一、实验目的：
观察小白鼠脊髓半横切之后的表现，加深对脊髓功能的认识。
二、实验原理：
脊髓是高位中枢与外周的感觉、运动功能联系的传导道。在正
常情况下痛觉、温度觉、部分触-压的传导路径先交叉再上行。
肌肉本体感觉和部分触-压觉传导路径先上行再交叉。脊髓损
伤时，外周血管平滑肌紧张性下降，血管扩张。
三、实验器材：
小白鼠、乙醚、蛙板、青霉素空瓶、药棉、手术缝针、丝线、
解剖刀、剪刀、眼科手术刀、镊子。
四、实验步骤：
1.用乙醚麻醉小白鼠；
2.把小白鼠俯卧和固定在改装了的蛙板上，剪去胸腰部背面的
毛，在正中处用解剖刀纵切皮肤，画一个1.5cm长的切口；
3.紧贴第1——3节腰椎的棘突，用解剖刀切断椎上的肌腱，并
用药棉分离肌肉，暴露椎骨；
4.用镊子夹住第二腰椎，另一手拿剪刀剪去棘突和椎弓，暴露白
色的脊髓；
5.在脊髓背面正中有一条纵向的血管，以此为标志，用眼科手术
刀将一半脊髓从中央向外侧完全切断，然后缝合皮肤；
6.松绑四肢，待其苏醒后进行下列观察小白鼠在实验桌上运动状
况，用镊子夹捏脊髓损伤一侧的后肢，然后用镊子夹捏脊髓未
损伤一侧的后肢。
五、实验结果：
当上述手术成功时，可观察到如下结果：
（1）小白鼠在运动时，与脊髓损伤同侧的后肢不能运动。
（2）用镊子夹捏不会运动的后肢时，小白鼠发出吱吱的叫声。（3）镊子夹捏脊髓未被损伤一侧的后肢，小白鼠却没有叫声。
以上结果说明：
（1）由大脑发出的运动指令到达脊髓后，通过脊髓白质的神经纤维继续向下传送，脊髓两侧的运动神经纤维大都在本侧里行走（即不交叉到对侧）。在脊髓被损伤的一侧，运动指令无法传到横切以下的部位，该侧后肢得不到运动指令，因而不能随意运动；脊髓未遭横切的一侧，大脑发出的运动指令，可以通过脊髓白质的神经纤维传到后肢肌肉，所以这一侧后肢运动如常。
（2）脊髓损伤一侧的后肢虽瘫痪，但皮肤的痛觉仍存在，这是由于脊髓内接受皮肤感觉信息的神经纤维是交叉到对侧（脊髓未被损伤一侧），然后问上传导到大脑，产生痛觉引起小白鼠鸣叫；同理，会运动一侧后肢的皮肤痛觉反应不存在，是由于传导痛觉信息的神经纤维交叉到脊髓被横切一侧，传导纤维被切断，痛觉信息无法上传到大脑，因而不产生痛觉反应。
六、注意事项：
（1）本实验成功的关键在于手术。首先麻醉要适度，麻醉过深小白鼠易死亡，过浅小白鼠易苏醒，会给手术带来不便。其次，用柳叶刀横切一侧脊髓时要防止损坏对侧脊髓。
（2）半横切部位必须在相当于第二腰椎的脊髓处，实验效果才好。
（3）手术中要防止出血过多，术后伤口应用丝线缝合，饲养几天再进行观察效果更好。
七．实验感想
通过本次实验，我们切实了解了脊髓神经控制运动的机理。
图Ⅸ-1 整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2 整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1 背肋dorsal rib 2 胸椎thoracic vertebra 3 颈椎cerical vertebra 4 顶间骨interparietal bone 5 顶骨parietal bone 6 额骨frontal bone 7 鼻骨nasal bone 8 锁骨clavicle 9 肩胛骨scapula 10 肱骨hemerus 11 髌骨patella 12 腰椎lumbar vertebra 13 荐椎sacral vertebra 14 尾椎caudal vertebra 15 坐骨ischium 16 髂骨ilium 17 股骨femur 18 腓骨fibula 19 胫骨tibia 20 跖骨metatarsal bone 21 趾骨digital bone 22 胸肋sternal rib 23 头骨skull 24 指骨digital bone 25 桡骨radius
图Ⅸ-3 背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect 1 枢椎axis 2 胸椎thoracic vertebra 3 第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4 第1 腰椎I st lumbar vertebra 5 第 6 腰椎6th lumbar vertebra 6 耻骨pubis 7 闭孔obturator foramen 8 寰椎atlas 9 第7 颈椎seventh cervical vertebra 10 胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12 第4 腰椎4th lumbar 13 髂骨ilium 14 荐椎sacral vertebra 15 坐骨ischimn 16 尾椎caudal vertebra
小鼠骨髓的综合性实验报告 YUNNAN NORMAL UN I VER SITY 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称： 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月曰 云南师范大学教务处编印 一（实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征，统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制； 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 6掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力
二、实验原理、实验流程或装置示意图 1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象 血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核（Micronucleus）: 染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料：小白鼠（2n=40） 2、器具: 注射器（ 1 ml ，5ml 各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品： 0.15mg/ml 秋水仙素，1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS） pH6.8。
