RFLP和RAPD遗传标记技术及其在昆虫学中的应用*
陈 辉(西北林学院,陕西杨凌 712100)
80年代以来,伴随着分子生物学技术和生化技术的发展和完善,使生物遗传学、分子生物学、基因工程等学科的研究迅速深入,极大地丰富了人类对生命过程和本质的认识。同时,以DNA遗传标记为代表的分子生物学研究技术,为生物分类学、系统学、遗传学、分子生态学提供了许多新的研究技术和方法,使人类可以通过对目标生物DNA分子特异位点或基因片段的分子标记,实现对生物遗传表型差异的控制、重组和鉴定,以及从分子角度研究生物生态机制。RFLP和RAPD技术是生物DNA遗传标记中最为重要的研究手段,自诞生之日起就倍受青睐,广泛地应用于各生物类群的分子生物学研究。然而,作为自然界种类和数量最多、生长繁殖最为迅速的昆虫,由于其种类繁多、生殖方式的多样化和多样的生存适应性变异和进化等特点,使昆虫遗传基础研究相对薄弱。建立在DNA水平上的分子标记技术的出现,为昆虫遗传图谱的构建、系统发育关系的分析、昆虫分子适应机制的探索、昆虫抗菌多肽的鉴定、昆虫防治技术的提高以及植物抗菌基因工程的发展和应用开辟了一条新的途径。
1 RFLP标记技术原理和特点
限制性内切酶切片长度多态性(Restric-tio n Frag ment Length Po lymo rphism,简称RFLP),是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的大分子片段的大小差异,这种技术是伴随分子杂交、放射性自显影技术而产生的,主要用于生物遗传连锁图的构建、遗传系谱分析和数量遗传研究等方面。
1.1 RFLP标记的原理
由于生物在长期进化适应的过程中,在种、属间甚至在品种间同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点出现差异,或者由于生物突变、重组等原因引起核苷酸发生替换、插入或缺失等,使同源生物限制性内切酶识别位点发生变化。这样生物DNA经适当限制性内切酶切割形成长度不同的片段,加之电泳迁移率的不同,就会形成不同的DNA 片段谱带模型,通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射性显影,便能得到DNA的限制性片段多态性,从而构建生物DNA指纹图谱,为生物种、属间亲缘关系、系统发育关系和生物演化提供有力的证据。1.2 RFLP标记的特点
由于RFLP起源于生物基因组DNA的自然变异,使之一方面不受显影性关系、生物所处的生态环境和生物不同发育阶段、器官的影响,具有稳定遗传和专一性的特点;在数量上不受限制,可随机选取能代表整个基因组的RFLP标记,且每个标记变异大,检测方便;用于探测RFLP的克隆探针可随机选择,可以是核糖体DNA,也可以是总DNA。另一方面,RFLP的等位基因具有共显性的特点,所以被广泛应用于多种生物的分析和指纹图谱的构建;RFLP具有种族特异性,对于分析一个分离群体的染色体片段具有重要
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陕西林业科技 N o.1,1999,pp.49～52 本文经西北农业大学袁锋教授审阅,特此致谢!
