碱性蛋白质活性胶的配置
Shmily2012逍遥居士
各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性，人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。
从某种意义上来讲，碱性蛋白质也就是其等电点大于7.0，在碱性范围内。
所以，碱性蛋白质活性胶电泳，我们应该用酸性缓冲液的活性胶，因为在酸性缓冲液下，碱性蛋白质带正电荷，从电泳槽的阳极向阴极移动。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
碱性蛋白质活性胶即酸性缓冲液的活性胶---低pH的缓冲液系统。
配方如下：
β-Ala NH2CH2CH2COOH=89.09
甲基绿Methyl Green分子式：C27H35Cl4N3Zn分子量：608.78
酸性非变性电泳工作液配制：
40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）
4×分离胶Buf(pH4.3,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH,以HAc调pH至4.3，Milli-Q 定容至100ml。
4×堆积胶Buf(pH6.8,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH,以HAc调pH至6.8，Milli-Q 定容至100ml。
5×电泳Buf（pH4.4,β-Ala-H Ac）：35.64gβ-Ala，以HAc调pH至4.4，dH2O定容至1L。即0.4M的丙氨酸缓冲液，1×buffer的为0.08M。
2×甲基绿上样Buffer：1ml1×（pH4.4,β-Ala-HAc）电泳缓冲液，3ml甘油，1ml0.4g/L 甲基绿，5ml dH2O；-20℃贮存。即：2×甲基绿上样buffer：1ml1×（pH4.4，β-Ala-HCl）电泳缓冲液，3ml甘油，0.4mg甲基绿，6mlH2O；-20℃保存。
10％APS
0.25％考马斯亮蓝染色液：Coomassie blue R-2502.5g，甲醇450ml，HAc100ml,dH2O
450ml
考马斯亮蓝脱色液：100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
电泳胶的配制及电泳条件（酸性电泳注意要反转电极，即上槽电极为正，下槽电极为负）：
酸性非变性胶17%分离胶(10ml)4%堆积胶(5ml)
40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml0.5ml
4×分离胶Buf(pH4.3,0.24M KOH-HAc) 2.5ml
4×堆积胶Buf(pH6.8,0.24M KOH-HAc) 1.25ml
水 3.15ml 3.15ml
10％APS75ul75ul
TEMED25ul25ul
5×电泳Buf（pH4.4,β-Ala-HAc）200ml稀释到1L
各缓冲液的终浓度：
分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7%T，2.67%C）；
堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125%T，2.5%C）；
电泳缓冲液：0.14M2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5？浓度可能影响不大。
将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂
电泳条件：反转电极，100V恒压约15min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约60min。
染色和脱色：取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。
双向凝胶电泳（2-DE） 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。 分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。 其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。 蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及最近发现的蛋白质自剪接等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。 双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。 双向电泳操作方法 1蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚
实验二SDS－PAGE 蛋白电泳分析 一、目的 掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法 二、电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 三、试剂配制 1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。 2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。 1.5M：Tris 碱18.15g 去离子水80ml 浓盐酸调PH 值8.8 加去离子水定容至100ml 3．1 M DTT：称取3.09 g DTT，加入到50 ml 塑料离心管内，加20 ml 的0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。 4．10% SDS: 20g SDS 溶于200ml 纯水中。
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
尿素－SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．试剂的配制 ①30%凝胶母液 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29.2 %（w/v）丙烯酰胺和0.8 %（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。 小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 ②4倍SDS分离胶缓冲液(4×, pH 8.8) (200 ml) 称取SDS 0.8 g (4%)，Tris 36.342 g (1.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为8.8，定容至200 mL。 ③4倍SDS浓缩胶（堆积胶或积层胶）缓冲液。(4×，pH 6.8)（100 ml） 称取SDS 0.4 g (4%)，Tris 6.051 g (0.5mol/L)，溶解（必要时加热），用盐酸调pH为6.8，定容至100 mL。 ④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。 TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤10%过硫酸铵。 0.5 g过硫酸铵溶于5 mL去离子水中，可于4 ℃下存放数月 ⑥Tris-甘氨酸电极缓冲液（1 L） 称取3g Tris （25 mmol/L）,14.4 g甘氨酸(192 mmol/L),1 g SDS（0.1 %），溶解后定容至1L，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液在室温下长期保存。 ⑦样品处理液（5×样品缓冲液）（10 mL） 称取Tris 0.07266 g Tris (60 mmol/L), SDS 0.02 g (2%, W/V), 溶于4 mL水中, 用HCl小心调节pH为6.8,再加5 mL 50%的甘油(终浓度25%, V/V)，0.5 mL 2-巯基乙醇(14.4 mmol/L)，溴酚蓝0.01 g (终浓度0.1%), 加去离子水至10 mL。可以在4℃下存放数周，或在－20℃下保存数月。 ⑧考马斯亮蓝R250染色液（1000 mL） 0.1% 考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝R-250 1.0 g （0.1%, W/V） 无水乙醇450 mL (45%, V/V) 冰醋酸100 mL (10%, V/V) 加水定容至1000 mL
ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031) 摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China) Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.doczj.com/doc/335207432.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.doczj.com/doc/335207432.html,
血清蛋白电泳 一．项目名称 血清蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEIN） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三．方法学原理 蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段：白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白，每一区带含有一种或多种血清蛋白质。 四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一，可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约162个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约半小时 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：70测试/150测试/300测试 （3）货号：PN4100/ PN4120/ PN4140 2．脱色液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 10×100ml （3）货号：PN4540 (4) 成分：柠檬酸
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，使用方法差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。因此实验前应进行充分调查研究，查阅有关文献资料，对欲分离提纯物质的物理、化学及生物学性质先有一定了解，然后
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用 一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。 二、关键参数 分辨率和可重复性。目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。 灵敏度。双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。三、蛋白质组研究的主要困难 对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。 四、蛋白质的翻译后修饰和加工 指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上
