蛋白质工程期末复习重点难点
基本概念知识点部分
蛋白质的二级结构常见的结构单元有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等几种。
2、根据形状、结构和溶解度等的不同，可以将自然界中的蛋白质分为三类。既纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。
3、目前，体外翻译系统有兔网织红细胞系统、麦胚提取物系统、E.coli S 30系统三种。
4、蛋白质晶体结构的X-射线衍射分析包含样品制备、蛋白质结晶和晶体生长、衍射数据收集和处理、位相求解、模型建立和修正等五个主要步骤。
5、酶的蛋白质工程是指根据蛋白质的结构规律及其与功能的关系，对蛋白质进行改造，以生产出性能更加优良、更能满足人类社会需要的新型酶分子。
6、构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达，融合蛋白具有衍生因子的双重活性。
6、超滤法是利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜，而大分子则被截留，一次实验可以把蛋白质混合物分为分子大小不同的两个部分。
8、植酸酶是催化植酸和植酸盐水接成肌醇和磷酸的一类酶的总称。
9、蛋白质一级结构决定其空间结构，蛋白质空间结构决定其生物学功能。
10、表达蛋白质组学研究某种细胞或组织中蛋白质表达的整体变化。
11、蛋白质的定向进化，关键步骤是创造基因的多样性，主要是利用易错PCR或是DNA改组技术。
12、蛋白质分子设计按照被改造部位的多少可以分为“小改”、“中改”、和“大改”三种类型。
13、有人把一级结构决定空间结构的密码叫做“第二遗传密码”
14、蛋白质折叠的研究最根本的科学问题就是多肽链的一级结构如何决定它的空间结构。
15、蛋白质晶体是有序的分子聚集体，蛋白质的结晶受到各种物理、化学和生物化学等很多因素的影响。
16、蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐碱以及范德华力等。
17、聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成。
18、在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离，主要基于以下三个物理效应：“电荷效应”、“浓缩效应”、和“分子筛效应”
19、分子印迹的机理主要有共价法和非共价法两种。
20、抗体酶又称催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性，它既具有抗体的高度选择性，又具有酶的高效催化效率。
21、蛋白质工程需要有合适来源的蛋白质作为研究对象。目前，蛋白质主要主要来源于微生物、植物和动物。
22、生物信息学的发展大致经历了三个阶段：前基因组时代（包括生物数据库的建立、检索工具的开发以及DNA和蛋白质序列分析）；基因组时代（包括基因寻找和识别、网络数据库系统的建立和交互界面的开发等）；后基因组时代（标志是大规模基因组分析、蛋白质组分析以及各种数据的比较和整合）
23、蛋白质组学的研究内容主要包括表达蛋白质组学，结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。
24、结构蛋白质组学是指对全部蛋白质精确三维结构的测定。
25、图谱分析作为双向电泳的重要一步，其作用是评价和量化电泳结果。
26、结构域：是指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。
27、蛋白质分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。
28、表面展示技术：是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。
29、抗体工程：是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。
30、基因工程抗体：是指利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其表达生产出的预期的抗体分子，又称重组抗体。
31、蛋白质的一级结构是由20种氨基酸通过肽键连接而成。
32、蛋白质是一类重要的生物大分子，主要含有碳、氢、氧、氮以及少量的硫。
33、蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。
34、根据用途的不同，蛋白质芯片可分为蛋白质功能芯片和蛋白质检测芯片
35、分子印迹技术是模拟自然界所存在的分子识别作用，如酶与底物、抗体与抗原等，以目标分子为模板合成具有识别功能的分子印迹聚合物的一种技术。
36、体外翻译系统：又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。
37、分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的位相的方法。
38、蛋白质在高浓度中性盐溶液中会触电析出，称为盐析。
39、蛋白质组是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。
40、蛋白质的一级结构并没有活性
41、蛋白质粗分级主要包括硫酸铵分级沉淀、有机溶剂沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。
42、功能蛋白质组学主要通过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间的相互作用，以建立细胞内信号转导通路的复杂网络图。
43、根据数据来源又可将生物信息学数据库分为一次数据库和二次数据库两大类。
44、核磁共振是指核磁矩不为0的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生赛曼分裂，共振吸收某一特定频率辐射的物理过程。
45、原子核从激发状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间较弛豫时间，弛豫过程有两种，既自旋晶格弛豫和自旋-自旋弛豫。
46、蛋白质在水溶液中以稳定的胶体形式存在，其表面的水膜和电荷是其稳定存在的主要原因。
47、常用的离心机根据其转速分为三种主要类型：普通离心机、高速冷冻离心机和超速离心机。
48、原子力显微镜主要由力传感器、光学检测系统和位置控制系统三部分构成。