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养 1、取骨髓，对倍稀释 2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用) 3、2000转，离心30分钟 4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液 5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板） 6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml 7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞） 8、重复两至三次 9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞 离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL— 4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮 11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。 参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。即： 1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。 2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。 3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。 4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度 10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。 5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。 6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。 7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。 8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。 9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow- derived dendritic cell, BMDC)。经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。 楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。
图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The https://www.doczj.com/doc/332773266.html,teral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton.Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle9肩胛骨scapula10肱骨hemerus11髌骨patella12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra14尾椎caudal vertebra15坐骨ischium16髂骨ilium17股骨femur18腓骨fibula19胫骨tibia20跖骨metatarsal bone21趾骨digital bone22胸肋sternal rib23头骨skull24指骨digital bone25桡骨radius
图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column.Dorsal aspect 1枢椎axis2胸椎thoracic vertebra3第II胸椎I Ith thoraac vertebra4第1腰椎I st lumbar vertebra5第6腰椎6th lumbar vertebra6耻骨pubis7闭孔obturator foramen8寰椎atlas9第7颈椎seventh cervical vertebra10胸肋sternal rib1l背肋dorsal rib12第4腰椎4th lumbar13髂骨ilium14荐椎sacral vertebra15坐骨ischimn16尾椎caudal vertebra
小鼠骨髓多染红细胞微核实验 目的和意义 微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。 原理 正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断裂，在进入分裂后期时，这种断片落后于向两极移动的染色体而滞留在赤道板附近，当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。 由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。 器材与试剂 1、器材 载玻片、推片、血细胞计数器、滴管、注射器、解剖剪、镊子、止血钳、晾片架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（或荧光显微镜）。 2、试剂 小牛血清； 甲醇； 吉姆萨储备液：将1g 吉姆萨倒入研钵内，加入少许甘油混合研细，分次倒入剩余的甘油至66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内）。放入55~60℃水浴中并不断搅动至2h。取出冷却后加入60ml甲醇，混匀后置室温，2~3周后过滤，保存于棕色瓶内备用（存放时间越长染色效果越好）。 吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH 6.8）1 : 9混匀。 磷酸盐缓冲液（pH 6.8） 阳性对照物：环磷酰胺。 操作步骤 一、试验动物及处理 1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。小鼠体重在18~20g，7~12w。 2、染毒途径：采用腹腔注射给药。 3、剂量选择：环磷酰胺按50mg/kg剂量染毒，同时设立阴性对照（空白对照）。 4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。 二、骨髓液的制备和涂片 脱颈椎处死小鼠，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，横向切断胸骨，暴露骨髓腔挤出骨髓，小心地涂布于载玻片一端的胎牛血清液滴里，混匀涂片。
