生物化学实验指导
吕杰编著
新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍
《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录
实验一氨基酸纸层析 (4)
实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5)
实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7)
实验四酪蛋白的制备 (8)
实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10)
实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12)
实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14)
实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析
一、实验目的
1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。
二、实验原理
纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：标准氨基酸溶液
2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。
3、试剂：
（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。
（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；
（3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升
四、实验步骤：
纸层析
(1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。
(2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。
(3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。
(4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。
五.结果分析：
(1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；
(2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。
Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离
=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离
六、思考题：
1、何谓分配层析法和分配系数？
实验二DNS-Cl法测定N末端氨基端
一、实验目的
1、学习聚酰胺薄膜层析的方法。
2、学习DNS-Cl测定氨基酸的原理及方法。
二、实验原理
纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验器材层析缸毛细管紫外灯烘箱恒温箱聚酰胺薄膜吹风机
2、试剂：
①各种层析纯标准氨基酸
②DNS-Cl丙酮溶液（称取25mg DNS-Cl溶于10mL丙酮中，贮于棕色瓶中，至于冰箱保存，一个月内稳定）
③0.2mol/L NaHCO3 溶液
④NaOH 1M
⑤HCl 1M
⑥展开剂I 88%甲酸：水=1.5:100（v/v）
⑦展开剂II 苯：冰醋酸=9:1（v/v）
四、实验步骤：
1、氨基酸的DNS化
分别取0.2-0.3mg的层析纯标准氨基酸及样品氨基酸溶于0.5mL 0.2mol/L的NaHCO3 溶液中，各取0.1mL于有玻璃塞的试管中，加入0.1mL DNS-CL的丙酮溶液，测pH值，必要时用NaOH 调pH至9.0-9.5，于室温放置2-4h，冷风吹除丙酮后，加HCl调pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提，分层后取有机相；
2、聚酰胺薄膜的准备
将聚酰胺薄膜剪成7*7cm的方块，在距边0.5cm处画互为垂直的两条基线，交叉点为原点，若只做单向层析，则只画一条基线，在基线上每隔1cm画一个点样点。
3、点样
用毛细管取样，点在点样点上，点样点直径应小于2mm，若多次点样，点一次吹干一次。
4、展层
将点好样的聚酰胺膜卷成圆筒形，点样侧在筒内，放入层析缸内，槽内加入5-10ml的展开液I进行展开，溶剂到达距顶部0.5cm时，取出膜吹干。
进行双向层析，第一向层析完毕，取出完全吹干，将膜转90°，用展层液II 展开。为了区分DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-苏氨酸和DNS-丝氨酸，DNS-丙氨酸和DNS-NH2，可在展开后，吹干，接着用其它展层液在同一方向上展开。
5、DNS-氨基酸的检测
展层结束后，取出薄膜用吹风机吹干，在360nm或者280nm紫外灯下检测，DNS-氨基酸应呈黄色荧光，用样品的层析谱与标准的DNS-氨基酸层析谱比较可鉴定样品氨基酸的种类。
五、结果分析：
(1) 用铅笔将层析荧光点描出来；
(2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。
Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离
=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离
六、思考题：
1、为什么用棉线而不是橡皮筋固定薄膜？
实验三考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质
一、实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法
2. 熟练分光光度计的使用和操作方法
