免疫组织化学技术（immunohistochemistry）
由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围
（一） 免疫组织化学技术的基本原理
免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。
（二）免疫组织化学技术的应用范围
近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是自70年代中期杂交瘤技术与单克隆抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。目前主要应用在如下几个方面：
1确定细胞类型
通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚显示其形态。
2辨认细胞产物
利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。
3了解分化程度
大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。
4鉴定病变性质
通过标记Ig轻链（κ、λ）可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反应性增生，前者常表达单一的Ig轻链（κ+/λ+），后者常为多克隆Ig轻链（κ+、λ+）。而标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白，而套细胞则表达。
5发现微小转移灶
某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。
6探讨肿瘤起源或分化表型
一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。
7确定肿瘤分期
判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。
8指导预后和治疗
免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：①类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。③细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体（EGFR）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、 PCNA 、EGFR阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。
9辅助疾病诊断和分类
人体的免疫性疾病，主要是自身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。
10 寻找感染病因
人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部
位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。
二、 免疫组织化学技术细节处理总论
（一）标本的处理——细节注意
标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存良好，抗原物质的抗原不丢失，不扩散或被破坏。标本的处理过程中应该注意以下两个方面：取材、固定。
1取材
细胞标本取材可有印片法、穿刺吸取涂片法、体积沉淀涂片法、培养细胞标本取材及离心涂片机法。
1.1 印片法
主要应用于活检组织标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落细胞便粘附于玻片上，立即浸入细胞固定液内5~10分钟，取出后自然干燥，低温保存备用。
1.2穿刺吸取涂片法
主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细胞针穿刺吸取病变区内液体成分，可直接涂抹在玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法，即将穿刺液滴入盛有1~2ml Hank（或RPMI-1640）液的试管内，轻轻搅拌，以
500r/min低速离心5~10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（1×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹或用离心涂片机制成涂片，待涂片略干即可固定。
1.3体积沉淀涂片法
主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上；②细胞数量少者，可将液体沉淀，然后取沉淀液以1500r/min离心10min，弃上清，将细胞涂片或用离心涂片制成涂片，略干后固定备用。
1.4培养细胞标本取材
根据培养细胞特性分别采用不同的方法。对某些贴壁生长的细胞，只需将载玻片插入培养瓶内即可制备理想的细胞标本。而对于浮悬培养的细胞，可用离心涂片机制成涂片。
1.5离心涂片机法
将待涂片的细胞样品成2×105~6/ml的细胞悬液，吸取50～100μl加入涂片机内，1000r/min 离心2min后细胞就均匀地分布于玻片上。
制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤后，细胞黏附性降低，在免疫染色过程中易脱落，因此，在制片前载玻片上应涂黏附剂；②为节省试剂和便于观察，应将细胞集中在
0.6~1cm2的圆圈内，细胞总数以105个为宜；③黏液丰富的标本，如痰液、胃液，未经特殊处理，一般不宜作免疫组织化学染色。
组织标本的取材常受各种因素的影响，应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位主要是病变区，但必须取病灶与正常组织交界区；③必要时取远距病灶区的正常组织作对照；④为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片，也可贮于液氮或-70℃保存。
2 固定
固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。首先，通过固定可使细胞内蛋白质凝固，防止细胞内酶反应过程，防止细胞自溶，保持细胞固有形态和结构；其次，通过固定可以保存组织细胞的抗原性。固定不足，抗原会丢失；固定过度，则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。
2.1 固定液的选择
固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲多聚甲醛（或福尔马林）液是适应性较为广泛的固定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。
