2007年第65卷
化 学 学 报
V ol. 65, 2007 第13期, 1229～1233
ACTA CHIMICA SINICA
No. 13, 1229～1233
* E-mail: zywu@https://www.doczj.com/doc/352186630.html,
Received December 15, 2006; revised January 12, 2007; accepted March 19, 2007. 国家自然科学基金(No. 20205004)和教育部科学技术研究重点(No. 106122)资助项目.
·研究论文·
一种新型Zn 2＋近红外荧光探针的研究
唐友云 罗春花 吴朝阳* 沈国励 俞汝勤
(湖南大学化学化工学院 化学生物传感与计量学国家重点实验室 长沙 410082)
摘要 Zn 2＋是多种酶和转录因子的必要成分, 在生物体内起着重要的作用, 检测Zn 2+具有十分重要的生物学意义. 我们合成了一种新型近红外荧光探针TAEA-IR-780, 该探针通过配位作用与Zn 2＋结合后, 荧光显著增强. 通过质谱和氢谱对该探针进行了表征, 并探讨了pH 值、其它金属离子对Zn 2＋检测的影响. 该探针的激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 可避免对生物活体的损伤, 同时生物体内常见的金属离子对其干扰较小. 该探针对Zn 2＋的检测下限达 1.0× 10－9 mol?L －1, 具有较高的检测灵敏度. 关键词 近红外; 荧光探针; Zn 2＋
A Novel Near-infrared Fluorescent Probe for Zn 2＋
TANG, You-Yun LUO, Chun-Hua WU, Zhao-Yang * SHEN, Guo-Li YU, Ru-Qin
(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics , College of Chemistry and Chemical Engineering , Hunan
University , Changsha 410082)
Abstract Zn 2＋
is an essential component for many enzymes and transcription factors, in which it plays structural or catalytic roles, so its detection is of great biological significance. The development of novel
near-infrared fluorescent probe for Zn 2＋
, TAEA-IR-780, was described in this paper, which was obtained by directly attaching an acceptor, tris(2-aminoethyl)amine (TAEA), to a near-infrared fluorophore IR-780. The excitation and emission wavelengths of the TAEA-IR-780 are 683 and 750 nm, respectively, and its fluores-cent intensity increases with the addition of Zn 2＋
under physiological condition (pH ＝7.4) and the detection
limit reaches 1.0×10－9 mol?L －
1. Moreover, the fluorescent intensity of TAEA-IR-780 does not increase no-ticeably in the presence of other biologically important cations such as Ca 2＋ and Mg 2＋
. The results show that the probe can not only effectively minimize cell damage and autofluorescence by excitation light but
also afford sufficient sensitivity and selectivity for the biological detection of Zn 2＋
.
Keywords near-infrared; fluorescent probe; Zn 2
＋
锌是一种重要的人体必需的微量元素(日需量约10～15 mg), 广泛地分布于人体的细胞和体液中, 是人体内200多种酶的组成成分, 直接参与体内细胞生长发育、生殖和组织修复等各种生命代谢过程. Zn 2＋在细胞的生命活动中起着非常重要的作用, 在基因转录、金属酶催化、神经传递等过程中都有Zn 2＋的参与[1]. 据文献报道, 体内缺少了Zn 2＋会导致免疫系统受损、免疫功能
缺陷等一系列疾病的产生; Zn 2＋还能够选择性地诱导与暂时性大脑局部缺血[2]、癫痫[3]、脑损伤[4]等急性病相关的神经元细胞死亡. 尽管有许多报道都描述了Zn 2＋ 在生物体系内的重要性, 但是它的作用机制还不是十分明确. 随着对Zn 2＋ 在生命活动中的作用认识越来越深, 细胞内Zn 2＋的研究已成为化学、生物学和临床医学等学科重要的前沿热点研究课题.
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近年来, 人们开始研究细胞内Zn2＋的测定方法和技术, 先后建立和发展了锌离子传感器、Zn2＋荧光探针、核磁共振和微电极等多种方法. Zn2＋荧光探针法通常具有选择性好、灵敏度高、简便快捷等特点, 因而得到了迅速的发展, 是目前最常用的一种方法. 其中应用最广泛的是由Frederickson等[5]研究制备的N-(6-甲氧基-8-喹啉)-p-甲苯磺胺(TSQ)及其衍生物[6,7]. Zinquin是其中的衍生物之一, 已用于活体细胞内Zn2＋的检测[6]. 尽管这些基于喹啉的荧光探针都非常有用, 但是它们的激发波长都在紫外区, 检测过程对活体细胞的损伤较大, 同时也不能避免来自生物体本身的自发荧光, 因而并非理想的荧光探针. Hirano 等[8,9]先后合成了ZnAF-1, ZnAF-2, ZnAF-1F, ZnAF-2F 等荧光探针, 经过不断改进, 在一定程度上改善了紫外光对活体细胞的损伤问题(激发波长492 nm, 发射波长 515 nm), 使活体细胞内的锌离子探测成为可能.