价值,RFLP也是进行有益基因的分子标记定位、数量性状微效基因的质量化、杂交优势的理论探讨和预测的有效手段,为昆虫生理学、昆虫分子生物学和昆虫分子生态学的研究提供了新的技术。
但是,RFLP标记也有其不足,主要表现在大分子染色体DNA标记时,各种长度的DNA片段在电泳胶片上相互交盖,连成一片不能分辨,所以必须借助分子杂交手段,将某一标记的DNA片段作为探针进行分子杂交,使与探针有同源性的片段实现检测,这样造成RFLP技术操作复杂繁琐和放射性危害。目前人们正在致力于寻找多功能的探针并试图将PCR和RFLP技术结合,使识别后的基因片段扩增以获得清晰的DNA谱带。
2 RA PD标记的原理和特点随机扩增多态DNA(Random Amplified Po lymo rphic DNA,简称RAPD)是J. Williams和J.Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种随机引物扩增,寻找多态DNA片段的遗传标记技术,它是建立在PCR技术基础上,以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物,对基因DNA进行扩增而显示DNA图谱和对物种进行亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别,以及分子生物学、分子生态学的研究。
2.1 RAPD标记的原理
RAPD标记是以人工合成的各种核苷酸为引物,在一种热稳定DNA多聚酶(T aq po lymerase)的作用下,通过DNA多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reactio n,简称PCR)技术扩增DNA片段,用电泳分离各种不同引物诱导产生的各种长度的DNA后,根据生物产生的DNA多态性进行分析和鉴定。
2.2 RAPD标记的特点
RAPD标记的一个明显的特点使RA PD引物无特异性,可以用未知序列的基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段,且RAPD所需引物较短,10个左右的寡核苷酸即可,引物可以人工合成,也可以购买现成的商品;其次,一套引物可用于不同生物,建立一套标准引物,便可用于生物种内多态性鉴定。由于DNA 扩增仪的使用,使操作自动化程度高,分析量大,免去了RFLP中制备探针、同位素标记、Southern印迹法及分子杂交等步骤,从而构成了RAPD分析速度快,所需DNA样品少等优点。尤其使RAPD标记可以在对生物种没有任何分子生物学研究基础的情况下,对物种进行基因组DNA指纹图谱的构建。
但是,由于RAPD是一种显性标记,所以不能区分一个位点扩增的DNA片断是纯合的还是杂合的。另外,RAPD标记技术的再现性差,这就要求研究者对不同物种作大量的摸索工作,以确定每一物种的最佳引物和实验条件。
3 R FL P和RA PD标记技术在昆虫学研究上的应用
由于RFLP和RAPD遗传标记技术的众多优点,使之一出现就引起广泛的重视,并被广泛的应用于生物学各研究领域。Welsh (1991)用三个引物对白鼠8个品系进行多态性分析;Shuichi(1992)研究11个水稻品系的RAPD扩增片段的多态性,并获得11个品系的相对遗传距离;Halw ard(1992)用RA PD研究花生品系之间进化的关系。
3.1 DNA遗传标记在昆虫分类学中的应用
物种的进化本质是基因的进化,所以分子分类学(M olecular Systematics)可以在DNA水平上更准确地甚至是定量地分析物种的进化程度、遗传距离和系统发育。Black 等(1992)首先将RAPD技术用于4种蚜虫的鉴别比较,他们采用4种10个碱基的随机
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引物对四种蚜虫进行RAPD反应,检测其扩增产物的多态性。结果表明:根据电泳谱带可以区分四个种。同时,检测种内不同生物型以及同一生物型内不同个体扩增产物的多态性,种群内不同个体之间扩增产物的多态性。另外,Black等用RAPD技术检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂,并对RAPD寄生的可靠性等作出了有价值的评价。Black等(1993)应用RDNA的IGS基因探针进行RFLP分析,对目前已知的杂食性麦蚜9个小种(A—1)的生化型作了鉴别,证实了美洲食麦蚜起源于欧亚大陆,解决了美州食麦蚜与欧亚大陆食麦蚜之间的亲缘关系。Osaka-ba等(1994)利用rDNA在进化上的保守性,将哺乳动物小鼠的rDNA用于珠形蟥(Panonychus)3个近缘种的系统关系的研究,证明了P.mor i与P.citri亲缘关系十分接近,为两个独立的种。
3.2 DN A遗传标记技术在昆虫分子生态学研究中的应用
分子生态学是从基因水平研究生物之间的关系和生物与环境之间的关系。目前, DNA遗传标记技术已被用于昆虫个体遗传标记;昆虫生殖策略、种群间迁移扩散关系、种群内遗传变异程度和种群间遗传分化程度的研究。
Blanchetot(1992)利用M13噬菌体DNA 探针和珠蛋白基因重复序列探针,研究苜蓿切叶蜂(Megachile r otund ata)的生殖策略,证明了每巢中的后代基本来自单一雌性,且在大多数情况下雌性只与单一雄性交配。Lu (1994)将DNA重复序列标记技术应用于秋粘虫(S p odop ter a f r agip er da)的研究。该物种两个种群的分布区有部分重叠,其中一个种群嗜食玉米,另一个种群则以水稻和饲料用草为食。结果表明:DNA重复序列标记技术能将两个在形态上无法区分的种群完全的划分开。同时,对秋粘虫种群迁飞、种群结构和生殖行为等也作了研究。
3.3 DNA遗传标记在害虫防治中的应用
DNA遗传标记技术为揭示有害昆虫食物链各环节的相互关系提供了一种有效的分析方法和技术,使人们能够从生物之间营养、能量、信号的相互制约和依赖关系达到对目标昆虫种群的控制。
Blanchetot(1993)利用DNA遗传标记技术研究了非洲稚虫和中间寄主非洲舌蝇之间的遗传依赖关系,以及非洲舌蝇自交系和基因连锁图谱,为非洲舌蝇的生物防治靶目标的设计提供了依据。Raymo nd(1991)用此技术研究了库蚊(Culex p ip iens)对有效磷农药抗性产生和扩散的机制,证明导致库蚊抗性产生的酯酶B2基因的扩散具有单一起源,并通过迁飞扩散到不同地区。
此外,国内外众多研究者将DNA遗传标记技术应用于昆虫对化学农药的敏感和抗性基因的筛选、昆虫抗药性产生的机制、害虫的基因防治、抗虫基因植物的人工构建等多方面。Rohm(1987)利用T i质粒为载体成功地将苏云金杆菌的 内毒素基因(Bt基因)转入烟草中;Davis(1989)和McCow n(1991)将抗虫Bt基因导入番茄和杨树中;卞学渝、韩一凡(1997)利用RAPD技术对杨树抗云斑天牛基因连锁标记筛选,为抗虫植物的人工构建奠定了基础。
3.4 DNA遗传标记技术在昆虫分子生物学中的应用
由于昆虫分子生物学是从基因或分子水平研究和揭示昆虫生长、繁殖以及种群构成的机制,所以RFLP和RAPD标记技术在昆虫分子生物学中得到广泛的应用。
Benedict(1993)用果蝇Hsp70基因编码区为遗传标记探针,克隆了中美洲疟蚊(A nop heles albimanus)的热休克基因,从基因与昆虫谷胱甘肽S转氨酶的活性研究了昆虫对杀虫剂的抗药性。Kum ar(1995),M ckey
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(1995)和Salazr(1994)分别利用RAPD技术对蚊虫酯酶基因、淀粉水解酶基因和5SRNA基因、果蝇蛋白质二硫键异构酶 基因和按蚊细胞骨架肌动蛋白质基因进行了定位研究。Skinner(1991)用DNA遗传标记技术从烟草天蛾(Manduca sex ta)、甜菜夜蛾(Sp odop tera ex igue)、烟芽夜蛾(H elothis Virescens)的血淋巴中分离到7种麻痹多肽的基因;Maeda(1989)、Eldridg e(1992)已将昆虫利尿激素基因和保幼激素酶基因用于基因工程杆状病毒;Kaw ano(1992)从家蚕和美洲棉铃虫中分离到两种激活性外激素生物合成神经肽的基因。
RFLP和RAPD遗传标记技术,是直接为农林业生产及生物工程技术等服务的基础性工作。此技术在昆虫学中的成功应用,必将极大地提高昆虫分类学、昆虫分子生物学及昆虫分子生态学研究的水平,为昆虫资源的利用和昆虫生物多样性的保护产生巨大的经济效益和生态效益,也将带动整个昆虫学及相关学科的高速发展。
参 考 文 献
1 W illias,J.G.K.,K ubelik,A.R,et al.D NA Po ly-mo rphism amplified by arbit rar y pr imer s ar e useful as g enetic mar kers.Nucl.A cids R es.
1990,18(22):6531～6535
2W elsh,J.,M cClelland,M,F inger printing
g enomes using PCR w it h arbit rar y pr imer s.N u-
cl.A cids R es.1990,18(24):7213～7218
3 W elsh,J,P eter sen C,M cClelland,M.Po ly mor-phism g enerat ed by arbit rar ily prim ed PCR in t he mouse.Nucl.A cids Res.1991,19(2):303～306
4 Shuichi,F.,K azuyo shi,H,et al.U se o f r ando m am plified po ly mor phic DN A s(R AP Ds)fo r iden-tificatio n o f r ice accessio ns,Jpn.J.G enet,1992, 67:243～252
5 Halw ard,T.,Stalker,T,et al.U se o f sing le-
pr imer DN A amplifications in genetic studies of peanut.P lant.M o l.Biol,1992,18(2):315～326 6 Black I V,W.C.,et al.U se of the random ampli-fied polymo rphic DN A polymer ase chain r eac-tion(R A PD-PCR)to detect DN A polym or phisms in aphids.Bull.Ento mol,R es.1992,82:151～159 7 Black IV,W.C,V ar iation in t he ribo lsmal R NA cist ro n among host-a dapted ra ces o f an aphid.