49、对酶分子的改造工作主要着眼与两个方面，一个基于序列的合理化设计，包括化学修饰、定点突变等方法；另一种是利用基因的可操作性，进行非合理设计，包括定向进化、杂合进化等。
50、蛋白质组表达模式的鉴定技术主要有以质谱为核心的技术、蛋白质微测序和氨基酸组成分析等。
51、广义上的范德华力包括三种教弱的作用力：定向效应、诱导效应、分散效应
52、蛋白质细分级常用的实验技术主要有层析和电泳。
53、蛋白质印迹聚合物的聚合方法主要有包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。
54、通常根据抗体的制备方法和技术，将抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三类。
55、目前报道的基因工程抗体很多，大体可以分为三类：嵌合抗体、人源化抗体和小分子抗体。
56、蛋白质工程：是在生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、基因工程技术以及计算机辅助技术等手段的新兴研究领域，是以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现在生物技术，是基因工程的深化和发展。
57、蛋白质的四级结构：由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质就是寡聚蛋白，分子中多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为四级结构。
58、定向进化：自然进化实在整个有机体繁殖和存活的过程中自发出现的一个非常缓慢的过程。我们可以在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。59、生物信息学：是生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉形成的一门新兴学科。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。
60、蛋白质芯片：蛋白质芯片也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其它小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。
综合部分
1.维持蛋白质空间构象的作用力有哪些？分别说明。
蛋白质的一级结构是通过肽键连接成的多肽链，二级结构是靠肽链骨架中的酰胺与羰基之间形成的氢键维
持稳定的，而维持三级结构稳定主要靠大量的非共价因素，其中包括疏水效应、氢键、范德华力相互作用和离子相互作用等次级键。对于寡聚蛋白的亚基之间的作用力主要是一些非共价键，如疏水相互作用、静电引力等。虽然这些次级键单独存在时作用力比较弱，但大量的次级键加在一起，就产生了足以维持蛋白质天然构象的作用力。
(1)疏水效应
蛋白质分子内都有一个疏水内核，由紧密堆积的疏水侧链构成。蛋白质的疏水基团彼此靠近，聚集以避开水的现象称为疏水相互作用或疏水效应。疏水相互作用即是蛋白质折叠的主要驱动力，在稳定蛋白质的三维结构方面起重要作用。
(2)氢键和范德华力
酰氨基与羰基之间常常形成氢键使肽链产生α-螺旋和β-折叠结构。另外，在多肽链骨架和水之间，多肽链骨架和极性侧链之间，两个极性侧链之间以及极性侧链和水之间可以形成氢键。
(3)共价交联和离子相互作用
除氢键以为，共价交联（如二硫键）也有助于某些球蛋白的天然构象的稳定。大多数情况下，二硫键是在多肽链的β转角附近形成的。特别对于分泌蛋白，当离开细胞内环境时，由于有二硫键的存在，可使得蛋白质对去折叠以及降解不敏感，而维持蛋白质的稳定。
带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白的结构，虽然这种作用很弱。离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面，所以是溶剂化的，对整个球蛋白的结构稳定影响较小。
(4)配位键
两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键成为配位键。不少蛋白质含有某种金属离子，如Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+等。金属离子往往以配位键与蛋白质连接，参与蛋白质高级结构的形成与维持。当用螯合剂除去金属离子时，会造成蛋白质四级结构或三级结构的破坏，丧失生物学功能。
2.简述蛋白质分子设计的层次及其分类
蛋白质分子设计依据蛋白质立体结构可以分为两个层次：
一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计。该层次的设计直接将三维结构信息与蛋白质的功能相联系，是一种高层次的设计。
二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。
在蛋白质分子设计的实践中，常依据改造部位的多少将蛋白质分子设计分为三类
(1)定点突变或化学修饰
这类蛋白质分子设计只进行小范围改造，是指在已知结构的天然蛋白质分子多肽链内确定位置上，进行一个或少数几个氨基酸残基的改变或进行化学修饰，以研究和改善蛋白质的性质和功能，也称为“小改”。
(2)拼接组装设计法
这类蛋白质分子设计需进行较大程度的改造，是指对来源于不同蛋白质的结构域进行剪裁、拼接、组装，以期待能转移相应的功能，获得具有新特点的蛋白质分子，也称为“中改”。
(3)从头设计全新蛋白质
这类蛋白质分子是从设计氨基酸序列结构开始进行全新蛋白质的设计，即从头设计一个全新的自然界不存在的蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能，也称为全新蛋白质设计或蛋白质从头设计。
3、常用的蛋白质结晶的方法有哪些？试简要说明。
蛋白质的结晶受很多因素的影响，要成功制备高质量的晶体不是件容易的事情。但是由于科研人员的不断摸索，至今已经形成了各种实践中切实可行的结晶技术和方法，其发展的趋势是微量化和自动化。
(1)批量结晶法。批量结晶法是通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。这种方法的要点是控制所加沉淀剂的量而使蛋白质容易逐步达到低过饱和度。
(2)透析法。此法是利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。
(3)液相扩散法。该法是利用液相平衡原理而设计的。但是蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和从而促使晶核形成。