近红外荧光探针发射波长在700～1200 nm范围内, 具有较小的辐射能, 而且在该波长范围内生物分子自身荧光较弱, 可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度, 因而受到很多学者的重视. 本文以IR-780为原料, 合成了一种用于检测Zn2＋的新型近红外荧光探针, 可避免活体细胞的损伤, 降低生物体自身的荧光背景, 为进一步改善Zn2＋的活体检测提供了可能.
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
FL3-P-TCSPC荧光检测仪(美国JY公司), 激发/发射检测狭缝为5.0 nm/5.0 nm.
IR-780 (98%, Aldrich), TAEA [三(2-氨乙基)胺, 98%, Aldrich], HEPES (羟乙基呱嗪乙硫磺酸, 98%, Al-drich), ZnSO4?7H2O (99.5%, 天津市大茂化学试剂厂), 其余试剂均为分析纯.
1.2 溶剂的纯化和干燥
量取50 mL的溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF), 用5 g KOH干燥10 h之后, 减压蒸馏, 5 mL初始馏分不回收, 得到纯净无色的DMF溶剂, 并加入5 g KOH干燥待用.
1.3 IR-780的TAEA衍生物(TAEA-IR-780)荧光探针的合成
TAEA-IR-780的合成如图式1所示. 称取IR-780 40 mg, 量取TAEA 70 μL、无水DMF 10 mL, 加至 100 mL 的三颈烧瓶中, 升温至80 ℃, 在N2氛围下搅拌反应4 h. 冷却后, 减压蒸馏, 得蓝黑色固体. 将该固体溶解在CH2Cl2中, 以V(CH3CH2OH)∶V(CH2Cl2)＝1∶14的混合溶剂为洗脱剂, 过碱性Al2O3 柱, 收集蓝色组分. 减
图示1 TAEA-IR-780的合成
Scheme 1 Synthesis of TAEA-IR-780
压蒸馏后得蓝色固体, 再次以V(CH3CH2OH)∶V(CH3COOCH2CH3)＝1∶4的混合溶剂为洗脱剂过碱性Al2O3柱进行纯化, 减压蒸馏后, 得蓝色固体. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.9～1.8 (m, 38H), 2.3 (s, 2H), 2.45 (s, 2H), 3.4～3.8 (m, 4H), 4.0～4.3 (m, 3H), 5.3 (s, 3H), 5.6～5.8 (m, 1H), 6.9～8.2 (m, 8H); ESI＋-MS: calcd 649.97, found 651.3.
1.4 TAEA-IR-780荧光探针对Zn2＋的荧光响应
1.4.1 TAEA-IR-780贮备液的配制
称取7.5 mg TAEA-IR-780, 溶于0.965 mL二甲亚砜(DMSO)中, 配成10 mmol?L－1的贮备液备用. 取60 μL 10 mmol? L－1的贮备液, 稀释至10 mL, 得0.06 mmol?L－1待用液.
1.4.2 羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液的配制
称取HEPES 2.38 g, NaNO3 0.085 g, 配制100 mmol?L－1的HEPES缓冲液(pH＝7.4)备用.
1.4.3 测量过程
取2.8 mL的HEPES (pH＝7.4, I＝0.1), 加入0.06 mmol?L－1的待用液50 μL (TAEA-IR-780的最终浓度为1.0 μmol?L－1), 不同浓度的Zn2＋溶液50 μL, 检测荧光强度. 测量荧光强度时, 激发波长为683 nm, 狭缝宽度为5.0 nm/5.0 nm.
2 结果与讨论
2.1 TAEA-IR-780的荧光光谱特征
IR-780是一种三碳菁近红外荧光染料, 其激发波长为780 nm, 发射波长为804 nm, stokes位移较小. 根据Peng等[10]报道, 当三碳菁被含有氨基的基团取代后, 其吸收波长将会蓝移, stokes位移将会增大, 其原因为分子内电荷转移(ICT). 我们用多氨基的TAEA基团取代
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唐友云等：一种新型Zn 2＋
近红外荧光探针的研究
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了IR-780分子的氯原子, 合成了TAEA-IR-780并研究了其荧光特性. 图1为TAEA-IR-780的荧光光谱图, 从图中可以看出TAEA-IR-780的吸收波长出现了较大蓝移, 最大激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 其stokes 位移亦比IR-780明显增大(为67 nm). 这些结果与Peng 等[10]的报道氨基取代对IR-780分子的荧光光谱的影响基本一致, 而且增大的stokes 位移亦为Zn 2＋的高灵敏检测提供了良好的保障
.
