中国药典微生物检验附录的主要增修订内容
王知坚
?微生物限度检查法
?无菌检查法
?抑菌剂效力检查法
?非无菌药品微生物限度检查指导原则
?微生物实验室受控洁净环境的监控指导原则?无菌检查用隔离系统验证指导原则
?微生物鉴定指导原则
微生物限度检查法
?修订的背景
?修订的主要过程
?制订过程中的热点问题
?修订的背景
–国外的情况
ICH有关各方于2002~2004年期间就无菌检查
法开展了充分的协调，并相继于2005年在
USP、EP、BP和JP中收载。
关于化学药品、原料药的微生物检查方法和标准，有关各方于2007年达成一致（第四阶
段），并相继在USP30、EP5.6和JP15第一增补本中收载了协调一致的微生物计数法、控制
菌检查法和限度标准
由于中药产品的复杂性，其微生物限度标准目前尚未进行协调
–国内的情况
2008年，启动2010年版中国药典微生物限度检查法的增修订工作，设置了采用ICH协调案收载的培养基体系开展预研的课题，并考虑在该版药典中直接收载与协调案高度一致的检验方法，但没有最终实施
2010年版药典执行1年后，考虑到国际交流的需要，在接受了国内有关企业的反馈意见后，决定在微生物检验方法上与国际标准进行统一
?修订的主要过程
–2011年3月，根据2015年药典附录编制大纲的要求，
确定了微生物限度检查法修订的主要工作内容和任务
分工，分别由陕西所、中检院和广东所负责起草初稿–2011年12月，经过3次较大篇幅的修改，基本确定了微生物计数法、控制菌检查法和限度标准这三个文件的
征求意见稿
–2012年3月和9月，先后两次在药典会网站上向全国公
开征求意见，并对收集到的意见进行梳理，根据合理
化的意见建议对讨论稿再次进行了修改
–2012年12月，在杭州会议上对稿件进行了审议，基本
定稿
–2013年2月，将定稿在药典会网站上再次公示
–何时执行
注：《中国药典》2015年版拟对“附录XIII C微生物限度检查法”做出全面修订，修订后的方法包括三个附录，即“计数法”、“控制菌”、“标准”。为使修订后的方法顺利实施，《中国药典》2010年版第二增补本附录将予以收载，在2015年版《中国药典》正式实施前供大家参考。
?制订过程中的热点问题
–微生物计数试验的环境问题
“应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污
染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工
作台面及环境应定期进行监测。”
问题：
1、要不要与现行GMP接轨
2、如何采用等同于GMP要求的环境洁净度级别
3、核心操作环境、背景环境、辅助实验环境的相互关系
4、怎样开展洁净环境的监测
–微生物计数的方法
“计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。”
“MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。”
问题：
1、涂布法、喷涂法？应该如何操作？
2、MPN法什么时机下用？
–微生物计数法使用的培养基
“注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基”
“若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。”
“每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨肉汤培养基中”
“若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。”
问题：
使用含抗生素的或选择性培养基时，是否需要开展适用性检查
–微生物计数中需要使用的菌种
“金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC （B）10104〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕、白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕、黑曲霉〔CMCC（F）98003〕”问题：
1、铜绿假单胞菌？为什么不是大肠埃希菌？
2、CMCC？ATCC允许吗？
–计数方法适用性试验
“……所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。……
（1）试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。（2）供试品对照组取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。
（3）菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。”
问题：
1、如何理解这个1%的规定？
2、涂布法时，严格执行该项规定，会产生精度不高的情况，如何处
理？
3、稀释剂对照组没有了？何时才需要开展？
–供试品检查
“各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
101cfu：可接受的最大菌数为20；
若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。”
问题：
1、限度标准放宽了吗？
2、还能够复试吗？
–耐胆盐革兰阴性菌的预增菌
“取供试品，用胰酪大豆胨肉汤作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（附录×××）制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。”
问题：
进行预增菌，如何确保不对定量试验结果造成影响？
–确证控制菌检查结果的技术
“用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。”
问题：
到底那些方法是适宜的？
菌落生长形态
革兰氏染色形态
生化反应（传统的鉴定培养基、API试条、全自动生化鉴
定仪）
色谱、光谱分析技术
分子生物学技术
–微生物限度标准的分类
将需要控制微生物指标的药品分成需要符合无菌要求的、口服给药制剂、局部给药制剂、化学药品原料及辅料、中药提取物、中药饮片、有兼用途径的制剂等
问题：
1、首次纳入微生物限度标准的部分产品是否能够符合要求？
2、要求无菌的药品怎样平衡生产与安全的关系？
无菌检查法
?主要的修订内容
–合并一部、二部、三部的无菌检查法–无菌检查环境以及确认方法
–无菌检查的培养基
–薄膜过滤法的滤器选择
–附表的内容
?合并一部、二部、三部的无菌检查法–需要将一部、二部、三部的内容进行整合，形成一个统一的附录方法
–取样量、接种方式和培养温度的内容目前暂时无法与一部、二部保持一致，拟以并列的方式同时收载–阳性对照的有关规定应以二部原收载的内容为基础进行修订完善
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
微生物学检验 1、微生物的分类：（三型八大类)**全部是重点** 三型八大类特点 非细胞型微生物病毒、亚病毒和朊粒无细胞结构，结构最简单，体积最微小，能通过滤菌器； 单一核酸； 活细胞内寄生。 自我复制方式进行增殖 原核细胞型微生物细菌、放线菌、螺旋 体、支原体、衣原体、 立克次体 仅有原始核； 缺乏完整细胞器。 真核细胞型微生物真菌、原虫细胞核分化程度较高；有丝分裂进行繁殖；有多种完整细胞器。 2、（正常菌群）条件致病性微生物——临床上多引起内源性感染。 3、G+菌特有成分：磷壁酸（重要表面抗原，可用于细菌血清学分型）（外毒素） 4、G-菌特有成分：外膜层（由脂多糖（内毒素）、脂质双层（磷脂）、脂蛋白） 5、G+菌和G-菌细胞壁的共同成分是肽聚糖。结构由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥（G-菌无。是溶菌酶、青霉素作用部位） 6、细菌的主要遗传物质：核质（染色体）、质粒（存在于胞质，双链闭合环状DNA分子）、转位因子 7、细菌特殊结构：荚膜（保护，致病，抗原性，鉴别）、芽胞、鞭毛（运动器官）、菌毛（普通菌毛—粘附，致病性；性菌毛—接合方式转移遗传物质） *将芽胞是否被杀死而作为判断灭菌效果的指标 8、L型（细胞壁缺陷）菌落：①“油煎蛋”（荷包蛋）样菌落（典型L型细菌）。 ②颗粒型菌落（简称G型菌落）③丝状菌落（简称F型菌落）。高渗环境生长。（环丙沙星）