实验7小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察 一、实验目的 了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。利用显微照相技术对所得切片进行照相。二、实验原理 染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，结果使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。 三、实验用具及材料 实验材料：体重20克左右的小鼠一只 实验试剂：0.075mKCl低渗液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品红溶液、二甲苯 实验材料：恒温水浴槽、纱布、烧杯、离心管2支、刀片、镊子、解剖盘、解剖剪、镊子、注射器、离心机、镜头纸 光学显微镜、带数码相机的光学显微镜 四、实验步骤 1腹腔注射秋水仙素溶液：在做实验前2~3小时，对实验用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量对其进行0.4％的秋水仙素注射。 2取材：实验时，用断颈法迅速将小鼠处死，通过解剖取出股骨，用注射器吸取在37℃下保温的低渗液2毫升，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液从股骨的另一端流出。 收集冲洗液到5ml刻度的离心管中。 3低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在37℃恒温水浴槽内低渗20分钟。4固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒温水浴槽内固定10分钟。 5离心：然后将1000rpm离心10分钟，弃去上清。 6再固定：加入固定液继续固定10分钟（先吹打，再放入恒温水浴槽）。 7离心：再1000rpm的速度离心10分钟。弃去上清， 8制备细胞悬液：离心结束弃上清，最后留大约与沉淀等量的上清液， 9滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片4块并排，手持吸管在载玻片上方向下滴片。 10干燥：让其自然晾干。 11染色：用改良苯酚品红溶液染色10分钟左右。 12去浮色：清水冲洗，风干。 13镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。 14观察和照相：用油镜观察，并选取良好的视野照相。 五、结果与讨论 1．观察结果 在考试的10分钟内拍摄了五张照片。我使用的是0号机，由于前面已经有人用过，所以没有太考虑图像设置的问题，结果拿到结果才发现，0号机的图片普遍偏小，放大就模糊了。
小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 【目的要求】 1.掌握小鼠细胞染色体标本制备方法。 2.计数并观察小鼠骨髓细胞分裂中期染色体的数目及特点 【基本原理】 在骨髓细胞中，有丝分裂旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到中期细胞。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。 【实验用品】 1．器材：解剖刀、剪刀、镊子、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、冰冷载玻片、酒精灯、大培养皿、显微镜、纱布,标签纸，记号笔等； 2．试剂0.1%秋水仙素溶液、Carnoy’s固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、0.075 mol / L KCI 溶液、Giemsa染液等。 3．材料：65-90天健康小鼠（生技09级72人，新华09生物技术36人，生科08级75人，生技08级70人，共253人，需购小鼠110只） 【方法与步骤】 1．前处理取材前3～4 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异，一般每克体重注射2～6μg，注射总量不宜超过2 ml（例如一只体重50 g的蟾蜍，若按4μg / g注射，需注射浓度为0.1％的秋水仙素溶液0.2 ml ）。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。 2．取骨髓细胞处死动物，用装有生理盐水的注射器反复冲洗出骨髓细胞，并用注射器筒轻轻吹打，使细胞团块分散，静置片刻、待大组织团块沉淀后，用吸管将骨髓细胞悬浮液移至离心管中，以1000 r / min 离心5~10 min，弃去上清液。 3．低渗根据骨髓细胞液的多少，加0.075 mol / L的KCI液5～6 ml，在37℃水浴箱中或室温下低渗20～30 min。低渗时间过长，易造成细胞破裂；时间过短，则染色体难以分散。4．预固定低渗完毕，立即加入1 ml 新配制的预冷Carnoy’s固定液，用吸管将细胞轻轻吹打均匀，进行预固定。然后以1000 r / min 离心8 min。 5．固定弃去上清液，加5～6 ml Carnoy’s液，轻轻吹打细胞，静置固定20 min。离心弃去上清液，再加5～6 ml Carnoy’s液，固定20 min。 6．制备细胞悬液离心弃去上清液，再加少许新鲜Carnoy’s固定液，用吸管将固定后的细胞吹散，并反复吹打混匀，制成浓集的细胞悬浊液。 7．准备载玻片滴片前1～2 h，将洁净的载玻片放在0～4℃冰水中，使其表面附有一层水膜。这样在滴片时，细胞悬液遇到载玻片上的冷水，染色体会迅速分散开来。 滴片法制备染色体标本 8．滴片取出预冷的载玻片，将其倾斜约30°放置。吸取细胞悬液，从距离载玻片40 cm 以上高度处滴至载玻片上2～3滴；滴片后立即用嘴或洗耳球对准滴片处轻微吹气；也可用镊子夹住载玻片、在酒精灯火焰上迅速过几下（见图），这样都有助于染色体分散和展开。9．干燥使滴片在室温下自然干燥，或在酒精灯火焰上烤干，也可用吹风机冷风吹干。10．染色待滴片充分干燥后，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释的Giemsa染液（Giemsa原液：缓冲液＝1：10）染色30 min。然后自来水冲洗，空气干燥。镜检。 【结果观察】 1.在低倍镜下观察Giemsa染色后的中期分裂相形态。 2.选择分散适度不重叠染色体的分裂相，在高倍镜下进行观察。
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
小鼠骨髓的综合性实验报告 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称: 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月日 云南师范大学教务处编印 一( 实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制; 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义; 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序; 6、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 二、实验原理、实验流程或装置示意图
1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核(Micronucleus):染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料:小白鼠(2n=40) 2、器具:注射器(1ml，5ml各一支)、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品: 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液(3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配)，Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH6.8。 4、生物显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。四、实验方法步骤及注意事项