图1 TAEA-IR-780的激发和发射光谱
Figure 1 The excitation and emission spectra of TAEA-IR-780
2.2 测定原理
TAEA 是一个强的金属配位基团, 在 TAEA-IR- 780溶液中加入Zn 2＋
后, TAEA 基团与Zn 2＋
配位结合, 假设Zn 2＋
与TAEA-IR-780配位生成m ∶n 的配位化合物, 可认为Zn 2＋(B)与TAEA-IR-780 (A)反应存在以下平衡:
B A A B n m
K m n ??→＋ (1)
K 是配位反应平衡常数. 根据修正的Stern-Volmer 方 程[11]推导出荧光强度信号的改变、
TAEA-IR-780的浓度[A]及Zn 2＋的浓度[B]三者之间的关系可表示如下：
10
[A][B]n m F F K F
－－＝ 设ΔF ＝F 0－F , 代入上式并取对数得：
lg()lg (1)lg[]lg[]F
K n A m B F
Δ＝＋－＋ (2) F 0和F 分别表示空白溶液的荧光强度和加入Zn 2＋后的
荧光强度. (2)式说明：以lg()F
F
Δ对lg[]B 作图应是一条 斜率为m , 截距为lg (1)lg[]K n A ＋－的一根直线. 图2为
实验所得荧光强度变化值对数lg()F F
Δ与Zn 2＋
浓度对数
lg[]B 的函数关系图. 从图中可以看出函数关系曲线为一直线, 经计算斜率为0.9144, 取整数可得出m ＝
1.
图2 荧光强度变化值对数lg(ΔF /F )与Zn 2＋
浓度对数lg[B]的
函数关系图
Figure 2 A plot of lg(ΔF /F ) as a function of the lg[Zn 2＋]
假设溶液中游离的TAEA-IR-780浓度[A]f 与其总浓度[A]t 之比为α, 检测到的荧光强度可表示为:
0f
t 0b
[A][A]F F F F α－＝
＝－ (3)
其中F b 是空白缓冲溶液的荧光强度, F 0是TAEA- IR-780与Zn 2＋全部配合以后的荧光强度, F 是实际检测的荧光强度. 由于已得出m ＝1, α与Zn 2＋浓度[B]的关系可表示为:
11
1[A][B]n n m
nK αα－＝－ (4)
图3中5条曲线是分别用不同n 值和K 值代入公式(4)计算而得出. 从图中可以看出, m ∶n 为1∶1, K 为9.65×105的曲线与实验数据最为吻合, 可见TAEA-IR- 780与Zn 2＋是通过1∶1配位结合. 根据配位基团TAEA 的分子结构特点, 可推测其与Zn 2＋形成了稳定的四配位化合物, 实现对金属离子的选择性结合. TAEA-IR- 780的配位作用如图式2所示. 该探针的作用机理可能是TAEA-IR-780中与IR-780直接相连的N 原子与金属离子配位致使分子极化状态改变, 从而影响分子内电荷
转移, 导致荧光强度增加. 实验考察了Zn 2＋配位作用对探针的荧光特性的影响, 在１μmol?L －1的TAEA-IR-780溶液中分别加入不同
浓度的Zn 2＋溶液并测量了其荧光发射光谱(图4). 从图
中可以看出, Zn 2＋浓度在(1.0×10－9～1.66×10－5) mol?L －1
范围内, 荧光强度随Zn 2＋浓度的增加而明显增加. Zn 2＋
检测下限可达1.0×10－9 mol?L －1 (由空白值的3倍标准偏差确定), 显示了较高的检测灵敏度.
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化 学 学 报 V ol. 65, 2007
图3 相对荧光强度α对lg[Zn 2＋]的关系曲线
Figure 3 Relative fluorescence intensity α as a function of lg[Zn 2＋]
The curves fitting the experimental data were calculated from Eq. (4). (1) m ∶n ＝3∶1, K ＝8.98×1017; (2) m ∶n ＝2∶1, K ＝9.31×1011; (3) m ∶n ＝1∶1, K ＝9.65×105
; (4) m ∶n ＝1∶2, K ＝9.64×1011
; (5) m ∶n ＝1∶3, K ＝ 1.93×1018 ■
Data points experimentally obtained
图式2 TAEA-IR-780与Zn 2＋的配位
Scheme 2 The coordination of TAEA-IR-780 and Zn 2＋
2.3 pH 值对荧光强度的影响
TAEA-IR-780作为Zn 2＋
的选择性荧光探针主要基于TAEA 的配位作用, 而溶液pH 值的大小会影响TAEA 氨基的离解状态, 改变TAEA 的配位能力, 进而影响TAEA-IR-780的荧光响应. 我们测定了不同pH 值的HEPES 缓冲溶液(100 mmol?L －1, I ＝0.1)对荧光强度的影响(图5). 结果显示, 在中性pH 范围, pH 值对TAEA-IR-780的荧光响应的影响较小, 在pH ＝7左右时, 相对荧光强度具有最大值. 而生物活体样品的检测一般在pH ＝7.4的条件下进行的, 因此选择 pH ＝7.4的HEPES 缓冲溶液来进行所有的实验
.