2.2 固定时间因固定液而异
组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2.3 固定方法的选择
常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。
2.4 固定时应注意
力求保持组织新鲜，勿使其干燥；组织块不宜过大过厚，以体积<2cm×1.5cm×0.3cm为宜，组织块厚度必须控制在0.3cm以内；固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；组织固定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。
（二）切片方法-细节注意
1 切片方法的选择
光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片
是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多，对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内， 进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
1.2 石蜡切片
用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应＜2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡；浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好。组织块脱水、透明和浸蜡时间可参考下表：
表1 组织块处理时间
1 70%乙醇 4℃ 3-4h
2 80%乙醇 4℃ 3-4h
3 90%乙醇 4℃ 2-3h
4 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2-3h
5 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1-2h
6 100%乙醇Ⅰ 4℃ 1.5h
7 100%乙醇Ⅱ 4℃ 1.5h
8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5-1h
9 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5-1h
10 石蜡Ⅰ 60℃ 1h
11 石蜡Ⅱ 60℃ 2h
目前我校形态学部配备有全套自动脱水仪，一系列过程都可实现自动化，有意要做石蜡切片的同学可与王亚琴老师联系。
除上述两种切片方法外，还有振动切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等方法。振动切片主要适用于免疫电镜观察，塑料切片的优点是可以同时作光镜和电镜检测，超薄切片用于电镜标本的制作，碳蜡切片操作简便省时、抗原性保存比石蜡切片好且组织结构清晰，但夏季切片困难。由于后四种切片技术在免疫组织化学技术应用不是很多，所以对其切片的细节注意事项这里不作详细论述。
2 组织切片玻片的处理
2.1 载玻片和盖玻片的清洁
新的玻片上有油污，要用清洁液浸泡12-24小时，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗5遍以上，浸泡在95%-100%乙醇内2小时，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干即可。
2.2 载玻片涂黏附剂
为防止因冲洗频繁，致切片脱落，清洗干净的玻片上应均匀地涂一层薄薄的黏附剂。所使用的黏附剂应定期更换成或新鲜配制，以确保合乎要求的黏附度。常用的黏附剂有：树脂胶、铬明矾明胶、多聚赖氨酸、甘油明胶、甲醛明胶、APES等。下面具体介绍三种最常用黏附剂的使用注意事项及其优缺点。
2.2.1 Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸)一般采用分子量30000左右的0.5%多聚赖氨酸最好，也可用试剂公司出售的其浓溶液以1：10去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在60℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检
测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。
2.2.2 明胶硫酸铬钾法 将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2 min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。
2.2.3 APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)此法必须现用现配。将洗净玻片入1:50丙酮稀释的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的APES晾干即可。用此方法
粘合的玻片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。
三、 免疫组织化学技术细节处理各论
（一）免疫荧光细胞组织化学技术-细节注意
1 荧光显微镜标本制作要求
1.1 载玻片 必须光洁，厚度均匀（0.8-1.2mm），无明显自发荧光。
1.2 盖玻片 光洁，厚度在0.17mm左右。
1.3 封固剂 必须无自发荧光，无色透明，常用甘油和0.5mol/L PH9.0-9.5碳酸盐缓冲液的等量混合液作封固剂。
1.4 标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部未充分激发。另外，细胞、组织重叠或杂质掩盖影响判断。
1.5 镜油 一般暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可以用缓冲甘油代替。液体石蜡也可用，但折光率较低，对图象质量略有影响。 2荧光染色注意事项
2.1 染色反应最好在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥，造成非特异性染色。
2.2 染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜（PH7.4左右），因此，切片冲洗液及抗体稀释 液均应注意酸碱度的调整。
2.3 组织细胞要求新鲜，因此冰冻切片是免疫荧光染色的首选方法，同时注意避免切片折叠 或杂质过多，以免影响荧光的观察。
2.4 切片经染色后，应及时观察并照相，不宜长期保存，以免褪色。切片在4℃冰箱内过
夜，其荧光强度将减弱约30%。