二、实验原理
此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）
三、器材与试剂
器材
1. 可见光分光光度计
2. 刻度移液管
3.移液枪
试剂
1. 0.15M生理盐水
2. 考马斯亮蓝试剂(考马斯亮蓝G250 100mg 溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml。最终试剂中含有0.01% G250，4.7% 乙醇，8.5% 磷酸)
3. 0.1mg /ml蛋白质标准液（结晶牛血清蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15M生理盐水配制成0.1mg/ml蛋白溶液。）
4. 两种未知浓度的蛋白质溶液。
四、实验步骤
1. 标准曲线的制作
(2) 加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。
(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法
(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 未知溶液蛋白质含量的测定
(1)未知蛋白质溶液:
取实验室预备的未知蛋白质溶液，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测A595 值
(2) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。
(3) 如果所测定的A595值不在标准曲线内，该如何处理？
3. 结果计算
根据标准曲线求出样品中蛋白质的含量。
五、复习思考题、作业题：
1. Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？
2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？
3. 根据蛋白质的呈色反应，测定蛋白质的方法还有哪种？根据所学知识推断各种测定方法有何优点、缺点
实验四酪蛋白的制备
一、实验目的
1、学习从奶粉中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、实验原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜牛奶
（一）试剂
1、95%乙醇1200mL
2、无水乙醚 1 200mL
3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液300ml
先配A液与B液
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。
取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。
4、乙醇——乙醚混合液
乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）
（二）器具
1、离心机
2、抽滤装置
3、精密pH试纸或酸度计
4、电炉
5、烧杯
6、温度计
四、操作步骤
（一）酪蛋白的粗提
100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的纯化
1、用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。
2、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
3、将沉淀摊开在表面上，风干；得酪蛋白纯品。
（三）准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100 mL牛乳（g%）
100% 测得含量
得率:
理论含量
式中理论含量为3.5g/100mL 牛乳。
五、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。
六、实验报告
1、根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。
2、合理分析实验所得率
七、思考题
1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？
实验五葡萄糖标准曲线的绘制
一、实验目的
掌握葡萄糖标准曲线的绘制方法，进一步掌握分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．主要仪器
（1）玻璃试管：20mL×7
（2）刻度吸管：
（3）容量瓶：
（4）恒温水浴锅
（5）沸水浴
（6）离心机
（7）天平
（8）分光光度计
2．试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3g DNS和262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
四、操作步骤
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘出标准曲线。
五、结果与计算：
用电脑绘出的标准曲线，写出回归方程。
六、注意事项
1．标准曲线制作时各反应管应同时进行沸水浴加热，并准确进行定容。
七、思考题
1．如何正确绘制和使用标准曲线?
实验六酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
一、实验目的
本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
二、实验原理
至今我们所发现的大多数酶都是蛋白质，因而蛋白质的分离提纯方法也适用于酶。对于不同来源的各种酶，通常采用盐析沉淀、吸附、离子交换、结晶及各种物理化学方法将它提纯，在纯化过程中，应尽量避免高温，剧烈的机械搅拌、强酸、强碱等容易造成蛋白质变性的各种激烈条件。
蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。因此只要用一种适当的试剂测定反应中还原糖的含量，就可以得知它的活力。蔗糖酶在碱性环境中非常容易失活，因此可以用碱来终止酶促反应。
实验中的蔗糖酶活力测定是在35℃下进行活力测定，每三分钟能使5%蔗糖溶液释放1毫克还原糖的酶量定为一个活力单位。还原糖的测定是利用3,5-二硝基水杨酸与葡萄糖生成红色化合物，通过比色法测定还原糖的量即为酶活力。
三、实验仪器
1．试管，2. 量筒，3．三角瓶，4．滴管，玻棒，5．分光光度计，温箱，冰箱，离心机，恒温水浴，水浴锅，温度计。
三、试剂
1、1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3g DNS和262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
3、0.lmol/L醋酸缓冲液(pH4.6）：
0.2mol/L醋酸溶液（11.55mL冰醋酸定容至1升），25.5mL与0.2mol/L醋酸钠溶液（16.4g NaAc或27.2g NaAc·3H2O定容至1升）24.5mL混合稀释到100mL。
4、5%蔗糖溶液（W/V）：5克蔗糖以pH4.6的0.1mol/L醋酸缓冲液溶解，定容至100mL。
5、5mmoL/L的磷酸钠缓冲液
6、0.5mL 1mol/L 的NaOH
四、操作：
1.蔗糖酶粗制品的提取：
取10个g干酵母，加入2.5g硼砂，少许石英砂，逐步加入5mmoL/L的磷酸钠缓冲液（适当加入），充分研磨30min，然后4000r/min离心15分钟，记录上清液总体积，为蔗糖酶的粗制品。
2．葡萄糖浓度测定
（l）葡萄糖标准曲线制作
取11支试管按下表顺序加入1mg/mL葡萄糖液，水及3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）。
上述溶液混合均匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，测540nm光密度（O.D值）。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光密度值为纵坐标做出标准曲线。
（2）样液的测定
取四只试管分别加入2mL稀释的酶液。
1支作对照，加入0.5mL 1mol/L 的NaOH摇匀，使酶失活。另3支作测定管。
此4支试管和5%蔗糖溶液放在35℃水浴中预热10分钟。分别吸取2mL 5%蔗糖液于上述四支试管中，并且准确计算时间，3分钟后在测定管中也加入0.5mL 1mol/L NaOH，摇匀
从反应混合物中吸取0.45mL溶液，用DNS试剂测定酶反应生成的还原糖数量（方法同标准曲线的制作），反应混合液中加入1.55mL的蒸馏水，再加入1.5mL的DNS。以管1作为对照，管2、3、4为测试管。管2、3、4测定的OD值进行平均，带入标准曲线的回归方程，计算出蔗糖酶在35℃下，以5％蔗糖为底物时，3分钟能释放出的还原糖的总毫克数，此数值即为总活力单位。
实验七酵母RNA的分离与组分鉴定
一、实验目的：
学习稀碱法提RNA的原理与技术。
二、实验原理：
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3—4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
酵母含RNA达2.67—10.0%，而DNA含量仅为0.03—0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
三、器材与试剂：
1．器材：
①干酵母粉（市售）。②鲜酵母（市售）。
③pH试纸（pH1—10）。④台天平（100g）。
⑤烧杯100mL（×1）。⑥量筒50mL（×1）、10mL（×1）。
⑦抽滤瓶500mL（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。
⑧吸管0.5mL（×1）、1mL（×2）、2mL（×2）、5mL（×1）。
⑨离心机5000r/min。
2．试剂：
①0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。
②乙酸（A·R）。③95%乙醇。
④无水乙醚（C·P）。⑤氨水（C·P）。
⑥10%硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）10mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。
⑦5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL，贮于棕色瓶中。
⑧苔黑酚—三氯化铁试剂：将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O。临用时配制。
⑨定磷试剂
17％硫酸溶液：将17mL浓硫酸缓缓加入到83mL水中；
2.5％钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。
10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合。
17％硫酸溶液：2.5％钼酸铵溶液：10％抗坏血酸溶液：水＝1：1：1：2（V/V）
四、操作步骤：
1．RNA的提取：置4g干酵母粉于100mL烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40mL，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟
（4000r/min）。取上清液（30ml左右），加入95%乙醇30mL，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10mL），继用无水乙醚洗2次（每次10mL），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定(全部用离心的方法)。
2．鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸液5mL，加热至沸1-2分钟，将RNA水解。