图4 TAEA-IR-780 与不同浓度的Zn 2＋作用后的荧光光谱图 Figure 4 Fluorescence emission spectra of TAEA-IR-780 in the presence of different concentration of Zn 2＋
(1) 0; (2) 1.0×10－
9; (3) 1.0×10－
8; (4) 1.0×10－
7; (5) 2.0×10－
7; (6) 4.0×
10－
7; (7) 1.0×10－
6; (8) 8.33×10－
6; (9) 1.66×10－
5 mol?L
－1
(λex ＝
683 nm)
图5 pH 值对荧光强度的影响
Figure 5 Effect of pH on the fluorescence intensity
I F /F0＝F /F 0, F 0 was the blank value of fluorescent intensity; F was fluorescent
intensity after adding Zn 2＋
(the final concentration of Zn 2＋
was 1 μmol?L －
1)
2.4 干扰测定
为了研究该荧光探针的选择性能, 考察了一系列生物体系中常见金属离子的干扰情况, 检测结果如图 6所示. 由于与TAEA 的配位能力很弱的原因, 在Na ＋, K ＋, Ca 2＋, Mg 2＋等碱金属和碱土金属离子的存在下, 该荧光探针都没有明显的响应. 而在过渡态金属阳离子Co 2＋和Ni 2＋的存在下, 荧光强度有少量的增加, 其原因可能是TAEA-IR-780可与这些过渡态金属阳离子亦可形成配合物有关, 但其增加值显著小于探针对Zn 2＋的响应值. 而Fe 3＋, Mn 2＋和Cu 2＋等离子的存在会引起荧光强度下降, 可能是这些金属离子可引起荧光淬灭. 结果显示该探针对Zn 2＋具有良好的选择性, 抗干扰能力强, 有望用于生物活体检测.
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图6 不同金属阳离子对Zn2＋检测的荧光干扰图Figure 6 The relative fluorescence intensity of 1 μmol?L－1 TAEA-IR-780 in the presence of various cations
The data was measured at pH 7.4 (100 mmol?L－1 HEPES buffer, I＝0.1). 1. none; 2. 1 μmol?L－1 Zn2+; 3. 5 mmol?L－1 Na+; 4. 5 mmol?L－1K+; 5. 5 mmol?L－1 Ca2+; 6. 5 mmol?L－1 Mg2+; 7. 1 μmol?L－1 Mn2+; 8. 1 μmol?L－1 Fe2+; 9. 1 μmol?L－1 Fe3+; 10. 1 μmol?L－1 Co2+; 11. 1 μmol?L－1 Ni2+; 12. 1 μmol?L－1 Cu2+; 13. 1 μmol?L－1 Zn2+＋5 mmol?L－1 Na+; 14. 1 μmol?L－1 Zn2+＋5 mmol?L－1 K+; 15. 1 μmol?L－1 Zn2+＋5 mmol?L－1 Ca2+; 16. 1 μmol?L－1 Zn2+＋5 mmol?L－1 Mg2+
3 结论
合成了一种检测Zn2＋的近红外荧光探针, 其激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 可避免对活体细胞的损伤, 同时也可降低背景荧光干扰, 其检测下限可达1.0×10－9 mol?L－1. 在pH＝7.4的生理环境下, 该探针对多种生物体系内常见金属阳离子的抗干扰能力强, 具有检测活体细胞内Zn2＋的可能性, 在活体细胞内的检测应用正在进一步的研究中. References
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用于小分子和生物酶响应的反应型近红外荧光探针近红外荧光探针具有长波长激发、生物体损伤及背景干扰较小等优点,对人类认识生物体内离子、小分子及生物酶等的生理过程具有重要意义。反应型荧光探针因其具有识别不可逆性及较高的检测灵敏度受到广泛关注。 目前已有一些反应型近红外荧光探针的报道,而将其应用于肼、多硫化氢(H2Sn)及人源羧酸酯酶2(CES2)荧光识别及成像方面的报道较少并存在一些局限。因此,设计和合成用于肼、H2Sn及CES2响应的反应型近红外荧光探针对揭示它们的生理功能具有重要意义。 肼具有较严重的生理毒性,将乙酰基团引入至苯并吡喃腈类荧光团DCPO骨架当中合成了探针BI-E,它是一例识别肼的反应型近红外双光子荧光探针,绝对荧光量子产率为0.002。BI-E识别肼后能够生成DCPO,最大发射波长为680nm,响应时间为1 min,最低检测限为5.7 × 10-8 M,绝对荧光量子产率为0.011,在830 nm处具有最大双光子吸收截面30GM。 孵育24h的MCF-7细胞存活率大于90%,表明BI-E具有较低的细胞毒性。成像研究表明,该探针可实现对活细胞内胼的单、双光子近红外荧光成像。 H2Sn是细胞内一种潜在的信号传导分子,Cy-Sn是一例用于H2Sn响应的反应型近红外荧光探针。它是以氧杂蒽类半菁荧光染料Cy-OH为母体、2-氟-5-硝基苯甲酰基为识别基团,与H2Sn反应后溶液的最大发射波长为720 nm,响应时间为5 min,检测限为2.2 × 10-8 M。 Cy-Sn孵育24 h后,RAW 264.7细胞存活率大于90%,表明该探针具有较低的细胞毒性。荧光成像研究表明,该探针不仅可实现对活细胞内H2Sn的荧光成像,而且借助于Cy-Sn观察到细胞在经历炎症及抗炎响应过程后H2Sn的浓度变化。