2.5 抗体稀释度以获得最佳染色效果，背景非特异性染色最小为标准，因此对每一批抗体必 须试验摸索，找出最佳稀释浓度。
2.6 为防止抗体效果下降，所购抗体应及早试验，并应尽量减少抗体溶液的冻溶次数。
2.7 若非特异性染色过强时，在染色反应前应先将荧光抗体离心，去除沉淀物后再使用。
3使用荧光显微镜注意事项
检查时间以每次1-2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本 受紫外线照射15min后，荧光也明显减弱。所以最多不得超过2-3h。
（二）免疫酶细胞组织化学技术
免疫酶细胞组织化学技术与免疫荧光技术相近，所不同的是利用酶标抗体与组织抗原结合后，形成有色沉淀再观察。但与免疫荧光技术相比，该法终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，反复观察，适合于镜下半定量分析，DAB终产物具有嗜锇酸性，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。技术细节同上述总论中所介绍。
（三）亲合组织化学技术-细节注意
亲合组织化学技术引入免疫细胞化学后使其敏感性进一步提高，更利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的检测。目前已经建立的方法有ABC法、LAB法、BRAB法、SPA-HRP法、凝集素法等。这些方法的共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的。这里仅介绍最为常用及多见的ABC法。
ABC法即抗生物素-生物素-过氧化物酶法。ABC法是Hsu等于1981年在BRAB法和LAB法的基础上改良的。其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。ABC法的优点是：敏感性强，特异性强，背景染色淡，方法简单，节约时间，并且由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。
ABC法实验注意事项：
1 内源性生物素活性及其清除
某些组织和细胞内存在着内源性生物素，在应用该染色方法时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织，如肝、肾、白细胞、脂肪组织、乳腺等，在进行ABC染色前应预先以0.01%的抗生素和0.01%的生物素溶液分别作用20min，以消除其内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBC洗5分钟。必要时，也可用0.3%H2O2-甲醇液孵育以消除内源性过氧化物酶活性。
2生物素制剂之间相互亲和性差异很大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家批号，对购买 试剂应进行事先预测，以保证实验结果的稳定性。
3 ABC试剂保存以4℃为佳，据报告保存可达两年之久；而在-20℃生物活性在短期内即被破坏。
四、免疫组织化学技术试剂购买及其保存
（一） 免疫组织化学技术试剂正确选择、购买及使用
1 一抗的正确选择与使用
1.1 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。
1.2 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。
1.3 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但由于供应商质检所用组织不同，实验条件和操作人为误差，常常需要客户自己再重新选择比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始作倍比稀释。
2二抗的正确选择与使用
2.1 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠源性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前，美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒，即一抗来源于小鼠，该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封闭内源性小鼠Ig的封闭液，可以得到清晰的染色背景。
2.2 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1，可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。
2.3 正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般供应商提供稀释比例从1：10稀释度始，作5倍比稀释。
3检测系统的正确选择
检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统：亲和素-生物素放大系统很常用，但由于内源性亲和素和生物素广泛存在，经典的SP、SRABC和LSAB法等常出现背景着色，尤其是内源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。Zymed公司研发的非生物素放大试剂盒NAB和Picture Plus试剂盒，采用多聚氨基酸支架偶联多个抗体和酶、荧光素等信号检测分子起到
良好的放大效果，具有高敏、背景清晰等优点。对于啮齿动物组织的免疫化学检测：由于啮齿动物非特异性结合强，最好选用美国Vector公司和Zymed公司都有开发的用小鼠抗体检测小鼠组织的试剂盒。
购买时要求试剂公司提供标准化的试剂，并附详细的试剂说明书，例如抗体的说明书应包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等。经广泛的文献查阅及与使用者的多次交流，这里特别推荐Sigma公司，Santa Cruz公司，北京中山生物技术有限公司，武汉博士德生物工程有限公司，福州迈新生物技术有限公司。
(二)试剂保存
1 抗体试剂保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间。酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。抗体浓缩液应在-20℃保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，－20℃保存，避免反复冻融；融解后抗体于2－8℃可以保存一个月。稀释的抗体不能长时间保存，在4℃下可存放1-3天，超过7天效价显著降低。用作抗体的稀释液，在夏天温度很高时，最好加入少许防腐剂如叠氮钠、柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生霉菌。
2 试剂盒保存
