微生物蛋白质组学的定量分析
王敬强 殷剑宁 刘斯奇3
(中国科学院遗传与发育生物学研究所基因组信息学中心,北京101300)
摘要 越来越多的微生物基因组序列数据为系统地研究基因的调节和功能创造了有利条件.由于蛋白质是具有生物功能的分子,蛋白质组学在微生物基因组的功能研究中异军突起、蓬勃发展.微生物蛋白质组学的基本原则是,用比较研究来阐明和理解不同微生物之间或不同生长条件下基因的表达水平.显而易见,定量分析技术是比较蛋白质组学中急需发展的核心技术.对蛋白质组学定量分析技术在微生物蛋白质组研究中的进展进行了综述.
关键词 微生物,蛋白质组学,定量分析
学科分类号 Q51
在基因组研究热潮的推动下,蛋白质组学正在从一个符号变成一门蓬勃发展的严肃学科.但是,它所面临的技术瓶颈区域却日益尖锐地摆在研究者面前[1].因此实现蛋白质组学的技术革命是学科是否健康发展的基本前提.
大规模基因组序列测定的目的在于精确地了解某一生物体的基因结构以及基因数量.蛋白质组的分析则着重于阐明某一生物体的某一组织或某一细胞,甚至是某一细胞器在某一时间点上基因表达的水平.因而,在基因组已经确定的前提下,蛋白质组分析所关心的问题是基因表达量的“有与无”或“多与少”[2].蛋白质组表达差异分析的主要问题是如何合理地比较蛋白质组之间的差别,即如何分析不同细胞或不同时刻之间各种蛋白质表达的相对丰度.因此建立一套稳定的参照系统和一套普通适合的测定度量是非常关键的.由此可见,定量测定是蛋白质组分析的一个核心技术问题.
分子生物学和基因组学的发展均以简单生物系统作为突破口,蛋白质组研究也概莫能外.微生物体作为一种理想的生物材料,已被广泛地应用于这些研究中[3].对研究蛋白质组的分析技术而言,微生物具有以下突出的特点:a1微生物的基因组比较小,基因和细胞器结构相对简单,并且蛋白质修饰水平较为低下,因此微生物细胞蛋白质组所含的蛋白质数量比其他高级生物系统要少得多.b1微生物的培养条件可以严格地控制,因此可以在设计的实验条件下,观察微生物蛋白质组表达水平的变化;c1在微生物研究领域中,细胞学、分子生物学和基因组学已经积累了丰富的数据,这些构成了蛋白质组研究的坚实基础;d1微生物的实验周期短,取材简单、便宜.这些都是开发分析技术的理想条件.
蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别,而不在于测定其绝对浓度.根据蛋白质组分析的手段,定量方法可大致分为电泳定量法和色谱定量法;根据处理蛋白质方法不同,又可分为体外标记法(labeling i n vit ro)和体内标记法(labeling i n vivo).
1 体外标记的电泳定量法
这种定量法一般采用不同的蛋白质显色剂,将电泳分离的蛋白质染成可被肉眼或机器识别的斑点,然后运用图像分析软件定量比较斑点的吸光度差别.
111 直接染色比较法
虽然双向电泳(two2dimensional electrophoresis, 2DE)并非一种理想的定量分析系统,但是它可以直观地反映蛋白质表达的差异.考马斯亮蓝染色法和银染法是两个普遍使用的染色方法.考马斯亮蓝染色的敏感性较差(约100ng),银染的敏感性虽然较高(1～10ng),但它的浓度动力学范围较窄.因此这两种方法不适合于相对严格的定量分析比较.目前公认的理想方法是荧光染色,最常用的是Molecular Probe公司生产的SyPro Ruby.这种试剂在敏感性(100fmol)和动力学方面(103)都基本可以满足蛋白质组定量分析的要求[4].传统的以双向电泳(2DE)为基础的差异蛋白组分析分为
3通讯联系人.
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收稿日期:2002212210,接受日期:2003201228
两步:a 1不同的样品在不同的胶上进行分离、染色,并进行吸光度定量;b 1运用图像分析软件比较不同的胶图,找出吸光度有差异的蛋白质点.目前最常用的双向电泳图像分析软件有Biolmage 2D Investigator ,ImageMaster 22D Elite ,Melanie 和PDQuest.然而,斑点吸光度的定量仍然是一个很困难的步骤,这大部分是由2DE 技术的不足引起.因为即使是同一样品的平行实验,要完全保持平行胶图中吸光度的一致性也是很困难的.因此,每个
样品必须作几个平行实验以计算每个点的平均值,尽量减少实验的误差.此外,胶点的匹配,也经常会出错,必须进行手动的校正.总之,多个平行实验和胶图的匹配,使得样品的差异比较成了一个费时、费力的过程.112 荧光双向差异凝胶电泳法
为了解决胶图间的比较问题,人们发明了一种荧光标记与双相电泳相结合的技术———荧光双向差异凝胶电泳法(fluorescence two 2dimensional differential gel electrophoresis ,DIGE )[5],将待比较的蛋白质样品预先经不同的花菁染料(如Cy2,Cy3,Cy5)标记后,等量混合进行电泳.蛋白质之间的差异可以通过蛋白质斑点不同荧光信号的比率来决定,因此可以直接从一张胶图上得到差异点(图1).与传统的差异比较相比,DIGE 是在同一块胶上分析两个不同的样品,然后通过分别显色来显示差异.由于样品出自于同一胶图,能够重叠,