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
仪器名称：小动物近红外二区荧光活体影像系统 百购生物网为您提供 型号：Series II 900/1700 简介： 针对传统活体荧光成像技术面临的低组织穿透深度（<3毫米）和低空间分辨率（~毫米）、高自发荧光背景等瓶颈，苏州影睿光学科技有限公司的研究团队历经多年潜心研究，于2012年推出了第一款基于近红外二区荧光（NIR-II,900-1700nm）的小动物活体影像商业化系统（Series II 900/1700），实现了高组织穿透深度（>1.5cm）、高时间分辨率（50ms）和高空间分辨率（25μm）的活体荧光成像。 Series II 900/1700可针对不同的研究体系，在小动物活体水平进行实时、无创、动态、定性和定量的影像研究，包括肿瘤早期检测、肿瘤发展、转移和治疗过程、药物筛选、靶向药物和靶向治疗、干细胞活体示踪及其再生医学研究等。影睿光学拥有世界领先的量子点制备和应用专利技术、活体荧光影像设备，以及强大的数据处理和分析功能，为用户提供完整的科研产品及解决方案。 目前，影睿光学Series II 900/1700系统已成功销往美国埃默里大学，并与美国哈弗大学医学院、美国康奈尔大学、美国埃默里大学、北京大学、复旦大学附属华山医院、南京大学附属鼓楼医院、中国科学院北京动物研究所、中国科学院上海药物研究所等数十家国内外优秀研究机构建立了良好的商业伙伴及合作关系。
技术优势： 荧光活体成像解决方案：近红外二区荧光成像
活体组织对近红外二区荧光（1000-1700nm）具有更低的吸收和散射效应，以及可以忽略的自发荧光背景，因此，在活体荧光成像中，与传统荧光（400-900nm）相比，近红外二区荧光具有更高的穿透深度、更高的时间和空间分辨率，以及更高的信噪比。 近红外二区荧光探针解决方案：Ag2S 量子点
荧光上上转换纳米粒子做近红外荧光探针 由于在生物医学研究和临床治疗上的需求，光学成像技术在生物成像的应用方面发展迅猛，各种新手段、新材料、新方法不断涌现。近年来，随着各种功能强大的荧光探针的快速发展（如半导体纳米粒子、荧光蛋白、荧光有机分子等），光学成像技术已经越来越广泛的应用于生物体内成像研究。但是，由于需要光作为成像的信息源，生物组织对光的高散射和高吸收成为制约光学成像技术在生物体内成像的主要障碍。一般来讲，生物组织对可见区（350-700nm）和红外区（>1000nm）具有最强的吸收。相反，生物组织对近红外区（650-1000nm）光的吸收最少，因此近红外光可以穿透生物组织的距离最大。采用近红外荧光探针可以对深层的组织和器官进行探测和成像，这是可见区荧光探针所不能比拟的。我们在设计新一代荧光探针时必须考虑如何将探针的激发光和发射光调控到近红外区。 迄今为止，近红外荧光探针的种类非常有限，几乎全部属于有机荧光染料，而有机荧光染料作为生物体内荧光探针有很多缺点：第一，有机荧光染料容易被光漂白，不能长时间使用；第二，有机染料不适合同时多色成像，大多数染料只能被特定的波长有效激发，需要多个激发光源才能实现多色显示；第三，激发和发射波长不够稳定，容易随周围环境（如PH、温度等）而变化。为了克服这些缺点，人们正在发展用无机荧光纳米半导体粒子（量子点）来作为新一代荧光探针。与有机荧光染料相比，量子点具有很多优势：首先，量子点具有宽带吸收峰和很窄的发射峰，通过控制粒径可以得到从紫光到近红外的各种发光；其次，具有很高的荧光量子产率，发光稳定，不易被光漂白；并且，量子点容易实现修饰，可以在表面修饰各种有机分子和生物分子，进行生物检测和成像，一个量子点还可以修饰很多靶向分子。目前，发射近红外光的CdTe， CdS，HgS和CdSe 量子点已经作为近红外荧光探针应用在近红外生物细胞和组织成像研究上。然而，目前采用的这些量子点在生物成像中仍然存在一些问题。最主要的问题就是量子点的毒性，如量子点中含有的Cd, P和Hg等均对生物体有很大伤害。此外，量子点需要高能量的紫外或近紫外光激发，在采集荧光探针信号的同时，生物组织在高能量光源的激发下的产生自身荧光也会极大干扰荧光探针的信号，造成信噪比变差，从而不能检测深层生物组织的信号。长时间暴露在高能光源下还会造成生物组织的光损伤、蛋白质破坏和细胞死亡等。因此，开发新一代近红外荧光纳米粒子必须满足以下几个条件： 1.制备方法简便，绿色无污染，原料成本低。 2.发光稳定，不会被光漂白。 3.荧光量子产率高。
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