(4)气相扩散法。把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于着汇总浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。
(5)蛋白质结晶新方法。如使用成核剂或利用现代质谱技术辅助等方法。
4.什么是蛋白质组的动态性和时空性。
蛋白质组的动态性：一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中却总是变动不停。人们可以通过确定变化的蛋白质来理解其功能。但如何区分变化的蛋白质是属于生物学意义上的还是实验意义上的。因为蛋白质的稳定性要比核酸差的多，在制备的过程中，可能会发生降解或丢失。此外，差异蛋白质的区分通常是通过蛋白质双向凝胶电泳来检测，而双向电泳由于自身分辨率的限制，难以测定微量的蛋白质变化，所以要准确测定蛋白质量上的差异是一个困难的任务。
蛋白质的时空性：在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间因素，更要考虑空间的影响。首先不同的蛋白质分布在细胞的不同部位。他们的功能与其空间定位密切相关。想要真正了解蛋白质的功能，必须要知道蛋白质所处的空间位置。其次，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，他们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境中运动发挥作用。因此对于亚细胞蛋白质组学来说有两个难点：一是如何对细胞进行恰当的分级分离。二是如何区别亚细胞组成蛋白质和由于生理作用而在细胞不同区域进行运动的蛋白质。
5.影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素有哪些？试简要说明。
影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素很多，它不仅受目的基因的特性、基因剂量、整合位点、mRNA 5’和3’非翻译区（UTR）、cDNA的（A+T）含量、翻译起始区和信号肽等上游因素的影响，也受宿主菌、Mut（甲醇利用）表型、蛋白酶、蛋白加工、酶切和糖基化及培养条件的影响。
(1)目的基因的特性。目的基因的特性是决定表达成败的首要因素。
(2)启动子的影响。启动子在转录水平上调控基因的表达。
(3)基因剂量。事实证明，基因拷贝数对表达量的影响很难预测。因此，高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准，基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。
(4)宿主、整合方式及转化子表型。在利用毕赤酵母表达外源基因时，整合位点、整合方式、转化子表型的选择没有明显的规律，应根据外源基因的特点和研究目的设计合理的技术路线。
(5)影响蛋白质稳定性的因素。外源蛋白的稳定性直接影响到基因表达的产量。
(6)发酵条件的影响。发酵条件包括通气量和碳源等因素。
6.蛋白质的分离纯化与鉴定一般包含的主要步骤有哪些？
蛋白质的分离纯化和坚定一般包含以下主要步骤
(1)选择实验材料：通常情况下要选择目标蛋白质含量高、其他杂质少、溶液获得、成本低的实验材料。
(2)实验材料的预处理：根据实验材料的不同特点，选用适合的预处理方法。如果是液体材料，通常采用过滤或者离心的方法出去固体杂质即可获得粗制品。如果是固体材料，则要经过洗涤、材料破碎等处理。(3)蛋白质的提取：为了使蛋白质从实验材料中释放并分离出来，除了难溶蛋白质，通常都采用特定的缓冲液将蛋白质溶解，然后通过离心或过滤的方法除去不溶物，就得到蛋白质粗提取液。
(4)蛋白质粗分级：采用简单的实验技术手段（如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等）对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。
(5)蛋白质细分级：采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等手段结合多种电泳技术对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究。
(6)蛋白质的鉴定：包括对蛋白质分子质量、等电点、氨基酸组成及其顺序、免疫特性、结晶特性、生物学功能等进行测定，以确定纯化的蛋白质是什么蛋白质，它的结构与功能如何，它有何用途，为相关产品的开发奠定基础。
7、简述蛋白质的生物学功能
蛋白质是生活细胞内含量最丰富，功能最复杂的生物大分子，参与了几乎所有的生命活动，与核酸共同构成了生命现象的主要物质基础。蛋白质的生物学功能主要包括：
(1)催化。蛋白质的一个最重要的生物功能是作为生物体新陈代谢的催化剂-酶，酶也是数量最大的一类蛋白质。
(2)结构成分。结构蛋白主要的功能是建造和维持生物体的结构，他们给细胞和组织提供支撑和保护。
(3)贮存：种子贮藏蛋白、蛋类中的卵白蛋白、乳汁中的酪蛋白等都具有贮藏氨基酸和蛋白质的功能，必要是为生物体、胚胎或种子的生长发育提供足够的原料。
(4)运动。一些蛋白与细胞的运动有关。如肌动蛋白、肌球蛋白等。
(5)转运。转运蛋白的功能是转运特定的物质。一类转运蛋白在呼吸过程中起运输氧的功能。另一类转运蛋白是膜转运蛋白。
(6)调节。细胞内存在调节蛋白，能调节其他蛋白质的生理活性。一类是在代谢中起重要的调节作用，如生长素等。另外一类调节蛋白参与基因表达的调控。
(7)信息传递。在细胞膜上存在很多受体蛋白，可以与细胞外或细胞内膜包裹的内空间相互作用，将信号跨膜传递，再通过复杂的信号传导途径引发一系列生化反应。
(8)支架作用。支架蛋白借助自身的特定结构，通过蛋白-蛋白相互作用，能识别并结合其他蛋白，可以将多种不同蛋白质装配成一个多蛋白复合体，这种复合体参与对激素和其他信号分子的胞内应答的协调和通讯。
(9)防御和进攻。保护蛋白在细胞的防御、保护中起着重要的作用
(10)其它功能。有些蛋白具有特殊的功能，如植物的甜味蛋白等。
8、讲述蛋白质分子设计的程序
蛋白质分子设计是一门实验性科学，是理论设计过程与实验过程相互结合的产物。一般的蛋白质分子设计可以按照以下步骤进行。
(1)收集相关蛋白质的结构信息。包括一级结构、立体结构、功能结构域及与之相关的同源蛋白质等相关数据，为蛋白质分子设计提供依据和蓝本。
(2)建立所研究蛋白质的结构模型。PDB中或文献报道中有待研究蛋白质的三维结构，则直接采用，作为进行分子设计中的结构模型。如果没有，则可以测得结构和采取其它方法。