Fig 11 Fluorescence tw o 2dimensional differential gel
electrophoresis (DIGE )
图1 荧光双向差异凝胶电泳比较法(DIGE )
可以直接用于比较.因此蛋白质重现性与2DE 系统无关.为确保这种方法的准确度,可以在不同的样品中加入同一种蛋白质,作为内标.利用荧光双向差异凝胶电泳,可以进行各种微生物蛋白质组的差异分析.113 免疫测定法
利用免疫化学的特点定量分析蛋白质是一类相当成熟的技术,如蛋白质印迹(Western blot ),酶联免疫吸附测定(EL ISA ).这种方法应用于蛋白质组分析的关键问题是能否找到一类广普性识别的抗体.革兰氏阴性细菌Helicobacter pylori 是一种病原体.它侵入胃粘膜引起发炎,可导致胃溃疡乃至胃癌.H.pylori 感染人体,会引起免疫反应,产生抗体.受感染的病人血液中就会含有若干抗H.pylori 蛋白质的抗体.利用这一特点,Haas 等[6]成功地找到了H.pylori 与胃疾病相关的直接证据.他们取H.pylori 细菌提取液做几组平行的双向电泳实验,一组银染作为对照胶,胶点进行定量分析和质谱鉴定;另一组电转至几块聚偏二氟乙烯(PVDF )膜.然后把PVDF 膜分别与正常人、胃溃疡患者和胃癌患者的血清共孵育,与抗体结合的蛋白质再用第二抗体显色检测.最后,比较银染图谱和免疫图谱,就可以判断何种疾病与H.pylori 的感染相关.在H.pylori 感染的与胃癌相关的免疫蛋白质组学研究中,该小组报告得到了32种抗原(9种新发现的抗原,其余23种已被其他的研究证实).采用类似的策略,K ornilovska 等[7]将Helicobacter 的细胞提取物直接注射至兔子体内,然后用免疫的兔血清在细菌蛋白质的2DE 2PVDF 膜上筛选高抗性的抗原,找到了若干个具有
临床检验意义且免疫活性的Helicobacter 蛋白质.
2 体内标记的电泳定量法
这种定量法一般采用不同的同位素标记物,直接将其加入到微生物的培养液中,参与细胞的蛋白质合成.电泳之后,分离的蛋白质用放射自显影方法检测并加以定量分析.211 单种同位素标记法
将35S 甲硫氨酸掺入到蛋白质合成中的方法,是一种广泛应用于细菌蛋白质研究体内蛋白质代谢的经典方法,将不同微生物分别与含有35S 甲硫氨酸的培养液孵育一段时间,提取细胞蛋白质进行双向电泳分离.分离的蛋白质同时用银染和放射性自显影检测,依据相对密度测定蛋白质表达的高低.
例如,Shaw等[8]利用这种方法进行了Chlam ydia t rachom atis serovar A,D和L2三个菌株的比较蛋白质组学分析.尽管这三种菌株的基因组相当接近,但蛋白质表达却大相径庭. C.t rachom atis A 和D之间有6个蛋白质不同;D和L2之间有55个蛋白质不同;A和L2之间有2个蛋白质不同.不过,35S甲硫氨酸标记法也有十分明显的缺点: a1放射性自显影定量分析的误差较大;b1在不同蛋白质合成过程中,35S甲硫氨酸掺入程度也有差异;c1高放射性以及高费用,使实验操作性大打折扣.
212 差异凝胶曝光法
在DIGE的基础上,Boucherie小组[9]新近发展了一套蛋白质定量比较技术———差异凝胶曝光法(differential gel exposure,Dif Expo).与DIGE类似,Dif Expo也沿用不同蛋白质不同标记,在同一
,但是采用同位素进行体内标记.将同种细胞在含有两种不同的同位素(14C和3H)培养液中培养,并经过不同的处理. 14C和3H会掺入到细胞内合成的蛋白质中去.将等量的细胞混合,提取蛋白质进行双向电泳.蛋白质的定量比较通过放射自显影来完成.在这一过程中,需要两种不同的感光胶片:一种只对14C敏感,另一种对14C和3H都敏感.通过放射自显影和图像分析,不同样品中相同蛋白质的14C/3H的比率可以被测定出来,从而达到了蛋白质组间定量比较的目的.Dif Expo技术的优点在于蛋白质的体内标记,不需要特殊的设备.Boucherie小组利用这种方法比较了酵母几百种蛋白质的表达水平,发现Dif Expo的灵敏度可以与银染相媲美.
3 体外标记的色谱定量法
色谱定量法的核心技术在于单位时间内色谱峰的质谱分析.虽然质谱技术对蛋白质或肽段混合物的直接定量是一个非常理想的方法,但电子喷雾过程对离子化的抑制作用,造成了质谱信号与蛋白质浓度之间的非线性关系.因此,如何设定一个稳定的参照物成了质谱定量的关键问题.参照物的设定可以采用两种方法:a1设定一个稳定的质谱参照物,所有质谱峰的强度都与之比较,但这种参照物在蛋白质的质谱分析中是难以做到的;b1每一个质谱峰都设有各自的参照物,理论上,这类参照物除了分子质量与待测物品有差别外,其他的理化性质应与其无异.肽段同位素标记法正是基于这种假设而发展起来的[10].以一个肽段为例,一部分肽段以同位素标记,另一部分不标记.标记和未标记肽段的色谱行为是一致的,进而它们的质量差异可以被质谱仪检测到.通过比较它们之间相对的质谱信号强度,就可以准确地估算到标记和未标记肽段之间的相对丰度.肽段的体外标记目前有以下3种方式.