图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle 9肩胛骨scapula 10肱骨hemerus 11髌骨patella 12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra 14尾椎caudal vertebra 15坐骨ischium 16髂骨ilium 17股骨femur 18腓骨fibula 19胫骨tibia 20跖骨metatarsal bone 21趾骨digital bone 22胸肋sternal rib 23头骨skull 24指骨digital bone 25桡骨radius
图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect
图Ⅸ-4胸廓背面The thorax．Dorsal aspect
图Ⅸ -5前肢骨内侧面The bone of 图Ⅸ-6后肢骨外侧面The bone of anterior Iimb.Medial aspect posterior https://www.doczj.com/doc/332773266.html,teral aspect 1枢椎axis 2胸椎thoracic vertebra 3第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4第1腰椎I st lumbar vertebra 5第6腰椎6th lumbar vertebra 6耻骨pubis 7闭孔obturator foramen 8寰椎atlas 9第7颈椎seventh cervical vertebra 10胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12第4腰椎4th lumbar 13髂骨ilium 14荐椎sacral vertebra 15坐骨ischimn 16尾椎caudal vertebra 17指骨digital bone 18掌骨metacarp at bone 19腕骨carpal bone 20桡骨radius 21尺骨ulna 22三角突起deltoid process 23鼻骨nasal bone 24额骨frontal bone 25顶骨parietal bone 26顶间骨interparietal bone 27肱骨hemerus 28肩胛骨scapula 29肱骨头head of humerus 30肘突elbow process 31肩胛冈spine of scapula 32肩带pectoral girdle 33大转子greater trochanter 34 股骨 femur 35胫侧髁tibiale condyle 36髌骨 patella 37胫骨tibia 38跖骨metatarsal bone 39股骨头head of femur 40腓骨fibula 41跟骨calcaneus 42跗骨 tarsal bone 43趾骨digital bone
小鼠骨髓微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验 一、目的与要求 1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。 2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。 3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。 二、实验原理 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，
但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC （NCE）有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。 三、实验设计 1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。 2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。 3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天，末次染毒后24小时取样。 4. 剂量选择：至少设置3个剂量组。高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量。当受试样品的LD50大于5 g/kg时，可取5 g/kg为最高剂量，以下设3~5个剂量组。另设溶剂对照组（阴性对照组）和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（50~100 mg/kg）或丝裂霉素C（10 mg/kg）腹腔注射1次。 四、操作步骤 1. 骨髓液的制备及涂片 颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端，另取一块边缘整齐的载玻片，在血清上轻轻按摩，使骨髓完全混匀，然后以45~50度角快速推片，推片后在空气中晾干。 2. 固定 将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟，晾干。
图Ⅸ-1 整体骨骼侧面观The skeleton、Lateral view 图Ⅸ-2 整体骨骼背面观The skeleton、Dorsal view 1 背肋dorsal rib 2 胸椎thoracic vertebra 3 颈椎cerical vertebra 4 顶间骨interparietal bone 5 顶骨parietal bone 6 额骨frontal bone 7 鼻骨nasal bone 8 锁骨clavicle 9 肩胛骨scapula 10 肱骨hemerus 11 髌骨patella 12 腰椎lumbar vertebra 13 荐椎sacral vertebra 14 尾椎caudal vertebra 15 坐骨ischium 16 髂骨ilium 17 股骨femur 18 腓骨fibula 19 胫骨tibia 20 跖骨metatarsal bone 21 趾骨digital bone 22 胸肋sternal rib 23 头骨skull 24 指骨digital bone 25 桡骨radius 图Ⅸ-3 背柱背面The vertebral column、Dorsal aspect
1 枢椎axis 2 胸椎thoracic vertebra 3 第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4 第1 腰椎I st lumbar vertebra 5 第 6 腰椎6th lumbar vertebra 6 耻骨pubis 7 闭孔obturator foramen 8 寰椎atlas 9 第7 颈椎seventh cervical vertebra 10 胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12 第4 腰椎4th lumbar 13 髂骨ilium 14 荐椎sacral vertebra 15 坐骨ischimn 16 尾椎caudal vertebra 图Ⅸ-4 胸廓背面The thorax.Dorsal aspect