(3)结构模型的生物信息分析。对所建立的待研究蛋白质的结构模型进行详细分析，分析确定其三维结构特点等信息，为选择设计目标提供依据
(4)选择设计目标。设计的第一步是选择目标，确定所要建造的三级结构，找出对所要求的性质有重要影响的位点或区域。
(5)序列设计。选定目标之后就有好进行序列设计，选择的序列应尽可能地不同于天然结构的序列。设计时，要充分考虑氨基酸残基形成特定二级结构的倾向性。
(6)预测结果。当选择好氨基酸残基后，需通过理论方法预测出所设计的多肽的二级结构和三级结构，初步检验设计的正确程度，检验目标模型与预期目标的吻合程度，并在此基础上加以调整和更正，使得目标模型达到预期的目标。
(7)获得新蛋白。对蛋白质分子进行计算机理论设计之后，还需要在实验室中将它付诸实现，以检验设计的成功与否。
(8)新蛋白质的检验。对获得的新蛋白质分子，需检测其结构和功能，确定蛋白质分子设计成功与否。
(9)完成新蛋白质设计。通过实验手段验证设计的蛋白质分子是否符合要求，并对设计的蛋白质分子进行结构域功能的评价。然后依据设计出的结构，进行多轮反复设计、反复修改和反复试验，直至达到预期的设计目标，才算完成了蛋白质分子设计。
9、生物信息学的主要研究内容有哪些？试简要说明。
目前公认的生物信息学研究内容主要有以下几个方面
(1)生物信息的收集、存储、管理与提供。全面的、不断更新的生物信息数据的收集、存储、管理与提供是进行同源性检索以及进一步序列模式分析、功能及结构预测的基础。
(2)基因组序列信息的提取和分析。包括基因的发现与鉴定、基因组中非编码区的信息结构分析、模式生物完整基因组的信息结构分析和比较研究等等。
(3)功能基因组相关信息分析。功能基因组是后基因组研究的核心内容，他强调用实验方法分析基因组序列来阐明基因功能。
(4)生物大分子结构模拟和药物设计。人类基因组计划的目的之一在于阐明人体各种蛋白质的结构、功能、相互作用以及与人类各种疾病间的关系和各种预防方法，还包括药物治疗在内的治疗方法，即生物大分子
结构模拟和药物设计。
(5)生物信息分析的技术与方法研究
生物信息学中生物信息分析的技术与方法研究的主要内容包括：发展有效的能支持大尺度做图与测序需要的软件、数据库以及数据库分析工具。改进现有的理论分析方法。等等方面。
10、简述蛋白质芯片的制备？
首先，固相载体的选择和处理。常用的固相载体有膜载体和玻片载体。膜载体常用PVDF膜，使用是先将膜切割成所需尺寸，然后用95%酒精浸泡处理。玻片载体一般要经过化学修饰。
其次，蛋白质靶标的处理。作为制作蛋白质芯片的蛋白质靶标不仅纯度要高，而且要保持生物活性，可用甘油和PBS处理。
再次，将蛋白质靶标点在载体上。膜载体和固相载体用不同的方法处理来达到固定蛋白质的目的。
最后，蛋白质芯片的封闭。将载体上未与蛋白质靶标结合的区域，用相对于固相载体反应的惰性物质进行封闭，防止待测样品中的蛋白质与固相载体上的活性基团结合而产生假阳性。现在常用的封闭试剂有小牛血清蛋白（BSA）和甘氨酸等。
11、简述蛋白质折叠的意义及应用前景。
有人把一级结构决定空间结构的秘密叫做“第二遗传密码”。一定的氨基酸序列的多肽链如何决定蛋白质的空间结构，这一过程又怎么能遵循热力学和动力学规律。这都是发呢在生物学中心法则中至今尚未解决的一个很重要的问题。只有透彻地了解肽链如何通过自身内在所包含的信息，及其周围微环境的相互作用，而最终形成具有特定空间结构和完整生物活性的蛋白质，才能最终阐明遗传信息传递的全过程，才完全建立了分子生物学的中心法则。
蛋白质折叠问题不仅具有上面提到的重大科学意义，而且，在生物工程上具有极大的应用价值。基因工程和蛋白质工程已经逐渐发展成为产值数以十亿美元的大产业。
除了揭示生命体内第二套遗传密码的理论意义以外，蛋白质折叠机制的阐明还存在重要的潜在应用前景
(1)折叠机制的阐明对包涵体的复性会有重要帮助。
(2)了解多肽链的折叠，可以是我们能够按照自己的意愿设计较长的多肽链。
(3)许多疾病是由于蛋白质折叠异常造成的。因此，深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系，对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。
(4)蛋白质折叠机制的阐明是我们对蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系研究的基础。另外只有当我们对于维持蛋白质结构、驱动蛋白质折叠的理化因素更为了解，才能提高蛋白质结构预测的可靠性。
12、举例说明基因工程抗体的应用。
基因工程抗体是指利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其表达生产出的预期的抗体分子，又称重组抗体。
目前报道的基因工程抗体很多，大体可以分为三类：嵌合抗体、人源化抗体和小分子抗体。
(1)人-鼠嵌合抗体。在基因水平上将鼠源单克隆抗体的可变区和人抗体的恒定区连接起来，并在合适的宿主细胞中表达的抗体，称为人-鼠嵌合抗体。
(2)鼠单抗可变区人源化抗体。嵌合抗体虽然在很多程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍不能完全消除，尤其是针对可变区的抗独特型抗体反应仍然存在，鼠单抗可变区的人源话技术应用而生。人源话抗体包括改形抗体和镶面抗体。
(3)小分子抗体。人们基于抗体分子的抗原结合部位仅局限于可变区这一事实，构建了许多形式的分子质量较小的抗体片段，统称为小分子抗体。
小分子抗体，尤其是单链抗体及其衍生物的应用和研究是目前的研究热点，在肿瘤的临床诊断和治疗方面显示了巨大的潜力。
1:蛋白质工程与基因工程的区别
基因工程：把外源基因转入适当的生物体内，从而表达出蛋白质
蛋白质工程：对蛋白质的基因进行改造，从而改造其编码的蛋白质
2创造和改造蛋白质的方法
改造1活性部位2结构顺序
方法：物理化学法_通过变性复性，修饰蛋白质侧链基团，分割肽链，改变表面电荷分布。生物化学法_利用蛋白酶选择性分割蛋白质;用转糖苷酶，酯酶，酰酶等改变化学集团；用转酰胺酶是蛋白质发生胶连。基因重组法。
3：氨基酸分类，蛋白质结构分类
①氨基酸分类依据一：R基结构，分为脂肪族氨基酸、芳香族、杂环族、杂环亚
依据二：R基极性，分为非极性中性氨基酸（甘丙缬亮蛋色苯丙异亮）与极性氨基酸
②1极性中性_R基不解离（丝苏酪半胱谷氨天门冬）2酸性3碱性（组赖精）
蛋白质结构分类：按结构域分类1α型(α螺旋含量>60%)2β型(桶状或柱状)3α/β型(α包围β,αβα样式)4α+β,α与β空间分离,位于分子不同部位
4：蛋白质折叠过程动力学有哪些障碍
动力学途径指导折叠过程,避免大量无规则构象的筛取.