311 半胱氨酸修饰法
半胱氨酸的巯基是蛋白质分子中相当活跃的基团.Gygi等[11]利用生物素和碘乙酰胺的衍生物作为半胱氨酸的修饰剂,发展了一种目前公认的较为成熟的蛋白质组定量方法———ICA T技术(isotope coded affinity tags).而且ICA T试剂已经商品化.简单地说,ICA T技术大概分为4个阶段.a1利用轻型和重型ICA T试剂(D82ICA T,H82ICA T)分别处理两种不同的蛋白质样本;b1采用生物素的亲和层析法将与ICA T反应之后的肽段部分纯化; c1HPLC分离肽段;d1多级质谱法(MS n)检测被分离的肽段.ICA T技术已经成功地应用在酵母蛋白质组分析上[11,12].将酵母分别在以乙醇和半乳糖为碳源的培养基上培养,收集蛋白质,取其中26种典型的蛋白质做ICA T分析,它们在不同培养液中的表达丰度有极大的差异,相对丰度差异有0134至100倍.Aebersold研究小组[12]还利用ICA T与2DE2MALDI2MS结合的策略,研究了S.cerevisiae培养液中葡萄糖转变为半乳糖过程中蛋白质组的定量变化.发现参与葡萄糖代谢的酶类,像醛缩酶、甘油醛23磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶等,在半乳糖介质中的表达量显著下降.相反某些线粒体蛋白质的表达(像COX4,A TPD)却显著增加.有趣的是,这些变化又都与定量mRNA分析的结论一致.
尽管ICA T的优点很多,它也有不足之处. ICA T技术的基本立足点在于蛋白质中含有半胱氨酸,事实上不是所有的蛋白质都含有半胱氨酸.比如,酵母菌有8%的蛋白质没有半胱氨酸,因此ICA T是无法测定那些蛋白质的变化.自然界里某些生物中缺乏半胱氨酸的蛋白质可能达到其蛋白质组的20%.另外,ICA T试剂中生物素既作为修饰剂的载体又作为亲和层析的结合剂,而生物素的分子体积较大且与抗生物素蛋白结合牢固,造成了修饰反应速度低、对肽段离子化的抑制以及洗脱效率不足等弱点.
近年以来,Zhou等[13]进一步发展了ICA T技
术,推出了一种光敏的固相修饰剂.在玻璃微珠上涂上氨丙基材料,再依次连接一个光敏分子和一个对巯基有特异性的碘乙酰分子.将这种固相修饰剂和ICA T平行进行S.cerevisiae蛋白质组测定的比较研究,发现无论是大规模还是小量蛋白质组分析,新试剂对蛋白质的检出率是ICA T的3倍以上.最近,Qiu等[14]报道了另一种称为AL ICE(acid2labile isotope coded extractants)的新型巯基修饰剂.AL ICE含有3个功能区域:a1与巯基高反应的顺丁烯酰亚胺基团;b1酸敏感连接分子,该分子可以重或轻的同位素合成;c1非生物的多聚物.AL ICE的最大特点是酸敏感性,在p H710～715,AL ICE可与肽段的巯基完全反应,在微酸的条件下(5%三氟醋酸),酸敏感连接分子与有机多聚物分离.酸洗脱的肽段可直接进入LC2 MS/MS.
312 羧基修饰法
肽段的羧基端、谷氨酸和天冬氨酸的羧基都可以掺入同位素.最简单的方法是用含有氢或氘的乙醇盐酸与肽的羧基作用产生酯.但这种反应的特异性和完全性都不够.目前最常见的是酶解法.将样品置于含有16O或18O的缓冲液中,加入蛋白水解酶消化蛋白质,含有16O或18O的水分子就可以转移至分解的肽段上.Yao等[15]在进行腺病毒(adenovirus)血清型的研究中,采用了这种技术.他们对不同血清型的两组蛋白质样品(Ad2和Ad5)在普通的水(H216O)和18O标记的水中酶解.而后,将酶解的两种产物等量混合,再利用液相色谱和质谱技术分离鉴定蛋白质.由于18O标记的肽段要比相应的肽段多4u,据此可以计算出两组蛋白质组的相对丰度.
313 氨基修饰法
肽段的氨基端、赖氨酸氨基的酰基化也可以掺入同位素.Cagney等[16]发明了一种称之为MCA T (mass2coded abundance tagging)的新技术用以蛋白质组定量分析.氧甲基异脲(O2methylisourea)可与赖氨酸的ε2氨基发生专一的胍化反应,但与另一个碱性氨基酸———精氨酸基本无反应.当蛋白质被胰蛋白酶完全水解后,含有赖氨酸的肽段被释放出来,而后加入O2methylisourea即可有效地修饰其ε2氨基(修饰率>90%).MCAT分析过程大致分为4个阶段:a1两组需进行比较的样品在胰蛋白酶作用下完全水解;b1其中一个样品与O2methylis ourea 反应,另一组则不加入O2methylis ourea;c1将二者混合,于LC2MS/MS中分离、鉴定;d1根据胍化赖氨酸的质量,比较同一对肽段的相对丰度.迄今为止,MCA T法是唯一的一种不采用同位素标记的色谱标记定量法.MCA T虽罕见报道,但是Cagney对酵母蛋白质组的定量分析结果表明:实际检测的相对丰度与理论丰度之间的相关性达到了0188.因此,MCA T是一种有潜力的定量方法之一.