完整试剂盒未打开前于2－8℃可以保存一年，打开后，应根据说明书要求对具体试剂进行适当存放。一般标准品应放置－20℃，用不完的抗体试剂应小量分装－20℃保存。
综上，由于免疫组织化学技术的高特异性、高敏感性，集形态、功能、代谢与一体，及其操作简单、试剂来源稳定、价格适中等特点，都使得其广泛地应用于生物医学研究及临床病理诊断中。我们也有理由相信，随着更多新技术的涌入及改善，这门新型的技术将发挥越来越巨大的作用。
免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题 库2-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列标记可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤的是（） A.CK B.calretinin C.LCA D.CgA E.CD68 CK为上皮性标志物；calretinin为间皮细胞肿瘤标志；CgA为神经内分泌标志物；CD68为组织细胞标志物。LCA为淋巴细胞标志物，因此可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]AFP为下列哪种肿瘤的标记物？（） A.宫内膜癌 B.黑色素细胞瘤 C.肝细胞癌 D.乳腺癌 E.鼻咽癌 AFP为肝细胞癌和内胚窦瘤的标志物；HMB45和S-100为黑色素细胞的标志物；ER和PR为乳腺癌和子宫内膜癌的分化标志物。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于小圆细胞肿瘤的描述，下列错误的是（） A.是一类细胞形态为小圆形的细胞 B.常规诊断基本可以明确诊断 C.免疫组化诊断胚胎性横纹肌肉瘤首选Desmin D.原始间叶性肿瘤诊断困难，可采取排除法 E.免疫组化诊断尤因肉瘤首选CD99 小圆细胞恶性肿瘤是病理学从镜下形态的分类，不能说明肿瘤的组织来源，需要免疫组化进一步诊断。 (吉林快3 https://www.doczj.com/doc/304725189.html,)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列免疫组化结果有助于诊断皮肤Merkel瘤的是（）。 A.Vimentin（+），CK（+），NSE（-） B.Vimentin（-），CK（-），NSE（+） C.Vimentin（-），CK（+），NSE（-） D.Vimentin（-），CK（+），NSE（+） E.Vimentin（+），CK（-），NSE（+） 皮肤Merkel瘤可同时表达CK、NSE，而Vimentin常呈阴性反应。
免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基本要求 2013-01-04 01:48 免疫组织化学抗体试剂及检测试剂是指一类利用免疫学原理结合酶催化底物显色的化学方法，检测组织标本中抗原的检测试剂。此类试剂为待测抗原特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒。该类产品检测项目繁多，应用广泛，检测过程为多步骤检测，影响因素多，在临床上主要用于检测细胞的特异性抗原以确定细胞的表型。该类产品的预期用途与诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药相关，按照三类体外诊断试剂管理。 基于该类产品临床应用的重要性及特殊性，根据目前注册申报工作的需要、依据《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》、《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》以及《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的相关规定，结合临床及病理检测中的应用实践、临床病理专家和生产企业的建议，现对免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料提出以下基本要求（对于本要求未提及的部分，申请人均应依据相关法规要求提交注册申报资料）。 本《要求》是在目前科学技术认识水平及现阶段免疫组化类产品技术审评基础上形成的，审评人员会密切关注相关技术的最新进展，随着认识的提高将适时调整。由于该类产品种类繁多，《基本要求》不能涵盖所有该类产品的特殊情况，如某些要求不适用，申请人也可采用其他方式证明产品的技术性能，建议申请人对此进行详细说明，并
提交相应的性能验证资料。 依据免疫组化不同标志物的临床应用情况，将其分为二个大类：A类：Her2/Neu、ER、PR、ALK、CD117、c-met、CD20、EGFR等与临床治疗、用药密切相关的标志物；其他全新标记物，具有新的临床意义。 B类：临床使用多个指标综合诊治的标志物之一，与辅助诊断、鉴别诊断、病情监测、预后相关标志物：如：Ki67、CK5/6等。 一、产品说明书 1. 【产品名称】：单独的第一抗体试剂通用名称建议采取以下命名方式：待测抗原特异性抗体+试剂（免疫组织化学法）。抗体与显色系统、对照试剂、质控片及其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂盒通用名称建议采用以下命名方式：待测抗原+检测试剂盒（免疫组织化学法）。如：雌激素受体抗体试剂（免疫组织化学法）、孕酮受体检测试剂盒（免疫组织化学法）。 2. 【预期用途】：应明确检测的样本类型（冰冻和/或石蜡包埋等）；明确抗体的类型、克隆号、阳性着色特点；明确临床用途（诊断、鉴别诊断、预后判断、指导用药）；指明“对任何阳性或阴性结果的解读，应
免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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《酶组织化学与免疫组织化学技术》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术 一、选择题 （一）A1型题(标准型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D 1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.免疫染色 D.设立对照试验 E.结果判断 2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物 D.固定剂 E.洗涤液 3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是 A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。 D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950 B.1960 C.1970 D.1980 E.1990 5.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶 B.碱性磷酸酶 C.葡萄糖氧化酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.第四抗体 9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961