但会对正确折叠产生障碍:1中间体通过外漏疏水集团结合2不正确的二硫键形成3脯氨酸残基的异构化（分子伴侣等消除此不利）
5：蛋白质二级结构，结构域，超二级结构，疏水内核
二级结构：多肽链借助氢键形成的局部结构，有α螺旋，β折叠等。超二级结构：邻近的二级结构在空间折叠上靠近，形成的二级结构聚合体（αα，βββ，βαβ）。结构域：蛋白质亚基中明显分开的紧密球状结构。疏水内核：蛋白质结构共同特征，在分子内部，都有一个由疏水侧链堆积形成的结构。有稳定结构的作用。
6：蛋白质结构测定方法，分子伴侣，增加蛋白质结构稳定性的途径
①结构测定方法：X-ray，核磁共振，荧光转移法_纤维衍射法_理论建模法
②帮助蛋白质和正确折叠然后离开的蛋白质分子
③降低折叠态与非折叠态的熵差，以减少非折叠态的构象（引入二硫键；增加Pro，替换Ala）；稳定α螺旋（通过残基替换抵消电荷）；填充疏水内核
7：蛋白质设计目标及怎样解决
1热稳定性（引入二硫桥增加氢键数目与表面盐桥改善内部疏水堆积）2对氧化的稳定性（把Cys-Ala、Ser_Met-Val_Trp-Phe）3对重金属的稳定性（Cys-Ala、Ser_ Met-Val_替换表面羧基）4PH稳定性（替换表面电荷基团_内离子对置换_内His,Cys,Tyr的置换）5提高酶学的性质（增加逆转数_改变酸碱度）热氧化金属PH酶
目的：为蛋白质工程提供指导性信息与探索蛋白质折叠机理。问题：缺乏结构的独特性与功能的优越性。（全新）既能折叠成预想的结构，又具有有趣和有用的功能：1从头设计2改造。
8：分子改造的方法与原理
突变体的设计步骤：计算机模拟，基因构建，得到产物，功能分析
1计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸（要考虑对功能非常重要的位置_确定折叠敏感区如特殊扭角的氨基酸与盐桥_互换插入删除会产生什么影响）2预测结构（依据能量优化及Pr.动力学）3预测性质(与原始比较_结构功能相关理论)
原理：1内核假设（蛋白质折叠由内核内残基作用决定）2内部紧密堆积但无重叠3所有内部氢键都最大程度满足4疏水亲水基团合理分布在表面与内部（表面也要有些疏水基反之亦然）5金属蛋白中配位残基的替换要满足金属配位几何（残基数目，键角，键长）6金属蛋白中第二壳层中相互作用重要（氢键网络的第二壳层常与蛋白主链相连）7最优氨基酸侧链几何排列8结构与功能专一性
原则：满足所有几何要求，满足Pr折叠限制
9突变体类型与优缺点
插入、删除、替换一个或多个氨基酸残基。
突变体这种方法只能针对3d已知的蛋白。而且，通过突变体来研究蛋白质功能时，会有一定的不确定性—难以区分效应究竟是由残基替换引起还是残基替换引起的蛋白质构象改变引起。且构象对残基的改变有一定的耐受力。
10:定向进化原理
获得你所需的突变体，即定向进化=随机突变+选择。通过PCR中的Taq DNase不具有3’-5’校正功能，配合适当条件，以很低比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的蛋白质，从而排除其他突变体。
11：表达体系有哪些，及他们的特点
大肠杆菌表达体系1优点_遗传生理背景清楚_容易培养_外源基因表达水平高2缺点无真核翻译后修饰如糖基化磷酸化_广泛二硫键的形成_外源基因产物在大肠杆菌内易形成包涵体_起始蛋氨酸未被切除
酵母表达系统_哺乳动物细胞表达系统_昆虫表达系统_卵细胞表达系统_转录翻译无偶联表达系统
共同特点：复制起始点_选择性基因_启动子_终止序列_核糖体结合位点_多克隆位点
12：噬菌体显示技术
By G.P.Smith：外源DNA被插入丝状噬菌体外被基因中，他们一块表达（融合蛋白形式），并显示在噬菌体表面。通过亲和纯化分离，可建立肽文库，建立抗体肽。
13：蛋白质工程应用实例
①枯草杆菌蛋白酶定点改造
1提高酶热稳定性（重组两个相同的蛋白酶E基因）2改变底物特异性（将蛋白酶BL的Gly-124/151突变,可催化弹性蛋白-苔红素了,原来只可催化酪,肌原纤维蛋白）3提高酶反应速率,通过降低表面电荷,极性.
14：抗体种类
单克隆抗体(特异产生所需抗体的B细胞体外培养的产物)_多克隆抗体_基因工程抗体(对Ig基因体外切割拼凑后导入细胞表达的抗体_嵌合抗体，单链抗体，抗体库，单区抗体)
15：蛋白质组学与蛋白质组
研究蛋白质产物表达情况—基因芯片只能研究DNA到RNA 。包括二维凝胶电泳技术，质谱测序技术。A1:高能态——熔球态——不稳定高能过渡态——中间态
驱动力：疏水侧链的包埋释放的能量
A2:蛋白质结构与功能的分析by1基因重组等实验2分子动力学热力学能量最低，同一位置不能有两个原子等计算
A3:Pr.从头设计基本障碍:怎样克服线性交联的构象熵(1共价交叉2相互作用的强度最大)
组装方法1二级模块自组装2配体诱导3共价交联4使用模板5先线性再折叠成球状6基于组合库
A4:突变方法1引物介导的定点突变2PCR介导3盒式突变
A5:蛋白质工程应用导致的蛋白质特性改变1加入二硫键提高稳定性2将Gln与Asp替换,因为他们会被氧化成酰胺,局部-整体3减少游离Cys(错误折叠)4增加酶活改变酶的特异性.
蛋白质组学期末作业
1、一、常用的样品制备技术： 1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。） 2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF （等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快； 3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率； 4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行； 5、分析对象广泛； 6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。 二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观
质膜的纯度鉴定方法 11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等） 3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性） 4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例） 由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
2012—20XX年《医学生物学》期末复习重点 考试时间：20XX年12月31日13:30—14:30 题型：名词解释20分；单选20分；判断题20分；简答题40分。 1、蛋白质的概念：蛋白质是构成细胞结构的主要成分, 是生命的重要物质基础之一, 具有非常复杂的生物学功能： ①作为结构成分；②运输和传导作用；③收缩运动作用； ④免疫保护作用；⑤催化作用。 由氨基酸构成。 2、蛋白质的分子结构： 一级结构：在以肽键为主键，二硫键为副键的多肽链中，氨基酸的排列顺序，即为一级结构，是蛋白质分子的线性平面结构；蛋白质的一级结构，决定着不同蛋白质各自特定的空间结构和功能。 二级结构：肽链上相邻近的氨基酸残基间靠氢键维系的有规律、重复有序的空间结构，有α螺旋、β折叠和三股螺旋。 3、蛋白质的变构和变性的概念： 变构是指蛋白质通过构象变化而实现调节其功能的现象； 变性是指蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构被破坏、生物活性随之丧失的现象。 共同点：高级结构变化，都不涉及一级结构。 不同点：变构是高级结构改变，导致生物功能变化，并不是失去功能，变化是可逆的。 变性是高级结构完全破坏，无生物活性。 注：蛋白质特定的空间结构是行使生物功能的基础。 4、单位膜的概念：由脂双层及嵌合蛋白质构成的一层生物膜。是包围在整个细胞最外层的薄膜。各种细胞的细胞膜以及各种细胞内膜在电镜下都呈“暗-明-暗”的三层式结构，即内外两层致密的深色层，厚度约为2nm，中间一层疏松的浅色带，厚度为3.5nm：