收稿日期:2007207211 基金项目:国家自然科学基金(No.20575047,39970206,29575206,20775058) 3通讯联系人:张华山,男,教授,博士生导师,研究方向:分子探针与检测试剂,现代分离. 第24卷第2期 Vol.24 No.2分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2008年4月Apr.2008文章编号:100626144(2008)022******* 近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展 傅妮娜1,2,王 红1,张华山31 (1.武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072; 2.南京邮电大学公共基础课学部,南京210003) 摘 要:本文评述了自1999年以来近红外荧光探针和标记试剂及其在生物分析中的应 用进展。包括:菁染料、噻嗪和噁嗪染料、含四吡咯基团染料(酞菁和卟啉)、罗丹明类、 BODIP Y 、稀土离子配合物和量子点等。描述了它们在荧光测定和毛细管分离荧光检 测以及免疫荧光分析方面的应用。引用文献75篇。 关键词:近红外荧光探针;荧光检测;生物分析 中图分类号:O657.33 文献标识码:A 1 前言 荧光光谱法由于其灵敏度高、选择性好,获得的信息直观、准确,能科学表达解释复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等诸多问题,所以在生物分析及造影方面应用广泛。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光,严重干扰生物样品的荧光检测和造影,如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325～350nm ,还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADP H )和胆红素的荧光波长范围为430～470nm ,故使得可见光区荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm ,可避免背景干扰。所以,近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。 二极管激光器的问世,打破了由于传统的激发光源无法在近红外区激发而使近红外荧光染料的应用长期以来一直受到的限制。以此为基础发展起来的新的、近红外荧光试剂及检测技术广泛地应用于核酸、蛋白质、生物造影、免疫分析等领域,在生物分析中显示出巨大的潜力。当然,近红外荧光染料也存在着不足之处,如染料种类不多,合成困难,染料的光、热、化学性质不稳定等。对此文献[1]曾作过评述。本文主要对1999年以来近红外荧光探针及其应用进展进行评述。 2 菁染料(Cyanine) 近红外区的菁染料一般都是指五甲川和七甲川菁染料。另一方面,菁染料光稳定性较差,易发生光氧化漂白。菁染料的光氧化具有以下特点:(1)在溶液中的光氧化反应符合一级反应动力学过程;(2)菁染料中甲川链结构相同时,杂环母核上取代杂原子增大,稳定性降低,即吲哚>噁唑>噻唑>硒唑;(3)当杂环母核结构相同时,甲川链越长,光稳定性越差。这些对于设计光稳定较好的近红外菁染料具有非常重要的指导意义。 菁染料标记生物样品主要有静电/疏水作用非共价、共价形式以及通过活性基团与一些生物分子形成生物结合物(Bioconjugate ),用于标记核酸、蛋白质、免疫分析和造影等。 用于DNA 分析的近红外菁染料中最重要的就是噻唑橙及噁唑橙二聚体和单聚体。二聚体叫TO TO 3 32
近红外荧光探针基于结构的设计策略与最新进展 摘要近红外荧光探针以其优秀的灵敏度和抗干扰性能在生物检测中被广泛应用。近红外荧光探针也成为荧光探针领域的研究热点之一。本文从近红外荧光探针的 结构出发，概述了近年来对于近红外荧光探针基于结构的设计策略，以及这些荧 光探针的机理及特点。 Abstract: Near-infrared fluorescent probes are widely used in biological detection due to their excellent sensitivity and anti-interference performance. Near-infrared fluorescent probes have also become one of the research hotspots in the field of fluorescent probes. In this paper, based on the structure of NIR fluorescent probes, the structure-based design strategy of NIR fluorescent probes in recent years, as well as the mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. 1.前言 荧光染料和荧光团是一类能够被光激发而产生荧光的物质，基于他们而设计 的分子探针在生物分析等领域发挥了重要作用。近红外光波段与生物荧光本底值 之间存在200nm以上的距离，对干扰信号具有较好的屏蔽作用。这使得利用近红外荧光探针来检测分析生物样品具有显著的优越性。构建对不同样品有高区分度，对微量样品有较低检测限，对生物体无不良作用，生物可耐受的近红外荧光探针 是荧光探针研究领域的重要课题。本文主要对近年来近红外荧光探针的设计与应 用进展进行概述。 2基于结构的设计策略 2.1基于香豆素结构的设计 香豆素及其衍生物作为天然产物，在植物界中大量存在。香豆素类化合物的 内酯结构可以与苯环产生共轭，共轭体系对荧光量子产率有提升作用，体系能量 降低可以增大Stokes位移[1]。通过合理设计，可以控制香豆素的光学性质，这使 得这类化合物能够成为优秀荧光母核之一。简单香豆素受自身分子性质的限制， 荧光强度和波长不能达到要求，但在香豆素的苯环上引入推电子或电荷密度大的 基团，会有效提高分子内电荷密度，从而明显提高荧光强度。香豆素的3-位具有 易于衍生和调控波长的特点，因此3-位是香豆素分子修饰常用位点，通过延长分 子共轭实现分子合理改造。 Wang Kai等人在7-羟基香豆素的3位引入苯并噻唑结构，通过C-C单键连接，增大原有共轭体系而得到新型近红外荧光分子[2]。通过甲酰化和随后与NBD-NHNH2的缩合，进一步得到可有效检测环境中Ni2+的荧光探针。该探针可以与 Ni2+形成螯合物而失去荧光性能，再利用CN-与Ni2+的配位反应，将Ni2+从螯合 物中解离出来而恢复荧光。Feng Shumin等人通过用2,4-二苯并磺酰磺酰基基团保护氢喹喔啉亚氨基香豆素的亚氨在生理pH条件下，该探针可高度区分H2S与其 他含硫物质，对低浓度的H2S能有效检测，并能以较大的斯托克斯位移发射荧光。该荧光分子具有低细胞毒性，可用在活细胞和动物中对H2S成像。Huang Yongfei 等人通过异佛尔酮与香豆素的反应，在香豆素3-位引入吸电子长共轭体系，成功 设计出对HOCl具有响应快、检测限低特性的近红外比率式荧光探针。通过对细 胞进行成像，该探针可以成功识别内源性的ClO-，对外源性的ClO-也能做出响应，提示有可能应用于早期临床诊断[3]。 2.2基于花菁染料结构的设计 花菁染料的典型结构是由奇数个碳原子形成的共轭链和其两端连接的两个含
1，光声成像结合近红外光学，两种成像模式的融合： 近红外超声成像技术的原理：当近红外脉冲激光照射到生物组织上,生物组织吸收光能量而产生热膨胀，在脉冲间隙释放能量发生收缩。伴随着热胀冷缩的过程会产生高频超声波，吸收光能量的多少决定了产生的超声波的强度。因为不同的组织对近红外光的吸收不同，于是就会产生不同强度的超声波，这个技术对于血管成像十分理想，因为血红蛋白是近红外超声成像内源性的造影剂。利用这个技术，在肿瘤学的研究中可以用来区分正常组织和病变组织（因为癌症组织的血管十分丰富）。另外，光声成像技术检测的是超声信号（该技术克服了纯光学成像技术在成像深度与分辨率上不可兼得的不足），反映的是光能量吸收的差异（补充纯超声成像技术在对比度和功能性方面的缺陷），结合近红外光学和超声这两种成像技术各自的优点，能实现对组织体较大深度的高分辨率、高对比度、高灵敏度的结构成像和功能成像的结合，并且能对感兴趣区域（肿瘤部位）做断层成像，效果要优于小动物CT。并且近红外成像由于其穿透力较深和组织背景低等特点，特别适合于体内的成像；并且该系统所配备的近红外实时成像系统，可实时指导小动物乃至大动物的手术操作，在造影剂的辅佐下，可完成靶向部位的探测成像，指导手术的细微操作。因此，该成像平台不仅可以完成无标记的组织结构和功能成像（光声部分），又可在造影剂的增强效果下完成手术的导航（近红外光学部分），是科研定量研究和转化医学的结合产物。近红外超声成像平台是近年来发展起来的一种无损医学成像方法，它结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高穿透深度特性，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像。并可对组织进行3D定量分析，可完成多波长激发的断层扫描，可实时指导动物模型的手术操作过程，它是近几年来新兴的无损医学成像方法，也是动物模型研究中不可或缺的工具之一。 目前应用近红外超声技术的文章多在国际前沿杂志上发表，如nature等，它代表了新型的小动物成像发展的趋势，也给小动物成像带来了技术上的革新。所以能够购买此平台将会大大提高科研技术水平，缩短与国际领先实验室的技术差距。 近红外光学部分在染料、探针或造影剂的选择上与光声成像是兼容的，因为光声成像的波长就是在近红外区域，所以从实验设计上来讲，就能够做到完全与光声成像同步。不需要设计和增加额外的探针或造影剂，就能够实时同步确证的实验，从而节约了研究成本，也能够确保数据对比的可靠性。 近红外光学部分具有实时光学成像的特点，可以持续对研究对象进行成像并录制成连续动态的电影，观察探针或造影剂在体内分布的时间分布。这种实时成像同时还具有开放的特点，即不需要专业暗室，动物也不需要进行麻醉，只要将近红外光学探头对准动物即可。这种简单易用的操作，不需要特殊试验条件的特点使得近红外光学更具有较强的实用性。由于它具有实时成像、实时录影的特点，因此对于某些吸收较快、清除较快的探针具有特别重要的现实意义。任何一个时间段的荧光信号变化都能够被完全捕获下来，不会漏掉某
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