9、自营菌：以无机物为原料；异营菌(腐生菌：以无生命的有机物质为营养物质；寄生菌：以宿主体内有机物为原料),所有致病菌都是异营菌。 10、细菌营养物质：水、碳源、氮源、无机盐类和生长因子。 11、细菌个体的生长繁殖方式：无性二分裂，在对数期以几何级数增长 12、细菌分类（伯杰）等级依次为界、门、纲、目、科、属、种（最小分类单位）。 13、常用的细菌培养方法是：需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法； 14、通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置于空气或含5%～10%CO2的气缸中培养，大部分细菌可于24～48h生长良好。 15、血清学诊断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，抗体效价呈4倍或以上增长才有价值。 16、透射电子显微镜适于观察细菌内部的超微结构；扫描电子显微镜适于对细菌表面结构及附件的观察。 17、细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→初染→染色（媒染）→（脱色）→（复染，使脱色菌体着色）。 18、胃部细菌喜酸，肠道细菌喜碱 19、SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。 20、碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。 21、痰标本：血平板、中国蓝／麦康凯、巧克力平板作分离。 22、中国蓝／麦康凯用于筛选G-杆菌； 23、含杆菌肽的巧克力平板（含有V和X因子）用于筛选嗜血杆菌 24、连续划线分离法：杂菌不多的标本。 分区划线分离法：杂菌量较多的标本。 25、斜面接种法：该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性 26、倾注平板法：牛乳、饮水和尿液细菌计数 27、涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
精心整理 摘要： 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 体积，是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重
量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 取一 5为（ 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母
（activity dry yeast,ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。 比浊法： 微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸 公司的紫外 OD600 或数法 血球计数板法: 血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
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验 证 文 件
目 录
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适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
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验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
微生物学检验 2、（正常菌群）条件致病性微生物——临床上多引起内源性感染。 3、G+菌特有成分：磷壁酸（重要表面抗原，可用于细菌血清学分型）（外毒素） 4、G-菌特有成分：外膜层（由脂多糖（内毒素）、脂质双层（磷脂）、脂蛋白） 5、G+菌和G-菌细胞壁的共同成分是肽聚糖。结构由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥（G-菌无。是溶菌酶、青霉素作用部位） 6、细菌的主要遗传物质：核质（染色体）、质粒（存在于胞质，双链闭合环状DNA分子）、转位因子 7、细菌特殊结构：荚膜（保护，致病，抗原性，鉴别）、芽胞、鞭毛（运动器官）、菌毛（普通菌毛—粘附，致病性；性菌毛—接合方式转移遗传物质） *将芽胞是否被杀死而作为判断灭菌效果的指标
8、L型（细胞壁缺陷）菌落：①“油煎蛋”（荷包蛋）样菌落（典型L型细菌）。②颗粒型菌落（简称G型菌落）③丝状菌落（简称F型菌落）。高渗环境生长。（环丙沙星） 9、自营菌：以无机物为原料；异营菌(腐生菌：以无生命的有机物质为营养物质；寄生菌：以宿主体内有机物为原料),所有致病菌都是异营菌。 10、细菌营养物质：水、碳源、氮源、无机盐类和生长因子。 11、细菌个体的生长繁殖方式：无性二分裂，在对数期以几何级数增长 12、细菌分类（伯杰）等级依次为界、门、纲、目、科、属、种（最小分类单位）。 13、常用的细菌培养方法是：需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法； 14、通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置于空气或含5%～10%CO2的气缸中培养，大部分细菌可于24～48h生长良好。 15、血清学诊断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，抗体效价呈4倍或以上增长才有价值。 16、透射电子显微镜适于观察细菌内部的超微结构；扫描电子显微镜适于对细菌表面结构及附件的观察。 17、细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→初染→染色（媒染）→（脱色）→（复染，使脱色菌体着色）。 18、胃部细菌喜酸，肠道细菌喜碱 19、SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。 20、碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。 21、痰标本：血平板、中国蓝／麦康凯、巧克力平板作分离。 22、中国蓝／麦康凯用于筛选G-杆菌； 23、含杆菌肽的巧克力平板（含有V和X因子）用于筛选嗜血杆菌 24、连续划线分离法：杂菌不多的标本。 分区划线分离法：杂菌量较多的标本。 25、斜面接种法：该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性 26、倾注平板法：牛乳、饮水和尿液细菌计数
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表2培养基
表3对照用培养基 表4试剂 稀释液： （1）pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。 （2）0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。 （4）靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入 5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证 将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。 经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。 2、适用性检查 2.1细菌、霉菌、酵母菌 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72