5、穿膜运输的种类及特点： 1）被动运输指物质顺浓度梯度（从高浓度到低浓度），不需要消耗代谢能的运输方式； I、简单扩散：物质从浓度较高一侧直接穿过膜的脂质双分子层向浓度较低的一侧转运（物质顺浓度梯度的单纯的扩散作用），不需借助载体。只有疏水分子及不带电的极性小分子以此方式过膜。 II、离子通道扩散：极性很强的水化离子通过细胞膜上的特异离子通道蛋白从高浓度向低浓度方向的转运。 III、易化扩散：非脂溶性物质或亲水性物质（如葡萄糖、氨基酸、核苷酸、金属离子以及细胞代谢物）借助细胞膜上的载体蛋白帮助，顺浓度梯度方向的跨膜转运。（物质顺浓度梯度，需借助特定的载体蛋白的物质运输。不带电荷的较大的极性分子以及一些离子以此方式运输。） 2）主动运输指物质逆浓度梯度（从低浓度到高浓度），需消耗能量，并需专一性的载体蛋白。 I、Na+-K+泵：是镶嵌在质膜上的蛋白质，也是一种Na+-K+ ATP酶，既有载体的功能， 也具有酶的活性。 II、Ca2+泵：是存在于质膜和内质网膜上的一种跨膜蛋白。 III、H+泵：能将H+泵出细胞，建立和维持跨膜的H+电化学梯度来驱动转运溶质进入细胞。 IV、N a+-K+泵驱动的协同运输：主动运输并不直接利用A TP，而是依靠Na+-K+泵维持Na+的跨膜梯度的驱动而进行的伴随运输，是一种间接利用ATP的主动运输方式。 6、膜泡运输的种类及特点：质膜对大分子化合物或颗粒不能通透，它们在细胞内运转时都由膜包围，形成细胞质小泡，故称膜泡运输。都是需能的主动运输。 1）、胞吞作用：质膜内陷将外来的大分子和颗粒包围，形成小泡转运到细胞内的过程。 I、吞噬作用：细胞吞噬较大的固体颗粒物质或大分子复合体（如细菌、细胞碎片）的过程。 II、胞饮作用：细胞摄取液体和溶质的过程。
1.蛋白质分子的构型与构象 构型：是分子中原子的特定空间排布。当构型相互转变时，必须有共价键的断裂和重新形成。基本构型有L-型和D型两种。这种构型无法通过单键的旋转相互转换。 构象:是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，构象的转换不要求有共价键的断裂和重新形成,在化学上难以区分和分离。 2.内核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构。 3. van't Hoff焓平衡常数与焓/熵的关系式为：－RT lnK = △H - T△S。取对数可以变为： lnK = －△H/RT + △S/R。进一步推导可以变为：d（lnK）/d（1/T）= －△H/R。基于此，以lnK对1/T可以得到一条曲线。在这条曲线上任何一点的斜率就是△H/R，其中的△H称为van't Hoff焓。通过解析van't Hoff焓随温度变化的曲线特点，可以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。也就是通过这样的曲线分析，可以预测蛋白质天然构象退在折叠时的容易程度。 4. 盒式突变法也称为片断取代法（DNA fragment replacement）。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。 5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体melton globule。熔球体具有天然态的大多数二级结构，但不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，环肽区和表面结构多数处于未折叠状态，侧链可以活动。非折叠态卷折成熔球体包含了蛋白质折叠的主要奥秘—疏水侧链的包埋。 6. 反向折叠设计在蛋白质工程中，全新蛋白质设计是以弥补天然蛋白质结构和功能在应用方面的不足为目的，根据人类所希望的结构和功能，采取工程手段，来人工设计新的氨基酸序列，这样的设计研究称为反向折叠研究。在全新蛋白质设计的反向折叠研究中，需要采取的基本策略是通过设计新的氨基酸序列,来加强或者减弱蛋白质的某些相互作用力，使设计的序列能最终具有所希望的结构和功能。 7. 功能基团的特异性修饰 蛋白质中，不仅末端氨基酸具有氨基和羧基，很多链中氨基酸侧链也具有羟基、巯基、氨基和羧基等能进行特征性化学反应的功能基团。利用这些功能基团的化学反应性可以进行蛋白质功能基团的特异性修饰。 8. 基因突变技术 在基因水平上设计并使某特定基因发生变异，对该基因所编码的蛋白质进行改造，在突变基因表达后、用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 9. 融合蛋白质 重组DNA技术允许在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产生的蛋白质叫做融合蛋白质。
班级_______ 学号__________________ 姓名 ___________ 第二章《蛋白质化学》作业及参考答案 第一部分试题 1 ?氨基酸的侧链对多肽或蛋白质的结构和生物学功能非常重要。用三字母缩写形式列出其侧链为如下要求 的氨基酸： (a)含有一个羟基；b)含有一个氨基；c)含有一个具有芳香族性质的基团；(d)含有分支的脂肪族烃链；(e)含有硫；(f)含有一个在pH 7 —10范围内可作为亲核体的基团或原子，指出该亲核基团或原子。 2. 某种溶液中含有三种三肽：Tyr - Arg - Ser , Glu - Met - Phe 和Asp - Pro - Lys , a - COOH基团的pKa为 3.8; a -NH3基团的pKa为8.5。在哪种pH (2.0,6.0或13.0)下，通过电泳分离这三种多肽的效果最好？ 3. 利用阳离子交换层析分离下列每一对氨基酸，哪一种氨基酸首先被pH7缓冲液从离子交换柱上洗脱出来。 (a)Asp 和Lys ； (b) Arg 和Met ；c) Glu 和Vai ； (d) Gly 和Leu (e) Ser 和Ala 4?胃液(pH = 1.5)的胃蛋白酶的等电点约为1,远比其它蛋白质低。试问等电点如此低的胃蛋白酶必须存在有大量的什么样的官能团？什么样的氨基酸才能提供这样的基团？ 5. —个含有13个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为： Ala, Arg,2 Asp, 2Glu, 3Gly, Leu, 3Val。部分酸水解后得到以下肽段，其序列由Edman降解确定，试推断原始寡肽的序列。 (a)Asp - Glu - Val - Gly - Gly - Glu - Ala (b)Val - Asp - Val - Asp - Glu (c)Val - Asp - Val (d)Glu - Ala -Leu - Gly -Arg (e)Val - Gly - Gly - Glu - Ala - Leu (f)Leu - Gly - Arg 6 ?由下列信息求八肽的序列。 (a)酸水解得Ala , Arg , Leu, Met, Phe, Thr, 2Val (b)Sanger 试剂处理得DNP-Ala。 (c)胰蛋白酶处理得Ala , Arg , Thr和Leu, Met, Phe , 2Val。当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala 和DNP-Val。 (d)溴化氰处理得Ala, Arg，高丝氨酸内酯，Thr, 2Val，和Leu , Phe ,当用San ger试剂处理时，分别得 DNP-Ala 和DNP-Leu。 7 ?下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中： CNBr异硫氰酸苯酯丹黄酰氯脲6mol/LHCl 3 -巯基乙醇水合茚三酮过甲酸胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶。其中哪一个最适合完成以下各项任务？ (a)测定小肽的氨基酸序列。 (b)鉴定肽的氨基末端残基。 (c)不含二硫键的蛋白质的可逆变性。若有二硫键存在时还需加什么试剂？ (d)在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。 (e)在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。 (f)在赖氨酸和精氨酸残基侧水解肽键。 8?已知某蛋白是由一定数量的链内二硫键连接的两个多肽链组成的。 1.00g该蛋白样品可以与25.0mg还原型谷胱甘肽(GSH, MW = 307)反应。
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