SDS－PAGE 蛋白电泳分析 一、目的 掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法 二、电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。 三、试剂配制 1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。 1.5M：Tris 碱18.15g 去离子水80ml 浓盐酸调PH 值8.8 加去离子水定容至100ml 3．1 M DTT：称取3.09 g DTT，加入到50 ml 塑料离心管内，加20 ml 的0.01 M NaOAc （pH5.2)，溶解后使用0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。 4．10% SDS: 20g SDS 溶于200ml 纯水中。 5．10% 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于10ml 纯水中，现用现配。 6．2×SDS 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油40ml，0.2g 溴芬蓝，定容至100ml。 7．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3g Tris 碱和18.8g 甘氨酸，加入10ml 10%SDS，用去离子水补至100ml，配制成10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液；取50ml 10×缓冲液，稀释至500ml，配制成工作浓度1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 8．考马斯亮蓝R250 染色液：1gR250 溶于250ml 异丙醇、100ml 冰乙酸和650ml 去离子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。 9．脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为50ml,850ml 和100ml。 四、实验方法 1．10%分离胶的配制7ml(小板为5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待凝固。
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义 李 峰 师庆红 张晓静何成彦赵丽纯 1 郭宏华（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033） 〔摘 要〕目的 利用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质差异，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻 找新的靶点。方法①双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组；②二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与 癌旁组织的差异蛋白质组。结果在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中两种技术路线有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表 达上调的有7个，表达下调的有6个。结论 两种技术路线共同鉴定出的差异蛋白质是有意义的，对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依 据和方向。 〔关键词〕双向凝胶电泳；二维色谱技术；质谱；大肠癌；蛋白质组学〔中图分类号〕R735 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0497-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.026 基金项目：吉林省科技厅资助项目（No.20100742， 200705387，20050702-4，20090461） 1 吉林大学药学院 通讯作者：郭宏华（1964-），女，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要 从事消化道肿瘤的发病机制及治疗研究。 第一作者：李 峰（1979-），女，在读硕士，主要从事肿瘤分子生物学研 究。 大肠癌（colon cancer ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率在世界范围内居各种肿瘤的第三位，在西方居第二位，并且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势 〔1，2〕 。大肠癌的发生和发 展受到基因和环境等多种因素的影响，其病理机制复杂，从单一的基因突变和分子通道的变化难以全面理解大肠癌的发生机制。蛋白质组学是近年来发展起来的新兴学科，已经广泛应 用于肿瘤研究的诸多方面。本文拟采用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质的差异性，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。1材料与方法1.1 组织标本 收集吉林大学中日联谊医院手术治疗的大肠 癌患者18例，年龄49 78岁，其中男13人，女5人。在手术中获得的癌组织均是新鲜标本。所获得的癌旁正常组织均距离癌边缘10cm 之外、切缘正常组织，并且所取的正常组织标本均是在癌组织上端。标本离体后立即取材，生理盐水冲洗，放入液氮冷冻， －80?保存。病人术前未接受任何治疗。取部分组织标本进行石蜡包埋、切片、HE 常规染色，病理学检查证实组织类型，均是Dukes B 腺癌 。
匀浆： 1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。 2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。 3.所有操作尽量在冰上进行。 4.94℃水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事 先要打开升温）。 5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。 6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。 7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到 4℃，即可。 8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。 9.SDS,DDT,PMSF是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。制胶： 10.APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。 11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。 12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。） 13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm的玻璃板用白色条带封底。（封紧以防 漏胶） 14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。 15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。一般要 5-10分钟。而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。 16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。（点在边上时，跑出的带是斜的） 17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。 18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。 19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下） 20.脱色时，尽量多次进行换水。 21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl. 22.做胶时，凝胶时间控制在25min。梳子不能歪来歪去。 23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 第一部知识准备 一、双向凝胶电泳 蛋白质组分析的先决条件是蛋白质的分离。分离过程一般可以分为2步，首先将蛋白质消化成肽段，通常由蛋白水解酶完成，然后将复杂的混合物分离成简单地形式。这2步没有明确的先后关系，也可先将蛋白质混合体分离成单个的蛋白质或肽段，然后消化分析。双向凝胶电泳是采取的先分离后消化的方法，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离数千乃至数万个蛋白质的方法，是当今蛋白质组学方法的主流。刚刚兴起的非胶系统蛋白质组学是先消化然后直接质谱分析，充分应用生物信息学方法，是蛋白质组学分离方法的一个发展方向。 (一)双向电泳简介 双向电泳技术建立于20世纪70年代，它的基本原理是首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度介质中等电聚焦（isoelectrofocusing,IEF）将其分离，然后按照其分子量大小在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）进行分离。 目前，根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）、不平衡的pH梯度凝胶电泳（NEPHGE）、固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）。在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度。其主要缺点是在碱性区域不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质；优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于展开工作。各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，利用这一系统可以分辨10000个蛋白质斑点。NEPHGE为非平衡pH梯度电泳，是IPG胶发明之前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电点等电聚焦场中大道平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。在IPG-DALT是现在主要和常用的方法，它的优势表现在：pH梯度稳定、梯度分辨率高；无阴极漂移及碱性蛋白质丢失现象；蛋白质上样量大，可以提高低丰度蛋白质成分的分辨效果；样品中盐的干扰少，无边缘效应；pH梯度和分离效果的重复性好。