第46卷第7期2018年4月广 州 化 工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石 磊1,2,黄 玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东 广州 510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东 广州 510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东 佛山 528099) 摘 要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测 中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1 加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1 马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,
1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA
有机荧光探针最新研究进展 徐绍彬 （化学化工学院，1081109001） 摘要荧光探针是是一种极好的生物分子传感器,具备灵敏度高反应时间迅速等特点。近年来,随着生命科学的不断发展,荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着荧光探针的合成及应用技术的不断改进,人们对有机荧光化合物的认识和研究也不断深入,有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。本文对最近几年国内外有机荧光探针的研究情况做一综述。 关键词BODIPY 荧光探针染料 探针是一种能和某特异靶分子相互作用,实现对靶分子进行检测的分子,并要求相互作用后对被探测对象不产生或仅产生可忽略的干扰。荧光探针就是以荧光物质作为指示剂,并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光,通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。荧光分析方法灵敏度高,选择性好,试样量小,在分析化学,特别是在分子生物学、生物化学、医学等领域中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱,检测灵敏度较差,人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生,生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质,使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。 荧光探针可有多种分类方法:按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针。按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂(fluorescent) 和荧光生成试剂(nuorlgenic)。按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物) 荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。近年来随着生命科学的日益发展，大量的各式各样荧光探针被合成出来，人们对荧光探针技术的认识和研究也不断的深入。目前常用于合成荧光探针的染料有BODIPY、菁染料、噻嗪与噁嗪类染料、呫吨类染料等。本文将讨论最近三、四年的有机荧光探针的发展情况，并重点对基于BODIPY的有机荧光探针的合成及应用进行概述。 1 BODIPY类 二氟化硼－2－二吡咯甲烷(BODIPY) 是一类重要的有机荧光染料，由于其分子结构易于改性，近十年来研究人员合成了一系列的BODIPY衍生物，并在荧光探针技术上得到应用。这类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔吸光系数大、稳定性好、对pH、溶液极性不敏感等优点，因而在金属离子检测、PH值测定、DNA的标记及测序等方面得到重要应用。 1.1基于BODIPY的金属离子荧光分子探针研究进展 设计一种检测生理过程重要金属离子的荧光探针是非常活跃的领域，对金属离子探针的研究早在20世纪七八十年代就已开始，己经报道的探针分子成百上千。BODIPY类金属离子荧光探针的研究也陆续见诸报道，不少研究人员利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针，使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面。 2008年，Serdar Atilgan 等人通过逐步法合成了一种高灵敏的锌离子荧光探针。这种新颖的双苯乙烯基取代的BODIPY衍生物结合锌离子以后，发射峰从730nm蓝移至680nm，因而可做为发射峰在近红外区域的水溶性荧光探针。
医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。