第五章补体系统第一节补体概述 补体系统（complement system）：系统包括30余种组分，其广泛存 在于血清、组织液和细胞膜表面，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。血浆中补体成分在被激活前无生物学功能，经活化后具有酶活性和多种生物学效应（简称补体）。（一）补体系统的组成 1.补体固有成分⑴C1(C1q、C1r、C1s)、C2～C9； ⑵甘露糖结合凝集素(MBL)，MBL相关丝氨酸蛋白酶（MASP）；⑶B因子、D因子（factor B, factor D）。 2.补体调节蛋白：以可溶性或膜结合形式存在、参与补体活化和效应的一类蛋白质分子，如：备解素、C1抑制物、C4结合蛋白、I因子等等。 3. 补体受体：指存在于不同细胞膜表面、能与补体激活过程所形成的活性片段相结合、介导多种生物效应的受体分子。包括：CR1～CR5、C3aR、C5aR、C1qR等（二）补体组分的命名 ①以“complement”的首字母结合发现顺序命名，如C1 ～C9； ②以英文大写字母命名为“因子”，如B因子、D因子、P因子、H因 子； ③补体的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示，如C3a、 C4b； ④具有酶活性的成分或复合物则在其符号上加一横线表示，如 C3bBb； ⑤补体调节蛋白多以功能命名，如C1抑制物（C1INH）、C4结合蛋 白（C4bp）、衰变加速因子(DAF)；（三）补体的生物合成 约90%血浆补体成分由肝脏合成，少数成分由肝脏以外的细胞合成， 例如：C1由肠上皮和单核/巨噬细胞产生；D因子由脂肪组织产生。 多种促炎细胞因子（如IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6等）可刺激补 体基因转录和表达。感染、组织损伤急性期以及炎症状态下，补体产生增多，血清补体水平升高。第二节补体激活 补体固有成分以非活化形式存在于体液中，其通过级联酶促反应而被激活，产生具有生物学活性的产物。已发现三条补体激活途径，经典激活途径、旁路途径、MB途径 具有共同的末端通路——攻膜复合体的形成及细胞溶解效应。 补体三条活化途径示意图 （一）经典激活途径(classical pathway) 1. 参与的补体成分：C1—C9 2. 激活物:与抗原结合的IgG、IgM分子另外，C反应蛋白、细菌脂多糖(LPS）、髓鞘脂和某些病毒蛋白（如HIV的gp120）等也可作为激活物。3．活化过程(1) C1q与2个以上Fc段结合可发生构型改变，使与C1q结合的C1r活化，活化的C1r激活C1s的丝氨酸蛋白酶活性。 (2) C1s的第一个底物是C4：在Mg2+存在下，使C4裂解为C4a和C4b . (3) C1s 的第二个底物是C2分子：在Mg2+存在下，C2与C4b形成复合物，被C1s裂解而产生C2a和C2b；C2a可与C4b结合成复合物即C3转化酶; (4) C3转化酶使C3裂解为C3a和C3b，新生的C3b可与C4b2b中C4b结合，形成C5转化酶，进入终末途径. 补体激活经典途径
蛋白质组学相关试题及答案 解释 1． Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 2. Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 3. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 4. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information （2）adapted to separation and identification methods （3）different samples,different extraction. 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 5. Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 6. De novo sequencing(从头测序) 从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、
蛋白质组学相关试题及答案 1…Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 2…. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 3. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information（2）adapted to separation and identification methods（3）different samples,different extraction.蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。 原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 4.Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 5.De novo sequencing(从头测序) unknow peptide从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、离子类型的确定、测序算法以及打分算法。
三、名词解释 1.常/异/染色质: 常染色质是指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低，处于伸展状态，用碱性染料染色时着色浅的那些染色质; 在细胞周期中，间期、早期或中、晚期，某些染色体或染色体的某些部分的固缩常较其他的染色质早些或晚些，其染色较深或较浅，具有这种固缩特性的染色体称为异染色质。具有强嗜碱性，染色深，染色质丝包装折叠紧密，与常染色质相比，异染色质是转录不活跃部分，多在晚S期复制。 2. 细胞融合: 是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。 3. 膜泡（囊泡）运输:大分子和颗粒物质被运输时并不直接穿过细胞膜，都是由膜包围形成膜泡，通过一系列膜囊泡的形成和融合来完成转运的过程， 4. 干细胞：干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。 5. 细胞信号转导：是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程。 6. 胞间连丝:在初生纹孔场上集中分布着许多小孔，细胞的原生质细丝通过这些小孔，与相邻细胞的原生质体相连。这种穿过细胞壁，沟通相邻细胞的原生质细丝称为胞间连丝。 7. 核小体：核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone)构成，是染色质（染色体）的基本结构单位。由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。 8. 天线色素：天线色素是能够吸收光的色素，又称捕光色素或光吸收色素，位于类囊体膜上，只具有吸收聚集光能的作用，而无化学活性。 9、第二信使：细胞可通过两个途径将细胞外的激素类信号转换成细胞内信号，然后通过级联放大作用引起细胞的应答。这种由细胞表面受体转换而来的细胞内信号通常称为第二信使。 10、蛋白质分选：在细胞质基质中的核糖体上合成的蛋白质被转运至细胞特定部位的过程。 11、半自主性细胞器：自身含有遗传表达系统（自主性）；但编码的遗传信息十分有限，其RNA转录、蛋白质翻译、自身构建和功能发挥等必须依赖核基因组编码的遗传信息（自主性有限）。叶绿体和线粒体都属于半自主性细胞器。 12、蛋白质寻靶：游离核糖体合成的蛋白质在细胞内的定位是由前体蛋白本身具有的导向信号决定，故游离核糖体上合成的蛋白质在合成释放后需要寻找自己的目的地称为蛋白质寻靶。 13、细胞分化：在个体发育中，一种相同的细胞类型逐渐在形态、结构和功能上产生稳定性差异的而形成不同细胞类型的过程。
