目的基因的获取
——基因工程第一步
方法一：从基因文库中获取（未知序列）
1.从基因组文库中获取（基因组文库含有该生物的所有基因）
将该生物的所有DNA提取后切成DNA片段插入载体中并导入受体菌群，即形成
基因组文库
优缺点：操作简单工作量大，盲目性大，专一性差
2.从部分基因文库中获取（如cDNA文库）
将目的基因的mRNA反转录并合成双链DNA分子，插入载体中并导入受体菌群，
即形成cDNA文库（反转录法，无启动子【使转录开始的DNA片段】、内含子【不
转录的DNA片段，与之相对的是具有转录效应的外显子】、终止子【使转录结束
的DNA片段】）
优缺点：专一性强操作麻烦，技术要求高
方法二：人工合成
1.化学合成法
通过蛋白质的氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列进而确定结构基因的核苷酸序
列，从而进行化学合成
优缺点：专一性强，可产生新基因适用范围小
2.反转录法（无启动子、内含子、终止子）
将目的基因的mRNA反转录并合成双链DNA分子，即目的基因
优缺点：专一性强操作麻烦，技术要求高，mRNA生存时间短
方法三：PCR技术扩增
步骤：①向缓冲液（提供相对稳定的pH环境）中加入四种脱氧核苷酸（提供原料）、DNA母链（提供模板）、TaqDNA聚合酶（具有耐高温的特点）、引物（使聚
合酶可以开始连接脱氧核苷酸）
②高温解旋形成单链DNA（90~95℃）
③降温使单链DNA与引物结合（55~60℃）
④升温是酶催化合成子链DNA（70~75℃）
优缺点：短时间内大量复制严格控温，技术要求高
从事一项基因工程，通常总是要先获得目的基因，倘若基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者利用聚合酶链式反应（PCR）由模板扩增。此外，最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库或cDNA文库，从中选择出目的基因进行克隆。 （一）基因文库的构建 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。在理想条件下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。通常包含以下五个步骤： 1．染色体DNA的片段化：利用能识别较短序列的限制性内切酶对染色体基因组进行随机性切割产生众多的DNA片段。 2．载体DNA的制备：选择适当的λ噬菌体载体，用限制性内切酶切开，得到左右两臂，以便分别与染色体DNA片段的两端连接。 3．体外连接与包装：将染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白在体外包装 4．重组噬菌体感染大肠杆菌：重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入细胞，重组DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生的溶菌产物组成重组噬菌体克隆库，即基因文库。 5．基因文库的鉴定、扩增与保存：构建的基因文库应鉴定其库容量，需要时可进行扩增。构建好的基因文库可多次使用。 （二）cDNA文库的建立 真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物由于外显子与内含子镶嵌排列，转录产生的RNA须切除内含子拼接外显子才能最后表达，因此真核生物的基因是断裂的。真核生物的基因不能直接在原核生物表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），再接上原核生物的表达控制元件，才能在原核生物中表达。还有，mRNA 很不稳定，容易被RNA酶分解，因此真核生物须建立cDNA文库来进行克隆和表达研究。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。 建立cDNA文库与基因文库的最大区别是DNA的来源不同。基因文库是取现成的基因组DNA，cDNA文库是取细胞中全部的mRNA经逆转录酶生成DNA（cDNA）（图8-1-10），其余步骤二者相类似。构建cDNA文库的基本步骤有5步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA （质粒或λ噬菌体）；④双链cDNA的克隆（cDNA与载体的重组）；⑤cDNA文库的鉴定、扩增与保存。 （三）基因库中克隆基因的挑选分离 基因文库和cDNA文库建立起来后，下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆，这是一件难度很大，费时费力的工作。一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体（参见图8-1-3），这种方法叫做“选择”；另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查，这种方法叫做“筛选”。 1．原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十分灵敏而且快速的方法 用于杂交的探针可以是双链DNA，也可以是单链DNA，或是RNA。杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。 显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。探针的获得有如下方法： ①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。 ②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以用同源序列做探针。 ③如果目的基因未知，但知道它对应的蛋白质序列，可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。2．扣除杂交法：这是一种筛选方法，难度很大，是面对目的基因未知，同源基因未知，蛋白质序列未知的情况的。基本原理是找到该基因的高表达细胞，提取相应的mRNA，并与一般细
目的基因的获取 实验报告 题目:单元一:目的基因的获取 指导老师:谭红铭张添元 日期:2013/10/17 一.实验目的: (1)掌握总RNA的提取方法和技术 (2)了解总RNA的提取要注意的问题 (3)了解用RT-PCR法获取功能基因的原理 (4)学习和掌握RT-PCR的技术方法 二.实验原理: (1)RNA提取:RNA在细胞中是与蛋白质结合在一起的。提取RNA时需先用强变性剂使蛋白质和DNA变性,同时抑制核糖核酸酶(RNase)的活性,然后通过有机溶剂如氯仿分层抽提去掉蛋白质和多糖等,最后通过RNA沉淀剂如异丙醇的帮助下沉淀分离RNA。 (2)RT-PCR:总RNA中的mRNA体外在反转录酶的作用下可合成与mRNA互补的单链DNA,称为互补DNA(cDNA),再在DNA聚合酶的作用下,以cDNA第一链为模板,以四种脱氧核苷酸(dNTP)为材料,在引物的引导下,合成大量双链DNA。 三.实验材料: 斑马鱼、Trizol Reagent(Invitrogen)、DEPC处理的超纯水、氯仿、异丙醇、无水乙醇、高速离心机、各种规格的RNase Free的枪头、EP管、RNase Free 的烧杯及量筒玻璃棒等、新开的大滤纸、碎冰及泡沫冰盒 四.实验准备: 由于实验过程中实验者手、臂上的细菌和真菌,人体自身分泌的RNase如手汗和唾液会带入试管或污染用具,使RNA降解,因而实验一开始就必须自始至终佩带口罩及乳胶手套,并经常更换。 五.实验步骤、现象、结果及分析: Ⅰ总RNA提取: ⑴取斑马鱼一条,用滤纸吸干水,至于电子秤平内称重,为,后置于研钵,用大勺子往其中加入液氮,待其冷冻后,开始研磨,使其始终保持粉末状,由于液氮挥发,需补充液氮,直至彻底研磨至面粉状细末为止。