B.1975 C.1981 D.1985 E.1990 10.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4℃ B.20℃ C.40℃ D.37℃ E.50℃ 23．PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原 一、填空 1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素________、___酶_________ 、____生物素和亲和素_______、___________。原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。 2、常用的粘附剂有__________、____________ 、__________等。 3、抗原决定簇是指_____________分子表面的、具有活性的___________。 4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_____________，使其发生反应，形成_____________，能在显微镜下观察。常用于检测__________、____________ 、__________等。 5、酶组织化学是利用酶对其____________的催化作用，生成__________，再与某种__________反应，形成____________沉淀，检测___________分布及活性的方法。常用的方法有___________ 、___________、____________、__________和____________。 6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应PAS。 7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用________和________法。 8、免疫组化中最常用的制片方法是________和________。 9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_________、_________ 和_______。
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
病理学技术(主管技师)：免疫细胞化学技术考点 考试时间：120分钟 考试总分：100分 遵守考场纪律，维护知识尊严，杜绝违纪行为，确保考试结果公正。 1、单项选择题 与ABC 法有关的复合物是（ ）A.抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物 B.过氧化物酶-抗过氧化物酶 C.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶 D.链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物 E.抗体-亲和素-生物素过氧化物酶复合物 本题答案： 2、单项选择题 凝集素是指（ ）A.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞，因而得名 B.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的脂蛋白或 能与脂类结合的脂蛋白lE.以AS-MX 为底物、FB/FR 为发色剂时呈蓝色／红色 本题答案： 4、单项选择题 下列有关HRP 的描述，错误的是（ ）A.ICC 染色最为常用的醇 B.特异底物为AS-MX C.在酶反应部位呈棕褐色 D.常用戊二醛作为耦联剂 E.最适pH5～5.5 本题答案： 5、单项选择题 姓名：________________ 班级：________________ 学号：________________ --------------------密----------------------------------封 ----------------------------------------------线----------------------
EPOS法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法 本题答案： 6、单项选择题 免疫组织化学染色Envision法的原理是（）A.将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物中的亲和素替换为链亲和素，特异性更高 B.利用线状的葡聚糖分子与大量的AP或HRP酶结合，再将葡聚糖-酶复合物连接到第二抗体上，形成酶-葡聚糖-第二抗体复合物，灵敏度高 C.用AP取代PAP法的过氧化物酶而成，显色对比好 D.将游离酶和抗酶抗体制成稳定的酶-抗酶抗体复合物 E.通过复合物中亲和素的桥梁作用，将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物与生物素化的抗体结合在一起，达到检测抗原的目的 本题答案： 7、单项选择题 酶桥染色法中的桥抗体是指（）A.免疫反应系统中的特异性抗体 B.显色系统中的抗酶抗体 C.第二抗体 D.第一抗体 E.以上均不对 本题答案： 8、单项选择题 PAP-ABC法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法
个人免疫组化感悟（Jane） 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？ 这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37 度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。 相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。 免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。 如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。 我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。 失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。 如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过