4 体内标记的色谱定量法
对于观察环境对细胞生长的影响,体内标记法是体外标记法所无法取代的.与体外标记的思路基本一致,目前体内标记的色谱定量法也多采用相对丰度法,即不同细胞分别在含有不同轻重同位素的培养液中分别培养,然后将这两种细胞的蛋白质提取物混合,再进行液相色谱分离和质谱鉴定.14N 和15N是目前在体内标记的色谱定量中应用较多的同位素.氮可能掺入所有的氨基酸上,所有的肽段都可能含有同位素,产生的质谱信号就会极其复杂.为了简化分析,C onrads等[17]在研究Dei nococcus radiodurans蛋白质组过程中,提出了一种富集肽段的策略.将D.radiodurans于分别含有14N和15N 的培养液中培养,然后将等量的细胞混合,提取蛋白质.而后将提取的蛋白质混合物与碘乙酰2PEO2生物素反应.碘乙酰2PEO2生物素是Pierce公司生产的一种高效巯基反应剂,迅速修饰蛋白质上的半胱氨酸.修饰的蛋白质再经胰蛋白酶水解、抗生物素的抗体树脂富集浓缩、洗脱下来的含有巯基的肽段经毛细管HPLC分离以及傅立叶变换离子回旋质谱仪(F TICR)分析.Conrads等的研究结果表明:不同同位素培养液培养的D.radiodurans蛋白质组的相对丰度为1∶1,即同位素氮源的差异不影响细菌蛋白质的表达.尽管这种方法在一定程度上减轻了质谱分析的难度,但氮掺入是一个随机的过程,肽段的质量转移是难以预测的.所以,除了非常高精确性的质谱仪,如F TICR,一般的质谱仪不能胜任这样复杂的肽段鉴定.这也是氮掺入法不能被广泛应用的一个重要原因.近来,Wang等[18]提出了另一种非常新颖的方案———倒置标记法(inverse15N2metabolic labeling).假定有两组待比较的细菌,每种细菌分别在含有14N和15N的溶液中培养,并提取蛋白质及进行胰蛋白酶水解.然后将一种细菌的14N标记肽段与另一种细菌的15N标记肽段混合,反之亦然.这样就会产生两组质谱数
据.将两组质谱数据相比较,减去互为重叠的信号,就可望得到两组蛋白质组的表达差异.
5 展 望
无论就技术更新而言,还是就生物科学命题而言,定量分析已经成为微生物蛋白质组学的一个主要方向.今年以来,大量发表的有关这方面的研究报告就十分生动地说明了这种趋势[19].在未来的几年内,定量蛋白质组分析可能在以下的几个方面将有革命性的进展:a12DE逐渐从目前蛋白质组的主导技术逐渐退至非主流,取而代之将是具有高分辨率和高通量的分析技术,像多维色谱,毛细管电色谱,毛细管电泳,蛋白质芯片技术以及各种技术的匹配使用;b1由于蛋白质和肽段混合物的复杂性以及标记技术的应用,精确质谱分析变得十分重要,像Q TOF和F TICR之类的技术将会有更大的发展空间,但是其市场价格会有下降的趋势;c1体外同位素标记技术可能还是未来定量分析的一个主要手段,随着多种标记化合物的发明,一种或多种标准化的蛋白质组定量方法必将出现;d1如同基因组测序,蛋白质组定量方法将朝着全自动操作的方向发展;e1与传统的蛋白质组数据库不同,新型的定量蛋白质组数据库将会诞生.
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Q uantitative Analysis of Microbial Proteomics
WAN G Jing2Qiang,YIN Jian2Ning,L IU Si2Qi3
(Beiji ng Genomics Instit ute/Genomics and Bioi nf ormatics Center,Instit ute of Genetics and
Developmental Biology,The Chi nese Academy of Sciences,Beiji ng101300,Chi na)
Abstract The rapidly accumulating data of sequenced microbial genomes allows to conduct systematic studies on microbial gene regulation as well as function.As proteins are often the functional molecules,proteomics is particularly booming in the functional studied of microbial https://www.doczj.com/doc/3485690.html,ing comparative studies as the powerful tools,a fundamental principle in microbial proteomics is to elucidate and to understand the gene expression levels in different microorganisms or under different growth conditions.It is very obvious that the quantitative analytical techniques are highly required for comparative proteomics.The current status of the approaches applied to quantitative analysis of microbial proteomics were reviewed.
K ey w ords ,proteomics,quantitative analysis
3Corresponding author.Tel:86210280481334,E2mail:siqiliu@https://www.doczj.com/doc/3485690.html,
Received:December10,2002 Accepted:January28,2003
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名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用 Application of Proteomics based on Mass Spectrum in the microorganism identification / classification 微生物这类非常微小而又种类繁多的生物与我们的生活息息相关，近20年来，新的传染病不断出现，如传染性非典型肺炎（SARS）、艾滋病（HIV）、军团菌病、莱姆病（Lyme）、埃博拉出血热（Ebola）、拉沙热（Lassa）、O139型霍乱、致病性大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎、肠弯曲菌肠炎、汉坦病毒、B组轮状病毒腹泻、疯牛病（克-雅氏病）、禽流感等等，这些新传染病的出现严重威胁人类的身体健康，给人类社会带来了难以估量的后果。同时，随着经济贸易的全球化，国际旅游业的飞速发展也加速了一些传染病的全球化进程，加快了新发传染病的传播速度，也使一些过去得到控制的传染病如结核、多抗药性的链球菌属感染等重新蔓延。当然，除过病原菌以外，腐败菌、有益菌及环境微生物等与我们的健康和生活亦密切相关，这种微生物的多样性为全球制药产业、环境治理、食品工业以及生物技术的发展提供了丰富的资源储备，同时也对人类的健康构成极大的威胁，所以快速、准确鉴定微生物日益成为临床、环境和工业领域的迫切需要，各个国家从来都是不遗余力的在建立、健全菌种资源保存库的同时，积极研究开发快速、准确鉴定微生物身份的新技术和新方法，致力于建立健全微生物资源保存库和鉴定标准库，在临床上为传染病的快速筛查、检测、分离、鉴定、追踪、预警、治疗和预后具有重要意义。目前，尽管微生物鉴定系统实现了鉴定过程的规范化和程序化，将微生物对底物的生化类型与已建立数据库类型相比较来鉴定微生物，但其反应准确性受接种物浓度、孵育条件和试验解释等的影响。自20世纪80～90年代以来，微生物鉴定系统不断发展，自动化程度不断提高，尤其是基于质谱技术的蛋白质组技术和代谢组技术在微生物研究领域的介入，使得微生物鉴定达到了快速、准确、大规模、高通量的水平。 一、微生物鉴定系统方法的发展 （一）微生物鉴定的传统方法 微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，主要包括以下几类： 1.生化方法 该法检测微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同，对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无，从而达到检测特定微生物的目的。 2.免疫学技术 免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞、特定抗原(抗体)的定性
《基因组学与蛋白质组学》课程教学大纲 学时： 40 学分：2.5 理论学时： 40 实验学时：0 面向专业：生物科学、生物技 术课程代码：B7700005先开课程：生物化学、分子生物 学课程性质：必修/选修执笔人：朱新 产审定人： 第一部分：理论教学部分 一、课程的性质、目的和任务 《基因组学与蛋白质组学》是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，是融合了生物信息学、计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。是当今生命科学研究的热点与前沿领域。由于基因组学与蛋白质组学学科的边缘性，所以本课程在介绍基因组学与蛋白质组学基本基本技术和原理的同时，兼顾学科发展动向，讲授基因组与蛋白组学中的热点和最新进展，旨在使学生了解现代基因组学与蛋白质组学理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、课程的目的与教学要求 通过本课程的学习，使学生掌握基因组学与蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在基因组学与蛋白质组学上的应用及典型研究实例，熟悉从事基因组学与蛋白质组学的重要方法和途
径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，并通过学习提高自学能力、独立思考能力以及科研实践能力，为将来从事蛋白质的研究奠定坚实的理论和实践基础。 三、教学内容与课时分配 第一篇基因组学
第一章绪论（1学时） 第一节基因组学的研究对象与任务； 第二节基因组学发展的历程； 第三节基因组学的分子基础； 第四节基因组学的应用前景。 本章重点： 1. 基因组学的概念及主要任务； 2. 基因组学的研究对象。 本章难点： 1.基因组学的应用及发展趋势； 2.基因组学与生物的遗传改良、人类健康及生物进化。建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题： 查阅有关资料，了解基因组学的应用发展。 第二章人类基因组计划（1学时） 第一节人类基因组计划的诞生； 第二节人类基因组研究的竞赛； 第三节人类基因组测序存在的缺口； 第四节人类基因组中的非编码成分； 第五节人类基因组的概观； 第六节人类基因组多样性计划。 本章重点： 1. 人类基因组的研究； 2. 人类基因组多样性。 本章难点： 人类基因组序列的诠释。 建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题：
生 物 灾 害 科 学 2015, 38(2): 92-97 https://www.doczj.com/doc/3485690.html, Biological Disaster Science, V ol. 38, No. 2, 2015 DOI：10.3969/j.issn.2095-3704.2015.02.003 聂丽, 邵正英, 魏赛金. 微生物蛋白质组学的研究进展[J]. 生物灾害科学, 2015, 38(2):92-97. 微生物蛋白质组学的研究进展 聂 丽，邵正英，魏赛金 * （江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045） 摘要：随着蛋白质组学研究技术的发展，微生物蛋白质组学研究具有突破性的进展。简要介绍蛋白质组学的分 类，概括5种蛋白质组学技术，综合分析极端微生物、放线菌、病原菌以及群体微生物蛋白质组学研究及应用 的最新进展。 关键词：蛋白质组学；极端微生物；放线菌；病原菌；群体微生物 中图分类号：Q936 文献标志码：A 文章编号：2095-3704（2015）02-0092-06 Research Progress of Microbial Proteomics NIE Li, SHAO Zheng-ying, WEI Sai-jin * (College of Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang330045, China) Abstract: With the development of proteomics researches, the microbial proteomics research got breakthrough progress. This paper briefly introduces the classification of proteomics, summarizes five kinds of proteomics technology, and does the comprehensive analysis of the latest research progress of extreme-ophiles, actinomycetes, pathogens and microbial population proteomics. Key words: proteomics? extreme-ophiles? actinomyces? pathogens? microbial populations 目前，研究蛋白质组学已经成为生命科学的热点和焦点，开展蛋白质组研究对生命科学研究进入后 基因时代具有跨时代的意义，也是后基因时代中生命科学研究的核心要素。蛋白质组（proteome）一词 最早在 1994 年由澳大利亚科学家 Wilkins 等 [1] 提出的，意指一个组织或细胞中的全部蛋白质由基因组表 达。蛋白质组学（proteomics）是从整体动力学角度分析细胞内蛋白质修改状态、表达水平来了解蛋白质 之间的相互作用，从而揭示细胞的活动规律及蛋白质功能。 1 蛋白质组学的分类 根据研究目的和手段的不同，蛋白质组学可分为组成性蛋白组学、比较蛋白组学和相互作用蛋白质 组学 [2] 。组成性蛋白质组学是鉴定并详细阐述某个体系中蛋白质翻译后修饰的各种特性；Ohta 等 [3] 用定 量蛋白组学描述了 4 000 蛋白质识别孤立的有丝分裂染色体。比较蛋白质组学即差异显示蛋白质组学， 是以人类重大疾病或以重要生命过程为主要研究对象，进行病理和生理体系或蛋白质在过程中的差异表 达；Hamler 等 [4] 应用二维液相分离结合质谱鉴定的路线比较了乳腺癌上皮细胞与正常乳腺上皮细胞间蛋 白质间的差异表达。 蛋白质组学的相互作用是应用各种先进技术对蛋白质间的相互作用进行研究,将某体 系中蛋白质间的作用绘制成网络图谱。Ohta 等 [3] 进一步通过生物信息学分析，预测蛋白质的功能。 收稿日期：2014-12-20 基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ13283) 作者简介：聂丽，女，硕士生，主要从事微生物研究，E-mail：530041190@https://www.doczj.com/doc/3485690.html,；*通信作者：魏赛金，博士，教授， E-mail:weisaijin@https://www.doczj.com/doc/3485690.html,。
通过校园网进入数据库例如维普期刊数据库、CNKI、超星电子图书等。完成 A、任选一题，检索相关资料，截取检索过程图片，做成一个ppt文件（50分）。 B、写综述形式的学术论文(学术论文格式，字数不限，正文字体小四)，做成word文件（50分）。要求：按照自己的思路组织成文件，严禁抄袭。 写明班级学号，打印纸质版交给老师。 1、对检索课题“磷酸对草莓生长和开花的影响”检索中文信息。提示：磷酸的化学物质名称是“Phosphonic acid ”普通商业名称是“ethephon”， 2、基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响 3、红霉素衍生物的设计、合成与抗菌活性研究 4、HPLC法测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中L-谷氨酰胺的释放度 姓名：朱艳红 班级： 11生科师范 学号： 11223074 学科教师：张来军
基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响琼州学院生物科学与技术学院 11生科师范2班朱艳红 11223074 摘要 20世纪末伴随着人类基因组计划的实施，相继产生了基因组学和蛋白质组学，基因组学和蛋白质组学的迅速发展，对药学科学产生着深远的影响。文章在简介蛋白质组学基本概念、核心技术的基础上，综述了基因组学和蛋白质组学对新药研发带来的影响。 关键词：基因组学；蛋白质组学；药物研发 The impact of genomics and proteomics on the research and development of innovative drug abstract With the implementation of the 20th century,Genomics and proteomics had emerged one after the other. Driven by Soaring development of the omits，pharmaceutical industry presents a new vision，all human life faces a promising future. On the basis of proteomics Introduction to basic concepts, core technology, reviewed the genomics and proteomics research on the impact of new drugs. Keywords:Genomics; proteomics; drug development
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
微生物蛋白质组学的定量分析 王敬强 殷剑宁 刘斯奇3 (中国科学院遗传与发育生物学研究所基因组信息学中心,北京101300) 摘要 越来越多的微生物基因组序列数据为系统地研究基因的调节和功能创造了有利条件.由于蛋白质是具有生物功能的分子,蛋白质组学在微生物基因组的功能研究中异军突起、蓬勃发展.微生物蛋白质组学的基本原则是,用比较研究来阐明和理解不同微生物之间或不同生长条件下基因的表达水平.显而易见,定量分析技术是比较蛋白质组学中急需发展的核心技术.对蛋白质组学定量分析技术在微生物蛋白质组研究中的进展进行了综述. 关键词 微生物,蛋白质组学,定量分析 学科分类号 Q51 在基因组研究热潮的推动下,蛋白质组学正在从一个符号变成一门蓬勃发展的严肃学科.但是,它所面临的技术瓶颈区域却日益尖锐地摆在研究者面前[1].因此实现蛋白质组学的技术革命是学科是否健康发展的基本前提. 大规模基因组序列测定的目的在于精确地了解某一生物体的基因结构以及基因数量.蛋白质组的分析则着重于阐明某一生物体的某一组织或某一细胞,甚至是某一细胞器在某一时间点上基因表达的水平.因而,在基因组已经确定的前提下,蛋白质组分析所关心的问题是基因表达量的“有与无”或“多与少”[2].蛋白质组表达差异分析的主要问题是如何合理地比较蛋白质组之间的差别,即如何分析不同细胞或不同时刻之间各种蛋白质表达的相对丰度.因此建立一套稳定的参照系统和一套普通适合的测定度量是非常关键的.由此可见,定量测定是蛋白质组分析的一个核心技术问题. 分子生物学和基因组学的发展均以简单生物系统作为突破口,蛋白质组研究也概莫能外.微生物体作为一种理想的生物材料,已被广泛地应用于这些研究中[3].对研究蛋白质组的分析技术而言,微生物具有以下突出的特点:a1微生物的基因组比较小,基因和细胞器结构相对简单,并且蛋白质修饰水平较为低下,因此微生物细胞蛋白质组所含的蛋白质数量比其他高级生物系统要少得多.b1微生物的培养条件可以严格地控制,因此可以在设计的实验条件下,观察微生物蛋白质组表达水平的变化;c1在微生物研究领域中,细胞学、分子生物学和基因组学已经积累了丰富的数据,这些构成了蛋白质组研究的坚实基础;d1微生物的实验周期短,取材简单、便宜.这些都是开发分析技术的理想条件. 蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别,而不在于测定其绝对浓度.根据蛋白质组分析的手段,定量方法可大致分为电泳定量法和色谱定量法;根据处理蛋白质方法不同,又可分为体外标记法(labeling i n vit ro)和体内标记法(labeling i n vivo). 1 体外标记的电泳定量法 这种定量法一般采用不同的蛋白质显色剂,将电泳分离的蛋白质染成可被肉眼或机器识别的斑点,然后运用图像分析软件定量比较斑点的吸光度差别. 111 直接染色比较法 虽然双向电泳(two2dimensional electrophoresis, 2DE)并非一种理想的定量分析系统,但是它可以直观地反映蛋白质表达的差异.考马斯亮蓝染色法和银染法是两个普遍使用的染色方法.考马斯亮蓝染色的敏感性较差(约100ng),银染的敏感性虽然较高(1～10ng),但它的浓度动力学范围较窄.因此这两种方法不适合于相对严格的定量分析比较.目前公认的理想方法是荧光染色,最常用的是Molecular Probe公司生产的SyPro Ruby.这种试剂在敏感性(100fmol)和动力学方面(103)都基本可以满足蛋白质组定量分析的要求[4].传统的以双向电泳(2DE)为基础的差异蛋白组分析分为 3通讯联系人. Tel:010*********,E2mail:siqiliu@https://www.doczj.com/doc/3485690.html, 收稿日期:2002212210,接受日期:2003201228
问:基因组学、转录组学、蛋白质组学、结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学研究有哪些特点? 答:人类基因组计划完成后生物科学进入了人类后基因组时代,即大规模开展基因组生物学功能研究和应用研究的时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。以功能基因组学为代表的后基因组时代主要为利用基因组学提供的信息。 基因组研究应该包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段,以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段,是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能,它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。 功能基因组学(functional genomics又往往被称为后基因组学(postgenomics,它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。 基因的功能包括:生物学功能,如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰;细胞学功能,如参与细胞间和细胞内信号传递途径;发育上功能,如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交,差示筛选,cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等,但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生,包括基因表达的系统分析,cDNA微阵列,DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异,因此需要建立模式生物体。 功能基因组学
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2. 生物质谱技术
定量蛋白质组学操作步骤 1试剂配制 裂解缓冲液：8M 尿素，PBS缓冲体系, pH8左右, 1 mM PMSF, 1 mM蛋白酶抑制剂cocktail BCA试剂盒用于测定蛋白浓度，平行测定三次 胰蛋白酶（1 μg/μL，Promega质谱级） 二硫苏糖醇（1M，用超纯水配制），碘乙酰胺（1M，用超纯水配制），三氟乙酸，乙腈 注意： 裂解缓冲液必须要有缓冲体系（PBS或者Tris-HCl），防止蛋白聚沉； 8M尿素配制好后，避免长时间放置于室温，可存放在-20°或者现配先用。 2 蛋白提取 （1）向细胞或者研磨好的组织中加入裂解缓冲液，PMSF用时现加，充分混匀；（2）超声裂解细胞及核酸，至溶液没有粘稠感，比较澄清； （3）于4°条件下以12000 rpm离心20-30 min，取上清； （4）用BCA试剂盒测定蛋白浓度，适当稀释蛋白，使得测定的浓度在标准曲线的线性范围之内，最终原始蛋白浓度应该在1 mg/mL以上； （5）取100-200 μg蛋白用于溶液内酶解。 3 溶液内酶解 （1）将100-200 μg蛋白的体积，用含8M尿素的PBS将浓度调至1 mg/mL，即最终体积在100 μL-200 μL； （2）加入一定量的二硫苏糖醇，终浓度为5 mM，室温放置1 h； （3）加入一定量的碘乙酰胺，终浓度为12.5 mM，避光室温放置30 min以上；（4）将样品从黑暗环境中取出，室温不避光放置5-10 min，终止碘乙酰胺的反应； （5）缓慢的向样品中注入5倍体积的PBS，将尿素浓度稀释至1.5 M以下；（6）按照蛋白：胰蛋白酶=100:1的比例，加入胰蛋白酶酶，混匀后放置于37°，12-16 h； （7）2000×g离心，10 min，取上清； （8）加入0.4%的TFA，将pH调至2以下； （9）用Sep-Pak柱子（Waters）除盐； （10）干燥除盐后的样品。 注意： 蛋白浓度不宜过大，否则后续处理中蛋白容易聚沉； 一定要用含8M尿素的PBS调节蛋白浓度，并且该缓冲液中不用加入任何蛋白酶抑制剂，否则容易影响胰蛋白酶的酶解效率； 二硫苏糖醇和碘乙酰胺的浓度不宜过大，加入的二硫苏糖醇和碘乙酰胺的体积应该不会样品的最终体积； 加入胰蛋白酶前的稀释步骤，一定要缓慢加入PBS，否则容易沉淀，并且，在稀释时，有少许沉淀，不用离心，经过过夜的酶解，胰蛋白酶会将沉淀酶解成肽段；如果在稀释后有沉淀并且高速离心，会导致蛋白量受损，而且胰蛋白酶无法将这
质谱蛋白质组学在微生物鉴定中的应用 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2007-08-08| 字体： [大 中 小] 质谱蛋白质组学在微生物鉴定中的应用 微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，自20世纪80～90年代以来，微生物鉴定系统不断发展，自动化程度不断提高，但也是建立在传统的生理生化和基因基础上。无论是微生物鉴定的传统技术还是基于传统的生理生化和基因基础上的自动化仪器技术，它们均需要经过培养繁殖、分离纯化等步骤，然后再根据表型和基因型来进行鉴定，但是由于微生物群落及其生存环境的复杂性，目前自然界中只有极少部分微生物能够在实验室中培养，这严重阻碍了对微生物验明身份即鉴定的研究，也严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。 虽然随着越来越多的致病微生物和模式微生物基因组全序列测定的完成，基于基因组学的技术也应用于微生物的鉴定系统，但要想通过基因序列，按传统的方法彻底研究海量数据的微生物基因的产物仍非易事，从已经完成测序的一些微生物来看，有许多开放读码框架（ORF ）无法确定其功能，人们意识到有必要重新回到蛋白质的水平上来研究微生物，这就需要有一种高灵敏度高通量的大规模蛋白质研究手段，于是微生物蛋白质组研究应运而生。作为蛋白质组支柱技术的MALDI-TOF-MS 得到了极大的发展，尤其是为微生物鉴定研发的CLINPROTTM 中的MALDIBioTyper 系统一经推出，就受到微生物鉴定和分类领域热烈的迎取，在这方面表现突出的当属德国微生物菌种保藏中心（DSMZ ）。BioTyper 除了被DSMZ 用于微生物鉴定和分类的研究外，还被用于微生物种质的质控以及不同微生物系统发生的研究。下面将这种崭新的快速、方便、经济的鉴定微生物菌株的新一代技术作一概述。 基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定和分类中的应用概述 基于质谱的蛋白质组学技术MALDIBioTyper 系统在微生物鉴定和分类的应用，可完成三个方面的工作：①对于一系列已知微生物，可获得MALDI-TOFMS 数据库，即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；②对于未知微生物，则制备未鉴定微生物样品，利用MALDI-TOFMS 获得质谱数据，再采用提供的软件包，将获得的质谱数据与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，以鉴定具有相同或相似质谱数据的已知微生物，再建立未知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；③采用提供的软件包工具， 可以利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质
请简述蛋白质组学研究的基本步骤 1.蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备是蛋白质组学研究的首要环节，也是最为重要的部分。蛋白质样品的质量直接影响到科学研究的真实性和可信度。 2.蛋白质的分离：双向凝胶电泳技术是目前最基础和常用的蛋白质分离方法，它能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。双向电泳分为等电聚焦电泳和SDS-PAGE两个步骤，即先进行等电聚焦电泳，按照pI的不同将蛋白分离，然后再进行SDS-PAGE按照分子量的大小不同对蛋白进行分离。IPG胶条的应用，大大提高了双向电泳的重复性。 3. 蛋白质双向电泳凝胶的染色。目前双向电泳凝胶的染色的方法有3种，分别为考马斯亮蓝染色法、银染法和荧光染色法。考马斯亮蓝染色法，操作简便，无毒性，染色后的背景及对比度良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容，但灵敏度较低，可以检测到30～100 ng蛋白质。银染法是一种较为流行的染色方法，银染成本较低，灵敏度高，可检测少到2～5ng的蛋白。荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，与质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，但线性范围要远高于银染，这使二维电泳分离蛋白质的荧光检测受到普遍关注和应用。 4.双向电泳凝胶图像的采集与分析：图像采集系统通过投射扫描根据吸光度的大小获碍蛋白质点的光密度信息。一般来说，该光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，以便于软件分析时的定量比较。完成图像采集后采用ImageMaster等图像分析软件进行分析。分析步骤：蛋白质点检测、背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配。 5.蛋白质鉴定：蛋白质鉴定是蛋白质组学研究中的核心内容。目前蛋白质鉴定技术主要有Edman 降解法测序、质谱。质谱是目前最常用的蛋白质鉴定方法。质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷之比质荷比( m/z) 的不同而变化，可以据此来判断粒子的质量和特性。质谱完成后利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。
【摘要】基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍功能基因组学和蛋白质组学的科学背景、概念及其应用。 【关键词】基因组；功能基因组学；蛋白质组学； 一、基因组及基因组学的概念 基因组(genome)一词系由德国汉堡大学H．威克勒教授于1920年首创，用以表示真核生物从其亲代所继承的单套染色体，或称染色体组。更准确地说，基因组是指生物的整套染色体所含有的全部DNA序列。由于在真核细胞的线粒体和植物的叶绿体中也发现存在遗传物质，因此又将线粒体或叶绿体所携带的遗传物质称为线粒体基因组或叶绿体基因组。原核生物基因组则包括细胞内的染色体和质粒DNA。此外非独立生命形态的病毒颗粒也携带遗传物质，称为病毒基因组。所有生命都具有指令其生长与发育，维持其结构与功能所必需的遗传信息，本书中将生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和称为基因组。[1] 基因组学(genomic)一词系由T．罗德里克(T．Roderick)于1986年首创，用于概括涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学学科分支，并已用来命名一个学术刊物Genomics。基因组学是伴随人类基因组计划的实施而形成的一个全新的生命科学领域。[1] 基因组学与传统遗传学其他学科的差别在于，基因组学是在全基因组范围研究基因的结构、组成、功能及其进化，因而涉及大范围高通量收集和分析有关基因组DNA的序列组成，染色体分子水平的结构特征，全基因组的基因数目、功能和分类，基因组水平的基因表达与调控以及不同物种之间基因组的进化关系。基因组学的研究方法、技术和路线有许多不同于传统遗传学的特点，各相关领域的研究仍处于迅速发展和不断完善的过程中。 基因组学的主要工具和方法包括：生物信息学，遗传分析，基因表达测量和基因功能鉴定。 二、功能基因组学的概念及应用
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。