1.2 基因工程的基 本操作程序 第1课时目的基因的获取基因表达载体的构建 一、选择题 题型一基因工程的基本操作步骤 1．基因工程主要操作步骤的顺序是() ①基因表达载体的构建②将目的基因导入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定④目的基因的获取 A．③②④①B．②④①③ C．④①②③D．③④①② [答案] C [解析]基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。 题型二目的基因的获取 2．获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是() A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取 C．直接从受体细胞中提取D．利用PCR技术获取 [答案] C
[解析]获取目的基因的方法有多种，例如可以从基因组文库中获取目的基因，可以从cDNA文库中获取目的基因，也可以利用PCR技术获取目的基因，故A、B、D不符合题意；受体细胞是接受目的基因的细胞，受体细胞自身不含目的基因，C符合题意。 3．下列关于基因文库的说法，错误的是() A．可分为基因组文库和部分基因文库 B．cDNA文库属于部分基因文库 C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流 D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少 [答案] C [解析]基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。 4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是() A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA双链复制 C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA [答案] D [解析]利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR扩增中目的基因受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。 5．某基因比较小，且核苷酸序列已知，获得该基因的最佳方法是() A．以mRNA为模板反转录合成DNA B．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成 C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选 D．先建立基因文库，再从中筛选 [答案] B [解析]目的基因的获取方法主要有三种：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、人工合成。对于比较小且核苷酸序列已知的目的基因，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 6．下列有关获取目的基因的叙述，不正确的是()
获得目的基因的方法 常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选 一、直接获取 1、从基因文库中获取 就是从现成的基因储存在受体菌上提取出来（基因组文库法就是原教材中的用限制性内切酶直接获取。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：①选用特定限制性内切酶，DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段②选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA 限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。） 2、cDNA文库法 即逆转录法。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物
成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。 3.直接分离基因 最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。 这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。 二、人工合成 1、固相亚磷酸酰胺法 主要针对是序列已知的基因，通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。
第五章目的基因的获取 1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。第一节化学合成目的基因 目前常用的方法 一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法 自动化合成法。 ①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理 1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。然后再用酸 ②带保护的单核苷酸连接 或碱脱去保护基团 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。然后去掉一个保护，使其循环往复连接。 （2）合成过程 5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。保护连接去保护连接 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单 核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。2. 磷酸三酯法 固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。（第一个核苷酸不需要保护） 固相磷酸酯合成法 是目前通用的合成方法。 化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装 1. 互补连接法 （1）互补配对 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化
T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链 2. 互补延伸连接法 预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。 3’5’ 5’3’5’3’ T4DNA连接酶 Klenow片段 引物 1. 直接合成基因 三、寡聚核苷酸化学合成的优点 （1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆 ）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右） （2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。进行基因定点突变研究 5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头 （Adaptor）或衔接物 （Linker）序列。 DNA合成仪基因合成一般是自己设计序 列，交给商业公司完成。 第二节基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把总DNA切成不同大小的片段。 酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 1. 优点 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene