2014年细胞培养重点 名词解释： 1组织工程应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物。从而使组织工程学研究的内容、应用范围和任务更加明确。组织工程的主要n的或内涵是对人体器官和组织修复。 2.接触抑制.指细胞相互接触后失去运动的现象。 3.肿瘤干细胞肿瘤中具有自我更新并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。 4.平衡盐溶液简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。在生理盐水的基础上，分别加入了无机盐、葡萄糖以及少量酚红，具有维持渗透压，调节溶液的PII值，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离了成分的作用, 常用的BSS有PBS、Hanks液等。 5.密度抑制由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多，和生存空 间消失所引起细胞增殖抑制的现象。 6.去分化指己成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态，但是分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化的特点。 7.iPS诱导多功能干细胞即诱导多能干细胞，是指体细胞经过基因“重新编排”, 回归到胚胎细胞的状态，从而具有类似胚胎干细胞的分化能力。这种方法可以不需要用人胚胎或卵母细胞，就能制造干细胞。 8.confluent汇合指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 9.细菌污染培养的细胞被细菌污染均会造成细胞受损和死亡，是细胞培养工作的大敌。 细胞发生污染时，常有培养液变浑浊和PH发生改变等现象，镜下观察细胞变形、生长缓慢或分裂相消失，以及细胞圆缩脱落等现象。常有抗生素预防该污染。 10.灭菌杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 11.单克隆抗体，指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 问答题； 1 .试述“克隆”的基本概念并举例说明其在细胞培养工作中的实际意义。 克隆(Clone):指由从一个共同的祖先通过无性繁殖而来的、遗传上同一的细胞群或后裔；Clone也可作动词用，用于指细胞形成克隆细胞群的过程，即从群体中把单个细胞分离出来, 通过增殖形成细胞群或后裔的过程;
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 The final edition was revised on December 14th, 2020.
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养
细胞培养室管理的研究与探索 文章来源：中国实用医药作者：徐家英秦立强等 【摘要】本文从培养室的服务职能，培养室的技术交流，细胞培养室的建设，实验室管理制度建立的重要性等几个方面进行了研究与探索，充分发挥细胞培养室的潜能，从而达到有效提高研究质量的目的。 【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理 实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。 细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。 1 细胞培养室的服务职能 细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。 2 细胞培养实验室的技术交流 细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。 如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。 3 细胞培养室的建设 3．1 细胞培养室面积和房间安排实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，
细胞工程知识点 1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 2、细胞工程的应用： 1)动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物 2)新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组 3)细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产 4)细胞疗法与组织修复： 2细胞工程理论基础 1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。 2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。 3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞分裂,这一过程称为去分化。 3细胞工程技术 1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。 2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏 （1）细胞保存方法传代培养保存法低温冷冻保存法(低温、超低温保存) 液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态） 玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。 冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻） 细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。 复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 细胞培养和代谢调控：
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
细胞培养基的选择及常用数据库 日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细 胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还
细胞工程 （1）绪论 1．根据研究对象的不同，细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程。 2．克隆羊多莉的诞生证明了动物细胞核具有全能性。 （2）第一章基本技术 1. 培养基基本成分 大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十毫克到几千克。 ①无机盐类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子浓度。植物所的 微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co ②有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸、其他 ③植物激素：生长素、细胞分裂素 ④水：不同实验室要求使用不同级别的纯化水 ⑤其它附加成分：琼脂、活性炭、附加复合成分 2. 外植体(explant)：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。 外植体的三种来源：①生长在自然环境下的植物 ②在温室控制环境条件下生长的植物 ③无菌环境下培养的植物 3. 外植体取材总体原则:①根据培养需求选择植物部位 ②多年生植物注意树龄和季节 ③在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作为外 植体 4. 外植体灭菌顺序：外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水清洗 外植体灭菌后应及时接种培养 5. 外植体培养条件的控制 ①光照光照时间影响外植体再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质 研究报道较少 ②温度适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量 增加。 ③pH 通常使用的pH值范围是5.5—6.5。pH在4.0以下或者7.0以上培养 物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化； 高压灭菌引起pH值变化 ④气体生长量与气体含量关系呈现倒“V”形，折点处的气体含量对应最大生 长量
植物细胞工程和动物细胞工程默写 1、细胞工程是在或的操作 2、细胞工程按操作对象分为和 3、植物细胞工程通常采用的技术手段是：和 4、植物组织培养的理论基础是： 5、理论上每一个活细胞都应该具有。因为 6、受精卵的全能性最高，受精卵生殖细胞体细胞 7、为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 8、植物组织培养的外界条件：， 内在原理是： 9、植物组织培养的过程：经过形成 经由过程形成，最后移栽发育成。 10、是指已分化细胞经诱导，失去其特有的结构和功能而变为未分 化细胞的过程。 11、是指由外植体长出来高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成 的排列疏松无规则的组织。 12、植物体细胞杂交的意义（优势）：。 13、去除细胞壁的常用方法：（纤维素酶、果胶酶等） 14、人工诱导原生质体融合方法：物理法：等； 化学法： 15、融合完成的标志是： 16、植物体细胞杂交过程包括：和。 17、植物体细胞杂交的原理是：和 18、人工种子的特点是： 19、作物脱毒(1)材料: (2)脱毒苗: 20、单倍体育种：(1)方法: (2)优 点: ; 21、动物细胞工程常用的技术手段： (基础)、、 、
22、动物细胞培养的原理是：。 23、用处理，一段时 间后获得单个细胞。 24、细胞贴壁： 25、细胞的接触抑制： 26、原代培养：，培养的第1代细胞与传10代以 内的细胞称为原代细胞培养。 将原代细胞从培养瓶中取出，用处理后配制成，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为 27、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为 28、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡， 少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代 细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失 去接触抑制，容易传代培养。 29、动物细胞培养的条件：1. 2. 3. （培养 液的Ph为7.2-7.4）4. 30、细胞所需营养：等， 按种类和所需数量严格配制而成的合成培养基。培养基内还需加入、等天然成分 31、动物细胞培养所需的气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳的混合气体。氧 气：；二氧化碳： 32、植物组织培养和动物细胞培养的比较：
实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为 人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。 （2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。 （3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。 1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。 实验试剂 RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A:Na2HPO4?12H2O 28.8克B:Na2HPO4?7H2O 2.164克 KH2PO4 2.67克NaH2PO4?2H2O 0.3克 溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中 实验设备 2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。实验材料 人的外周血淋巴细胞
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗
——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；
一、细胞培养实验室的设置及设备 （一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。
无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级3,500 0 5 1 10000级350,000 2,000 100 3 100000级3,500,000 20,000 500 10 300000级10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
实验二细胞传代培养 一、目的和要求 (1) 掌握贴壁细胞传代的培养方法； (2) 掌握细胞计数和存活率计算方法； (3) 培养建立无菌操作意识。 二、实验原理 细胞培养是培养连续细胞系或者离体正常组织或肿瘤细胞的技术。当离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止；若不及时分离、传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比例转移，接种到其他培养瓶的培养。贴壁细胞的传代通常是用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代；而悬浮生长的细胞则用直接法传代或离心法传代。 细胞计数是观察判别所培养细胞的状态的重要手段，也是细胞传代培养及判断实验处理对细胞的影响所必需的方法。细胞计数的结果一般用每毫升（液体培养）或每平方厘米（固体单层培养）的细胞数来表示。通常细胞计数是运用光学显微镜和血球计数板对细胞进行直接计数。图1为血球计数板一个计数区的示意图。血球计数板具有两个可以计数的区室，每个计数区由9个亚区构成，每个亚区的面积为1mm2，同时血球计数板上覆盖一个具有一定厚度的血盖片，保证计数区与盖片之间的距离为0.100mm。当盖片放置正确，每个亚区上的体积为0.1mm3即1×10-4mL。统计计数区中的4个角亚区中的平均细胞数（或中央亚区中的细胞数），记做N；若在准备过程中，对细胞的稀释倍数为D，则样品的细胞密度 4 N C个/mL。 =D ? 10 ? 图1 血球计数板构造示意图细胞膜是一层选择性通过的半透膜，当细胞膜完整时，某些染料无法进入细胞中。利用这一特性可以进行细胞存活检查。通常使用台盼蓝，活细胞无法被台盼蓝染色，而死细胞则会吸收染料被染色。 三、器材与药品 (1) 实验器材： CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、血球计数 板、离心管、培养瓶、移液枪、微孔滤器等。 (2) 实验材料：
体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养 Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养：培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法 体内外细胞分化的差异： “反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。 不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）。生存条件改变使分化阻抑。 脱分化或去分化：细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失去储存肝糖原能力）。是基因突变所致 培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。 细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子 原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。 传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。 组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期 细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。 无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。 克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。 克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群 冻存配方：向培养液中加入DMSO或甘油，封与安瓶，存于温度达-196℃液氮中长期储存连续细胞系：获得持久性增殖能力的细胞群体。细胞获得永生性或称为恶性性，而获得不死性的细胞核型大多变成异倍体，接触抑制消失 “一代”指细胞接种到分离再培养的所用的时间。与细胞倍增一代不是一个含义。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次，经历三个阶段： 潜伏期：接种——经过——悬浮期（细胞质回缩，胞体呈球形）——贴壁 初代培养细胞经过10~24h或更多连续细胞系和癌细胞系经过10~30min 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。 停滞期/平顶期：细胞量和密度达到饱和，细胞停滞增殖。表明细胞进入到停滞期,细胞数量持平。特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH 降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。 细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。 接触抑制：细胞相互接触抑制细胞运动的现象。肿瘤细胞没有此现象
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
简介 哺乳动物细胞培养作为一个无价的细胞生物学工具已有几十年。生长在扁平和僵硬的二维(2D)底物(如 聚苯乙烯或玻璃)上的单层贴壁细胞已成为传统细胞培养系统的中流砥柱。二维细胞培养的研究在扩宽 我们对发育生物学、组织形态发生、疾病机制、药物发现、大批量蛋白生产、组织工程和再生医学方 面的知识方面扮演了至关重要的角色。与此同时，随着2D培养系统而来的缺陷也显现了出来，尤其是 其不能模拟体内环境以提供生理相关的数据。 在体内，几乎所有组织的细胞都处在由一个复杂三维(3D)结构的细胞外基质(ECM)中，它们和相邻的 细胞通过生化和机械关系产生着相互作用1。细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用构建成了一个 用于维持组织特异性和稳态的3D通讯网络2。细胞生命周期的关键事件通过受到周边细胞微环境的控 制3。2D培养试验中，细胞无法实现类似于体内的结构组织和连接，这使得细胞形态、存活力、增值 能力、分化、基因和蛋白表达、对刺激的反应、药物代谢及一般的细胞功能受到了限制或减弱。 2D 培养的限制对临床前基于细胞的药物和毒性筛选试验的可预测性造成了影响。超过90&的药物通过了体外临床前研究，却在随后的临床实验中未能达到预期的疗效或安全范围4。癌症药物的失败率更高 5, 12，因为2D培养系统常常无法构建有效的肿瘤生物学模型6,7。而且，在使用2D模型进行临床前药物研 发时，生物利用率和毒物学的研究严重依赖于动物模型的使用。这一高失败率表明动物模型可能并不 适用和/或并非人用治疗方案安全性评测的代表4,16,17。 为了克服这些短板，大量的3D细胞培养模型在近20年被开发了出来。由于3D模型显著促进了癌生物 学、组织工程和再生医学的研究，又得到了进一步的发展。为此，细胞生物学家们、材料科学家们、 生物医学工程师们以及其他开发更有用的模拟体内环境的3D模型来缩短2D培养与活体组织间差距的 人，携手参与了多学科的研究。越来越多的证据表明，3D培养建立起来的生理细胞-细胞与细胞-细胞 外基质相互作用可以模拟天然组织的特异性，并且比传统2D培养的生理相关性更强8-10。这在干细胞培 养和分化、癌生物学、药物和毒性筛选及组织工程中显得尤为突出。 Suparna Sanyal, Ph.D.3D细胞培养和试验系统 综述文章