（1）取水解液0.5mL，加苔黑酚—FeCl3试剂1mL，加热至沸1分钟，观察颜色变化。
（2）水解液2mL，加氨水2mL及5%硝酸银溶液1mL，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。
（3）磷酸水解液2mL，加入定磷试剂1 mL。水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。
五、结果与讨论：
1．所得RNA是否是纯品？如何进一步纯化？
2．RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？
实验八维生素C的定量测定
一、实验目的：
1．学习维生素C定量测定的一般原理；
2．掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定法定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。
二、实验原理：
维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。
抗坏血酸的定量测定方法很多，有2，6-二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法等。其中广泛采用的是DCIP滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。
在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2,6-DCIP还原成无色的还原型2,6-DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的2,6-DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2,6-DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6-DCIP立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6-DCIP便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2,6-DCIP标准溶液的消耗量（mL），可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2,6-DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6-DCIP标准溶液滴定至终点。其反应式如下：
本实验采用2,6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。
三、器材及试剂
1．器材：
①市售果汁；②吸管；③容量瓶；④锥形瓶；⑤微量滴定管；⑥天平；⑦抽滤装置
2．试剂：
①2%草酸溶液：草酸2g，溶于100mL蒸馏水。
（2%草酸液可用4%偏磷酸—醋酸溶液代替）
②1%草酸溶酸：溶1g草酸于100mL蒸馏水。
③标准抗坏血酸溶酸：准确称取50.0mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀至500mL。
贮棕色瓶、冷藏，最好临用时配制。
④1%HCl溶液。
⑤0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液：溶250mg2，6-二氯酚靛酚于150mL含有52mgNaHCO3
热水中，冷却后加水稀释至250mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4℃约可保存一至三周）。每次临用时稀释10倍，并以标准抗坏血酸溶液标定。
四、操作步骤：
1．样品提取滴定（水果汁样品）
将果汁充分摇匀后，取5mL样品放入50mL容量瓶中，用2%草酸溶液溶液稀释，并定容至50mL，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10mL放入锥形瓶内，立即用已标定过的2,6-DCIP溶液快速滴定至样品液呈现玫瑰色，并保持15-20s不变即为终点，记录所消耗的2,6-DCIP溶液的体积(mL)。样品液中抗坏血酸含量宜在0.1-0.2mg/mL范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另取10mL蒸馏水作空白对照滴定1份。样品液滴定3份，滴定结果取平均值。
2．2,6-二氯酚靛酚溶液的标定
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mL（含0.1mg抗坏血酸）置100mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，用滴定管以稀释10倍的2,6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少mg抗坏血酸。
五、结果与讨论：
1．计算：
抗坏血酸（mg/100g样品）=()
W
T
V
V
B
A
?
-
×100
T=1mL染料能氧化抗坏血酸mg数。
W=10mL样液相当于含样品之g数。
V A为滴定样品时所消耗的染料mL数（平均值）；
V B为滴定空白时所消耗染料的mL数。
2．讨论：
本法测定V C的利与弊。
注：①2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样功效。若样品中含有大量Fe2+可用8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以还原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用4%偏磷酸-醋酸液代替2%草酸液。
②如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。
③若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。
