书中专设形象学研究——“人们眼中的异国”一章，这是对形象学研究进行确认的最早的一部概论性专著。 7．1960年美国比较文学学会成立，标志着美国学派的正式登场。代表人物有雷马克、艾德礼、勃洛克。 8．美国学派将影响研究与平行研究相结合，典型代表——韦斯坦因的专著《比较文学与文学理论》。 9．比较文学的可比性：同源性、变异性、类同性、异质性与互补性。 10．比较文学的基本特征：跨越性（跨国、跨学科、跨文明）；四大研究领域：实证性的文学影响研究、文学变异研究、平行研究、总体文学研究。 11．文学变异研究的四个层面：语言层面变异研究、民族国家形象变异研究、文学文本变异研究、文化变异研究。 12．平行研究包括直接比较和间接比较。平行研究主要有类比与对比两种方法构成。。 13. 渊源学的研究对象和方式：印象的渊源、口传的渊源、笔述的渊源、孤立的渊源和集体的渊源。 14．媒介学的理论与方法包括：个体媒介、团体媒介、文字资料媒介。 15．翻译领域的常见现象有直译、转译；常见形式有直译、意译。 16．引起文学变异的第一大要素是文化过滤。 17．译介学的研究范畴：翻译理论研究、翻译文本研究、翻译文学史研究 18．平行研究的种类：类型学、主题学、文体学、跨学科研究 19．类型学的基本研究范畴：内容题材的类型学相似、人物形象的类型学相似、思潮流派的类型学相似 20．用西方文论阐发中国文学的做法被台湾学者总结为中国比较文学研究的“阐发研究”。
第一章 1．如何正确认识提出马克思主义中国化的重要意义? ⑴马克思主义中国化的理论成果指引着党和人民的伟大事业不断取得胜利。 ⑵马克思主义中国化的理论成果提供了凝聚全党全国各族人民的强大精神支柱。 ⑶马克思主义中国化倡导了对待马克思主义的科学态度和学风，开拓着马克思主义在中国发展的新境界。 2．怎样正确理解马克思主义中国化的科学涵？ 马克思主义中国化，就是将马克思主义的基本原理同中国的具体实际相结合。具体地说，就是要使马克思列宁主义这一革命科学更进一步地和中国革命实践、中国历史、中国文化深相结合起来，使马克思主义在中国实现具体化。 ⑴马克思主义中国化就是用马克思主义来解决中国革命、建设和改革的实际问题 ⑵马克思主义中国化就是把中国革命、建设和改革的实践经验和历史经验提升为理论。 ⑶马克思主义中国化就是把马克思主义植根于中国的优秀文化之中。 3．怎样正确把握思想、理论和“三个代表”重要思想各自形成发展的时代背景和实践基础？ ⑴思想：时代背景:20世纪上半叶帝国主义战争与无产阶级革命的时代主题 实践基础:中国共产党领导的革命和建设的实践， ⑵理论：时代背景：时代主题的转换 实践基础：社会主义建设正反两方面的历史经验，我国改革开放以来社会主义现代化建设新的实践，是理论形成和发展的历史和现实根据。 ⑶“三个代表”：时代背景：当今国际局势和世界格局的深刻变化 实践基础：改革开放以来特别是十三届四中全会以来党和人民建设中国特色社会主义的伟大探索。
4．怎样正确把握思想、理论和“三个代表”重要思想各自的科学体系和主要容 ⑴思想：马克思主义中国化的第一个重论成果是思想。它是马克思列宁主义在中国的运用和发展，是被实践证明了的关于中国革命和建设的正确的理论原则和经验总结，是中国共产党集体智慧的结晶。思想在许多方面以其独创性理论丰富和发展了马克思列宁主义，成为一个博大精深的科学思想体系。它有着坚实的中国化马克思主义哲学思想的理论基础，其核心就是实事。它紧紧围绕着中国革命和建设这个主题，提出了一系列相互密切关联的重要的理论观点，成为一个科学体系。 容：①新主义革命的理论②社会主义革命和社会主义建设的理论③革命军队的建设和军事战略的理论④政策和策略的理论⑤思想政治工作和文化工作的理论⑥党的建设的理论⑦关于国际战略和外交工作的理论、关于思想方法和工作方法的理论，等等。⑧思想的活的灵魂，是贯串于上述各个理论的立场、观点和方法。它们有三个基本方面，即实事，群众路线，独立自主。 ⑵理论：围绕“什么是社会主义、怎样建设社会主义”这个首要的基本的理论问题，提出了一系列互相联系的基本观点，第一次比较系统地初步回答了中国社会主义发展道路、发展阶段、根本任务、发展动力、外部条件、政治保证、战略步骤、领导力量和依靠力量、祖国统一等一系列基本问题，指导我们党制定了在社会主义初级阶段的基本路线。这些基本观点的真理性已经被中国改革开放和社会主义现代化建设的成功实践所证明。 容：①社会主义本质理论②社会主义初级阶段的理论③改革开放的理论④社会主义市场经济的理论、【⑥社会主义现代化发展战略的理论⑦社会主义政治建设的理论⑧社会主义精神文明建设的理论、关于统一战线的理论、关于军队和国防建设的理论、关于社会主义国家外交战略的理论、关于党的建设的理论 ⑶“三个代表”：①“三个代表”重要思想在形成和发展的过程中，紧密结合新的实践，把
思修重点 1．大学生怎样尽快适应大学新生活？ 在学习要求，生活环境，社会活动都有变化的大学中首先要认识大学生活的新特点。要培养自主学习的能力，独立思考问题解决问题的能力：要学会过集体生活也要独立：要积极参与社会活动。 提高独立生活能力。树立独立生活的意识。 虚心求教，细心体察。大胆实践，不断积累生活经验 实力新的学习理念。树立自主学习的理念。树立全面学习的理念。树立创新学习的理念。树立终身学习的理念。 培养优良的学风。勤奋。严谨。求实。创新。 树立远大的理想。 2.结合实际谈谈学习“思修”课的意义和方法。 这是一门融思想性，政治性，知识性，综合性，实践性于一体的学科。 意义：（1）有助于当代大学生认识立志，树德和做人的道理，选择正确的成才之路。 （2）有助于当代大学生掌握丰富的思想道德和法律知识，为提高思想道德和法律素养打下知识基础。 （3）有助于当代大学生摆正“德’与“才”的位置，做到德才兼备，全面发展。 方法：注重学习科学理论。 注重学习和掌握高思想道德和法律修养的基本知识。 注重联系实际注重行知统一。 3.谈谈你对社会主义核心价值体系的科学内涵及重要意义的理解？ 科学内涵；马克思主义指导思想，中国特色社会主义共同理想，以爱国主义为核心的民族精神和以改革创新为核心的时代精神，社会主义荣辱观，构成社会主义核心价值体系的基本内容。 巩固马克思主义指导地位，坚持不解地用马克思主义中国化最新成果武装全党，教育人民。 用中国特色社会主义共同理想凝聚力量 用以爱国主义为核心的民族精神和以改革创新为核心的时代精神鼓舞斗志 用社会主义荣辱观引领风尚，巩固全党全国各族人民团结奋斗的共同思想基础。 这四个方面内容相互联系，相互贯通，相互促进，是有机统一的整体。
00529《文学概论》自考复习必过知识点 第一章文学观念 1、文艺学：研究文学的学科统称，包括文学发展史、文学批评、文学理论。 2、文学史：是一门历史地和具体地考察文学发展状况、经验和规律的学科，是文艺学不可缺少的分支学科。 3、文学批评：是一门及时地评论同时代作家、作品、文学运动、文学思潮以及其他相关问题的学科，也是文艺学不可缺少的分支学科。 4、文学四要素：美国学者艾布拉姆斯提出。世界、作家、作品和读者。文学的必备要素，体现人与客体的对象性，体现人的本质力量。 5、广义文化概念提出者：英国人类学家泰勒；英国文学人类学家马林诺夫斯基，中国梁漱溟。狭义文化概念：《现代汉语词典》；符号论文化概念：德国现代哲学家卡西尔。 6、马克思、恩格斯在哪些着作中提出意识形态理论：《政治经济学批判·序言》、《德意志意识形态》。 7、提出文学中“心”与“物”的关系理论的作者与论述：刘勰“心物交融说”；关于作家艺术构思与客观事物的论点。诗人对于外物的感受，所引起的感想是无穷尽的，描写事物的神情和外貌要根据景物写，辞藻和音调的运用则要联系自己的心情反复斟酌。“与心徘徊，随物婉转”。德国古典作家歌德，艺术家既是自然的主宰又是奴隶，现实是客观的，作家对现实的反映是能动的。 补充 1.再现说：在文学四要素中强调“世界”与“作品”的对应关系，即认为作品是对世界的摹仿或再现。 2.表现说：在文学四要素中强调“作品”与“作家”的关系，即认为作品是作家情感的自然流露、表现、传达。 3.实用说：在文学四要素中强调作品被读者所利用的关系，认为文学是一种工具，可以为某种社会目标服务。 4.客观说：在文学四要素中，把作品抬到高于一切、重于一切的地步，认为作品一旦从作家的笔下诞生之后，就获得了完全客观的性质，它既与原作家不相干，也与读者无涉，它从外界的参照物中孤立出来，本身是一个“自足体”，出现了所谓的“客观化走向”。 5.体验说：在文学四要素中强调读者对作品的意向性的体验这种关系，强调读者阅读作品是体验和现创造。 6.文学的定义：文学作为一种人类的文化形态，它是具有社会的审美意识形态性质的、凝聚着个体体验的、沟通人际的情感交流的语言艺术。 7.符号论的文化概念：从符号学的角度看，文化是人类的符号思维和符号活动所创造的产品及其意义的总和。这个观点是由德国的现代哲学家卡西尔提出的。 8.品质阅读：是指“试图尽可能完全地把握作品的肌质，表示首先注意到语言中的各种要素，重音和非重音，重复和省略，意象和含混等等，然后由此向人物、事件、情节和主题运动。这是就西语而言的，若是论汉语文学中‘品质阅读”则是读者阅读是首先关注文本的用字、比兴、押韵、平仄、对仗和用事等，进一步再延伸到对情景的描写或人物、情节的叙述的理解。 9.价值阅读：通过对作品的阅读和理解，发现作品的价值意义，尤其是其中的文化意义。11.审美：审美是心理处于活跃状态的主体，在特定的心境、时空中，在有历史文化渗透的条件下，对于客体的美的观照、感悟、判断。 12.审美意识形态：集团倾向性与人类共同性的、认识与情感的、无功利性与有功利性的、