实验课名称遗传学实验实验名称小鼠骨髓细胞染色体的制备与观察成绩________________ 姓名王大锤实验报告系列年级学号组别时间温度 实验原理及目的 实验目的 1、学习小鼠骨髓细胞染色体制片程序； 2、掌握空气干燥法制片方法； 3、观察了解小鼠的端着丝粒染色体的形态。 实验原理 1、染色体标本 制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是其它技术（如显带、原位杂交等）的先决条件。 2、骨髓细胞染色体 染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。动物染色体制备最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。在骨髓细胞中，有丝分裂的指数很高，可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞或其它组织需要经过体外培养。 3、空气干燥法 指细胞经过秋水仙素处理、低渗处理、充分固定和滴片等步骤之后，使载片在空气中自然干燥的方法。 实验材料、仪器及试齐U 仪器： 光学显微镜，2mL注射器，5号针头，10mL刻度离心管，吸管，试管，试管架，载玻片，盖片，离心机，光学显微镜，解剖器具（解剖盘，剪子、镊子）。 材料： 小白鼠（Mus musculus 2n=40 ）,体重约18-20g （65-90日龄），雌雄皆可。 试剂及其他： 秋水仙素溶液（100卩g/mL）, 2%柠檬酸钠溶液，0.075M KCl，冰醋酸，甲醇，Giemsa原液, 0.01 M 磷酸缓冲液（PBS, pH 7.4）1?预处理生命与环境科学学院实验报告 进行秋水仙素处理。取骨髓前3-4h给小鼠经腹腔注入秋水仙素（100卩g/ mL）0.3-0.4mL。 2. 取骨髓 处死动物，立即取后肢骨。用剪刀剪掉、清除腿部的皮肤和肌肉，然后从股骨两端关节头处剪下股骨，立即用2%柠檬酸钠溶液冲洗干净。剪掉股骨两端膨大的关节头，使其露出骨髓腔，用吸有适当量的柠檬酸钠溶液注射器，从一端插入注射针头，将骨髓吹入10mL刻度离心管中，可反复吹洗数次，直至股骨变白为止。此时离心管中的细胞悬浮液可达4?6mL。 3. 低渗处理 将所获得的细胞悬浮液经1500rpm离心10min，吸去上清液；加0.075M KCl 6?8 mL ,立即将细胞团吹散打匀。室温下静止15 min。 4. 固定 低渗处理后的细胞，立即经1500rpm离心10 min。吸去上清液，沿管壁加7 mL 3 : 1甲醇冰醋酸固定液，马上吹散细胞团，使其在固定液中悬浮均匀。静止固定40 min。离心后弃去上清液。用1: 1甲醇冰醋酸固定液再次固定，20min后弃去上清液，仅留约约1mL的细胞团和上清液，摇匀制成细胞悬液。 5. 滴片和空气干燥 取事先在冰水中预冷的载玻片，滴1?2滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上，立即用吸管轻轻吹 气，使细胞迅速分散。将制片平放或45。斜放，待其自然干燥。 6. 染色 取经过空气干燥的染色体制片插入染色缸中，用Giemsa染液进行染色，将染液用吸管缓缓地加入，不要形成气泡。染色30min后，用蒸馏水冲洗。 7. 观察 ①在低倍镜下观察Giemsa染色之后的中期分裂相的形态。 ②在高倍镜下选择分散适度，不重叠的染色体的分裂相，在油镜下进行观察，获取图像。 ③观察小鼠染色体的端着丝点染色体的特征，识别着丝点、染色单体、染色体。 ④计算2n的染色体数目。寻找两性之间在核型上的差别。 实验步骤
大鼠和小鼠解剖图谱
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
小鼠骨髓细胞微核试验 一、目的与要求 1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。 2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。 3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。 二、实验原理 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC（NCE）有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。 三、实验设计 1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。 2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。
小鼠骨髓细胞的提取 1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。 2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。 3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。 4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。 5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。 6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。 7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。 8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。 9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。 10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养 1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。 2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。 3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。 4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。 5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。 注意： 1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都 要保证无菌。 2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。 3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的， 避免交叉污染。