④如滤液颜色太深，滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色。
⑤样品中某些杂质亦能还原2,6-二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15秒钟为准。
六、思考题
1．提取VC时，加入2%草或4%偏磷酸-醋酸液的作用是什么？
2．如果提取液颜色太深而又无法脱尽，严重影响滴定终点判断时，是否有其它办法能准确判断出终点？
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生物化学实验的答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端为什么 2. 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 3.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 4.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 5.何谓R f值？影响R f值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 6.什么是盐析盐析会引起蛋白质变性吗一般我们用什么试剂做盐析的实验 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 7.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 8.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么影响蛋白质变性的因素是什 么沉淀和变性有何联系 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8. 什么是碘值脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么 答：每100g脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。
第二章 1.⑴清蛋白，功能：运输游离脂肪酸、某些激素、胆红素、多种药物（运输载体、运输营养）。 ⑵血浆脂蛋白：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等，功能:运输胆固醇,甘油三酯,磷酸及脂肪酸。？ 2.急性时相反应：当人体因感染、自身免疫性疾病等组织损伤侵害,诱导炎症,使单核细胞和巨 噬细胞等细胞释放紧急反应性细胞因子，再经血液循环，刺激肝脏细胞产生触珠蛋白、铜蓝蛋白、C-反应蛋白（CRP）等，使其血浆中浓度显著升高,而血浆前清蛋白、清蛋白、转铁蛋白浓度则出现相应下降,此炎症反应过程,称之为急性时相反应(APR)。该过程中出现的蛋白质统称为急性时相反应蛋白(APP)。 3.⑴前清蛋白(PA)：在SPE（正常血清蛋白电泳）中显示在清蛋白前方故而得名,主要包括视黄 醇结合蛋白(RBP)和甲状腺素转运蛋白(TTR)，两者均由肝脏合成. ⑵PA生理功能：PA为转运蛋白和组织修补材料。RBP转运视黄醇，TTR转运T4 。 ⑶PA临川意义：①属负性APP；②作为营养不良的指标（PA200~400mg/L为正常）； ③作为肝脏功能不全的指标。 4.⑴触珠蛋白(Hp)又称为结合珠蛋白，在SPE中位于α2区带。 ⑵生理功能:①能与红细胞中释放出的游离血红蛋白结合，每分子Hp结合两分子Hb； ②防止Hb从肾丢失而为机体有效地保留铁,并能避免Hb对肾脏的损伤。 ⑶临川意义:连续观察可用于监测溶血是否处于进行状态。 5.铜蓝蛋白(Cp)，肝实质细胞合成的单链多肽。 6.转铁蛋白(Tf)：临川意义：用于贫血的鉴别诊断，缺铁性低血色素贫血时，Tf代偿性合成增加。 7. C-反应蛋白(CRP)： 其临床意义：CRP是一个被认识的APP(急性时相反应蛋白)。CRP是非特异性指标，主要用于结合临床监测疾病：①筛查微生物感染；②评估炎症性疾病的活动度；③监测系统性红斑狼疮、白血病和外科手术后并发的感染；④新生儿败血症和脑膜炎的监测；⑤监测肾移植后的排斥反应。 8.⑴蛋白质测定一般利用以下蛋白质特有的结构或性质：①重复的肽链结构；②酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收；③与色素结合的能力；④沉淀后借浊度或光折射测定。 ⑵凯氏定氮法：是公认的参考方法，用于标准蛋白质的定值和校正其他方法。 ⑶双缩脲法：是临床常用常规方法。 ⑷直接紫外吸收法：用于较纯的酶、免疫球蛋白等蛋白质测定。 第三章 1.血糖：是指血液中的葡萄糖。空腹血糖浓度相对恒定在3.89~6.11mmol/L（70~110mg/dl） 2.降低血糖的激素：胰岛素由胰腺的胰岛B（β)细胞所产生的多肽激素。 3.升高血糖的激素：胰高血糖素由A(α)细胞分泌的一种多肽。 其功能作用: ①促进肝糖原分解和糖异生；②促进脂肪动员；③分泌主要受血糖浓度调节。 4.高血糖指空腹血糖浓度超过7.0mmol/L,若超过肾糖阈值(8.9-10mmol/L)时则出现尿糖。 5.糖尿病(DM)：是一组由于胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用低下而引起的代谢性疾病， 其特征是高血糖症。 6.糖尿病的诊断标准：①DM的典型症状（如多食、多饮、多尿和无原因体重减轻等），同时随机
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 答；电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的作用,为什么？ 答；空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？ 答；血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值？影响Rf值的因素？ 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质的变性吗？一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性，因为蛋白质的结构并未发生改变，去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解；一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？ 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