第三章蛋白质工程习题 1、名词解释：蛋白质工程：是基于对蛋白质结构和功能关系的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论及实践，是基因工程基础上的延伸，是第二代基因工程。 蛋白质分子设计：是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，即在知道了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案。 嵌合抗体：用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区(V区)基因与人免疫球蛋白(Ig)的恒定区(C 区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表达,制成嵌合抗体。目前国内外已制备了数十种嵌合抗体。 PDB:蛋白质结构数据库。 2、请列表总结基因工程和蛋白质工程的相同点、不同之处（从结果、实质、流程等方面）及其联系。 3、蛋白质工程的基本目标、基本途径是什么？ 答：基本目标：对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。 基本途径：基因修饰或基因合成：借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术4、目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法？ 答：⒈基因定点突变技术（小改）：即通过在DNA水平上进行碱基的取代、插入或缺失，达到改变基因，从而改变编码的蛋白质的结构的技术，包括核苷酸引物诱变，盒式诱变，PCR
诱变，随机诱变。⒉基因剪切和融合（中改）：原理：将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上，经克隆、表达，产生新的融合蛋白。可达到使蛋白易于表达、纯化、细胞定位等，或使蛋白性质改变。⒊基因全合成（大改）：合成DNA，然后表达出相应蛋白。可以全部由人工控制，便于设计和改造，还适用于同时实现多处突变。 5、蛋白质工程中增加蛋白质稳定性的基本途径有哪些？ 答：蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。 6、请简述PCR介导的定点突变技术原理及优缺点。 答：4种引物3次PCR。优点：操作简单，突变的成功率可达100%。缺点：①后续工作较复杂，PCR扩增通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录，翻译等方面的研究。②不论是用普通的TaqDNA聚合酶还是高保真的Pfu酶，PCR方法产生的DNA片段都要经过核苷酸序列测定，方可确证有无其他突变发生。 7、天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，其结构如下。将胰岛素B9残基上极性的Ser置换为带电荷Asp，同时把B27极性的Thr置换为带负电荷的Glu，由此可制成速效胰岛素。请阐述其原理。
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
一、名词解释 分子生物学：包括对蛋白质和核酸等生物大分子的结构与功能，以及从分子水平研究生命活动 RNA 组学：RNA 组学研究细胞中 snmRNAs 的种类、结构和 功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下 snmRNAs 的表达具有时间和空间特异性。增色 效应: DNA 变性时其溶液 OD260增高的现象。 减色效应: DNA 复性时其溶液 OD260降低的现象。 T m:变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的 解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其 大小与 G+C 含量成正比。 解链曲线：如果在连续加热 DNA 的过程中以温度对 A260 （absorbance，A，A260代表溶液在260nm 处的吸光率） 值作图，所得的曲线称为解链曲线。 DNA 复性：在适当条件下，变性 DNA 的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 核酸分子杂交：在 DNA 变性后的复性过程中，如果将不同 种类的 DNA 单链分子或 RNA 分子放在同一溶液中，只要两 种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜 的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形 成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。 基因：广义是指原核生物、真核生物以及病毒的 DNA 和RNA 分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位。狭义指能产生一个特定蛋白质的 DNA 序列。 断裂基因：不连续的基因称为断裂基因，指基因的编码序列在 DNA 上不连续排列而被不编码的序列所隔开。 重叠基因：核苷酸序列彼此重叠的2个基因为重叠基因， 或称嵌套基因。 致死基因：删除后可导致机体死亡的基因。 基因冗余：由于一基因在个体中有若干份拷贝，当删除其中一个时，个体的表型不发生明显变化。 DNA 重组：DNA 分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，又称为遗传重组或基因重排。 同源重组：发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。 接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒 DNA 从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌） 的DNA 转移称为接合作用(conjugation)。 转化作用：通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。 转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA 转移及基因重组即为转导作用 位点特异重组：位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个 DNA 序列的特异位点间发生的整合。 12-23规则：重组发生在间隔为12bp 到23bp 的不同信号序列之间，称为12-23规则。 转座子：（transposon）在基因中可以移动的一段 DNA 序列。 转座：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 DNA 克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA 接合成一具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分子，也称基因克隆或重组 DNA (recombinant DNA)。 基因工程：(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA 工艺学。限制性核酸内切酶：(restriction endonuclease, RE) 是识别DNA 的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶。 同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割 DNA 后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。 载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA 分子。 复制：(replication)是指遗传物质的传代，以母链 DNA 为模板合成子链 DNA 的过程。 半保留复制：（semi-conservative replication）DNA 生物合成时，母链 DNA 解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的 DNA 都和亲代 DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。 复制子：（replicon）DNA 分子中能独立进行复制的单位称为复制子。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。 复制眼：（replication eye）DAN 正在复制的部分在电镜下观察起来犹如一只眼睛，称为复制眼。 复制叉：（replication fork）复制一开始，复制起始点要形成一个特殊的叉型结构，是复制有关的酶和蛋白质组
蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简