目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)
1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。
免疫组织化学技术题 库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.doczj.com/doc/304725189.html,/)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。
全自动免疫组织化学染色快速诊断【免疫组织化学的现状和 应用】 【】R361 【】A 【】1672－3783(xx)08－0497－02 【摘要】：本文对免疫组化的优点作了简要介绍，同时介绍了其在病理诊断中的应用，有支持、鉴别诊断的作用，检测激素受体与生长因子，对预后及治疗产生重要意义。文中还叙说了免疫组化的结果对肿瘤细胞增生和分期具有评价作用，并对免疫组化应该注意的事项也逐一列举。 当免疫学的理论和技术进一步成熟发展后，就产生了免疫组织化学技术，将这一方法应用在病理诊断上就称为诊断免疫组织化学。在现代医学基础和临床研究中免疫组织化学对疾病尤其是对肿瘤的 诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。 （一）免疫组化的优点 （1）特异性强 免疫组化是利用抗原、抗体可以特异性结合，也就是“一对一”的结合的原理。 （2）敏感性高
现在免疫组化的ABC法、SP法的问世，抗体可以稀释成千上万倍甚至上亿倍，仍可发生抗原抗体的结合。 （3）定位精确 免疫组化的反应可在组织和细胞中进行，抗原实现了准确的定位观察，对于病理学的诊断和研究具有非常重要的意义。 （二）免疫组织化学的应用 （1）免疫组化对病理诊断具有支持和鉴别诊断的作用。 在病理诊断比较明确的情况下，应用组化标记可以起到支持诊断的作用。有时无法判断肿瘤时，组化的应用将起到极大的帮助，可以鉴别肿瘤的和性质。 （2）激素受体与生长因子的检测对预后及治疗具有十分重要的意义 激素受体的检测对于乳腺癌的研究已有了较明确的结论，雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性表达者，同时阳性表达者对内分泌治疗效果好，患者生存期延长。
免疫细胞化学技术题 库9-2-10
问题： [单选,A1型题]应用尚无文献报道的抗血清或自己制备的抗血清进行免疫酶组织细胞化学染色时，必须设置的对照是（） A.交叉实验 B.替代实验 C.吸收实验 D.置换实验 E.阳性对照
问题： [单选,A1型题]可引起免疫酶组织化学染色假阳性的是（） A.组织内待检抗原过多 B.内源性过氧化物酶丰富 C.洗液用TBS缓冲液 D.抗体浓度过低 E.抗体特异性高
问题： [单选,A1型题]免疫酶组织化学染色中过氧化氢液的作用是（） A.提高抗原抗体的识别能力 B.减少内源性过氧化酶的活性 C.修复抗原 D.提高敏感性 E.激活抗原 https://www.doczj.com/doc/304725189.html,/ 月子病
问题： [单选,A1型题]ABC法的基本原理是（） A.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第二抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 B.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第一抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 C.利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 D.利用抗生物素分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 E.利用抗地高辛分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原
问题： [单选,A1型题]BRAB法的基本原理是（） A.用生物素标记抗体，然后与生物素和酶形成复合物 B.用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来 C.用卵白素标记抗体，然后与卵白素和酶形成复合物 D.用卵白素分别标记抗体和酶，然后以抗卵白素为桥，把两者连接起来 E.用亲和素分别标记抗体和酶，然后以抗亲和素为桥，把两者连接起来
编号：１－２ 主题：免疫组化技术 概述： 免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 免疫组织化学染色方法分类： 1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。 2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。 目的： 对所研究的大分子如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等进行
定位，进而深入研究其功能。 原理： 1、免疫荧光方法 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。 2、免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 3、免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至
免疫组织化学技术 随着现代科学技术的迅速发展，病理诊断技术也在不断进步,其中免疫组织化学以其特异性强、灵敏度高等显著特点，克服了传统诊断方法的局限性和主观性，能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，此方法经不断改进和发展也日趋成熟，应用范围逐渐扩大。目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。 一．免疫组化技术的原理和优点 （一）免疫组化技术的基本原理 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 （二）免疫组织化学染色方法 按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。 按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（S P）法等，其中SP法是最常使用的方法。 （三）几种常用免疫组织化学方法的原理 1 免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以