生物化学检验试题 一、单选题（本题满分30分，每小题1分） 1. 被大量钙、镁离子污染的玻璃器皿可用下列哪种洗涤剂洗涤（） A、合成洗涤剂 B、铬酸洗液 C、尿素洗液 D、EDTANa2 2. 静脉采血时，止血带压迫时间过长，会导致血清下列哪种物质含量降低（） A、总蛋白 B、胆固醇 C、胆红素 D、钾 3. 参考值范围一般以多少可信限为界（） A、90% B、95% C、98% D、99% 4. 离子强度（I）与电泳速度（V）及分辨力的关系是（） A、I大，V快，分辨力差 B、I小，V快，分辨力好 C、I大，V慢，分辨力好 D、I小，V慢，分辨力差 5. 血清钾的正常参考值是（） A、～L B、～L C、～L D、135～145mmol/L 6. 血液CO2的主要形式是（） A、Hb- NHCOOH B、Pr- NHCOOH C、HCO3－ D、物理溶解 7. 血清尿素测定下列哪一种方法属于直接法（） A、二乙酰一肟法 B、波氏法 C、电量法 D、电极法 8. 胆色素中无色的物质是（） A、胆红素 B、胆绿素 C、胆素原 D、胆素 9. 正常人血液的pH为（） A. 7.3± B. ±0.5 C. ± D. ± 10. 血浆阴离子间隙（AG）是指（） A. 血浆阳离子减去阴离子 B. 血浆Na+减去Cl—与HCO3— C. 血浆阴离子减去阳阴离子 D. 血浆Cl—与HCO3—减去Na+ 11. 新购置的玻璃仪器需用下列哪种溶液浸泡2～6h（） A、浓盐酸 B、浓硫酸 C、LHCl D、铬酸洗液 1211. OGTT成人口服葡萄糖量一般为（） A、50g B、75g C、100g D、150g 13. 下列哪型高脂蛋白血症易发生冠心病（） A、Ⅰ型 B、Ⅱa型 C、Ⅲ型 D、Ⅳ型 14. 甲状腺激素中活性最强的是（） A、MIT B、DIT C、T3 D、T4 15. 下列哪种蛋白质的测定对原发性肝癌有诊断价值（） A、Hp B、pA C、AFP D、TRF 16. 采用酶联—紫外连续监测法测定血清ALT活性，所用的工具酶是（） A、AST B、MDH C、LDH D、GLDH 17. 谷胱甘肽过氧化物酶组成的必需微量元素是（） A. 锌 B. 硒 C. 锰 D. 铬 18. 酶法测定血清胆固醇，试剂中加入胆酸钠的作用是（） A、激活CEH B、激活ChOD C、激活POD D、促进胆固醇从脂蛋白中释放 19. 1分子Hb可结合（） A、2O2 B、O2 C、4O2 D、4O 20. 载脂蛋白A1主要存在于（）
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、?-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用? D、沉淀作用? 10、有关变性的错误描述为（） A、蛋白质变性后，其一级结构和空间结构改变 B、蛋白质变性后，其理化性质和生物学活性改 变C、加热、紫外线照射、超声波等可以引起蛋白质变性D、变性蛋白质粘度增加，易被酶水解，易沉淀 11、双链DNA热变性后（） A、黏度下降 B、沉降系数下降 C、浮力密度下降 D、紫外吸收下降 12、酶的活化和去活化循环中，酶的磷酸化和去磷酸化位点通常在酶的哪一种氨基酸残基上（）
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端？为什么？ 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH 为的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.xxR f 值？影响R f 值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质变性吗？一般我们用什么试剂做盐析的实验？ 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 6?简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的
3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5 硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5 硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么？影响蛋白质变 性的因素是什么？沉 xx 变性有何联系？ 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8.什么是碘值？脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗？在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么？ 答：每100g 脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。 9.简述薄层层析法分离糖类的原理？答:薄层层析的实质就是吸附层析，也就 是在铺有吸附剂的薄层上，经过反 复地被吸附剂吸附以及被扩展剂扩展的过程。而吸附剂对不同的物质的吸附力不同，从而使糖在薄层上的泳动速度不同达到分离的目的。 10.等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点？ 答：当溶液的PH为一定数值时，其中的蛋白质正负电荷相等，即净电荷为 零，此时的PH值就是该蛋白质等电点。蛋白质在等电点时的溶解度最小。 11.在蛋白质显色实验的黄色反应中，反应原理是什么？实验结果为什么会出现深浅不一的黄色？
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净； 3.加入硫酸铵固体时一定要小心缓慢，同时伴有玻璃般的搅拌，在溶解蛋白的过程中避免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果； 4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
第二章 1.⑴清蛋白,功能:运输游离脂肪酸、某些激素、胆红素、多种药物(运输载体、运输营养)。 ⑵血浆脂蛋白:乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等,功能:运输胆固醇,甘油三酯,磷酸及脂肪酸。？ 2.急性时相反应:当人体因感染、自身免疫性疾病等组织损伤侵害,诱导炎症,使单核细胞与巨噬 细胞等细胞释放紧急反应性细胞因子,再经血液循环,刺激肝脏细胞产生触珠蛋白、铜蓝蛋白、C-反应蛋白(CRP)等,使其血浆中浓度显著升高,而血浆前清蛋白、清蛋白、转铁蛋白浓度则出现相应下降,此炎症反应过程,称之为急性时相反应(APR)。该过程中出现得蛋白质统称为急性时相反应蛋白(APP)。 3.⑴前清蛋白(PA):在SPE(正常血清蛋白电泳)中显示在清蛋白前方故而得名,主要包括视黄醇 结合蛋白(RBP)与甲状腺素转运蛋白(TTR),两者均由肝脏合成、 ⑵PA生理功能:PA为转运蛋白与组织修补材料。RBP转运视黄醇,TTR转运T4 。 ⑶PA临川意义:①属负性APP;②作为营养不良得指标(PA200~400mg/L为正常); ③作为肝脏功能不全得指标。 4.⑴触珠蛋白(Hp)又称为结合珠蛋白,在SPE中位于α2区带。 ⑵生理功能:①能与红细胞中释放出得游离血红蛋白结合,每分子Hp结合两分子Hb; ②防止Hb从肾丢失而为机体有效地保留铁,并能避免Hb对肾脏得损伤。 ⑶临川意义:连续观察可用于监测溶血就是否处于进行状态。 5.铜蓝蛋白(Cp),肝实质细胞合成得单链多肽。 6、转铁蛋白(Tf):临川意义:用于贫血得鉴别诊断,缺铁性低血色素贫血时,Tf代偿性合成增加。 7、C-反应蛋白(CRP): 其临床意义:CRP就是一个被认识得APP(急性时相反应蛋白)。CRP就是非特异性指标,主要用于结合临床监测疾病:①筛查微生物感染;②评估炎症性疾病得活动度;③监测系统性红斑狼疮、白血病与外科手术后并发得感染; ④新生儿败血症与脑膜炎得监测;⑤监测肾移植后得排斥反应。 8、⑴蛋白质测定一般利用以下蛋白质特有得结构或性质:①重复得肽链结构;②酪氨酸与色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收; ③与色素结合得能力;④沉淀后借浊度或光折射测定。 ⑵凯氏定氮法:就是公认得参考方法,用于标准蛋白质得定值与校正其她方法。 ⑶双缩脲法:就是临床常用常规方法。 ⑷直接紫外吸收法:用于较纯得酶、免疫球蛋白等蛋白质测定。 第三章 1.血糖:就是指血液中得葡萄糖。空腹血糖浓度相对恒定在3、89~6、11mmol/L(70~110mg/dl) 2.降低血糖得激素:胰岛素由胰腺得胰岛B(β)细胞所产生得多肽激素。 3.升高血糖得激素:胰高血糖素由A(α)细胞分泌得一种多肽。 其功能作用: ①促进肝糖原分解与糖异生;②促进脂肪动员;③分泌主要受血糖浓度调节。 4.高血糖指空腹血糖浓度超过7、0mmol/L,若超过肾糖阈值(8、9-10mmol/L)时则出现尿糖。 5.糖尿病(DM):就是一组由于胰岛素分泌不足或(与)胰岛素作用低下而引起得代谢性疾病, 其特征就是高血糖症。 6.糖尿病得诊断标准:①DM得典型症状(如多食、多饮、多尿与无原因体重减轻等),同时随机血糖
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
《生物化学实验》容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事的科学态度。 二、实验容
包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据； （3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。 3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性
糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电加热板或电 炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻璃棒1根； 100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）；不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若干。每个洗 手池常规配置烧杯刷、毛巾、洗手液。 四、实验操作 取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎，加入5～10ml蒸馏水，在研钵中磨成均浆，转入锥形瓶中，用蒸馏水少量多次冲洗研钵，洗出液也转入锥形瓶中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液冷却后过滤到100ml容量瓶中，同法残渣再提取2~3次，将提取液合并至容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。贴好标签，保存至冰箱中，用于实验二。 五、实验结果与讨论 1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验二结果计算含量 六、实验注意事项 （1）若有干扰，可滴加饱和中性醋酸铅以除去溶液中的蛋白质，乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质，若色素较多可脱脂。 （2）加热时应小心，避免灼伤皮肤。 七、思考题 1、可溶性糖在植物物质代中的作用。
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。