I nsect.M ol.Bio l,1993,2(2):59～69
8 Osakaba,M h,Sa kag ami,Y.P FL P analy sis o f ri-boso mal DN A in sibling species o f spider mit e.
I nsect.M ol.Bio l,1994,3(1):63～66
9 Blancheto t,A.DN A finger pr inting a nalysis in t he So litar y bee M egachile ro tundata.Geno me.
1992,35:681～688
10L u,Y.J.et al.M olecular char act erization of str ain specific repeated DN A sequence in the fall
a rmy wo rm.Insect M ol.Bio l,1994,3(2):123～
130
11Blanchetot,A.,G oo ding,R.H.Genetic analysis by DN A fing er pr inting in t setse fly geno mes.In-sect.Bio chem.M o l.Biol.1993,23(8):937～944 12Ra ymo nd,M.,Callaghan,A.Wo rldwide migr a-tion o f amplified insecticide r esistance genes in m osquit oes.N atur e,1991,350:151～153
13Dav is,J.M.,K eathley,D.E.Detectio n and anal-y sis o f T-DN A in cr ow n tumo rs and K an-namy cin-r esist ant callus o f Ro binia Pseudo acaci-
a.Can.J.F or.Res,1989,19(9):1118～1123
14M cCow n,B.H.,M cCae,D.E.et al.St able t ransfor mation of po pulus a nd incor por atio n of pest resistance by electric dischar g e part icle ac-celerat ion Plant Cell Repo rts.1991,9(10):590～594
15仆学贤,陈忠平等.农杆菌对毛白杨的转化及完整转化植株的获得.植物学报,1991,33(3):206～213
16阎隆飞,张玉麟.分子生物学.北京:北京农业大学出版社,1993.434～438
17鲁亮,归鸿.PA PD技术的特点及其在昆虫分类中的应用.昆虫学报,1995,38(1):117～122
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分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
RFLP和RAPD遗传标记技术及其在昆虫学中的应用* 陈 辉(西北林学院,陕西杨凌 712100) 80年代以来,伴随着分子生物学技术和生化技术的发展和完善,使生物遗传学、分子生物学、基因工程等学科的研究迅速深入,极大地丰富了人类对生命过程和本质的认识。同时,以DNA遗传标记为代表的分子生物学研究技术,为生物分类学、系统学、遗传学、分子生态学提供了许多新的研究技术和方法,使人类可以通过对目标生物DNA分子特异位点或基因片段的分子标记,实现对生物遗传表型差异的控制、重组和鉴定,以及从分子角度研究生物生态机制。RFLP和RAPD技术是生物DNA遗传标记中最为重要的研究手段,自诞生之日起就倍受青睐,广泛地应用于各生物类群的分子生物学研究。然而,作为自然界种类和数量最多、生长繁殖最为迅速的昆虫,由于其种类繁多、生殖方式的多样化和多样的生存适应性变异和进化等特点,使昆虫遗传基础研究相对薄弱。建立在DNA水平上的分子标记技术的出现,为昆虫遗传图谱的构建、系统发育关系的分析、昆虫分子适应机制的探索、昆虫抗菌多肽的鉴定、昆虫防治技术的提高以及植物抗菌基因工程的发展和应用开辟了一条新的途径。 1 RFLP标记技术原理和特点 限制性内切酶切片长度多态性(Restric-tio n Frag ment Length Po lymo rphism,简称RFLP),是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的大分子片段的大小差异,这种技术是伴随分子杂交、放射性自显影技术而产生的,主要用于生物遗传连锁图的构建、遗传系谱分析和数量遗传研究等方面。 1.1 RFLP标记的原理 由于生物在长期进化适应的过程中,在种、属间甚至在品种间同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点出现差异,或者由于生物突变、重组等原因引起核苷酸发生替换、插入或缺失等,使同源生物限制性内切酶识别位点发生变化。这样生物DNA经适当限制性内切酶切割形成长度不同的片段,加之电泳迁移率的不同,就会形成不同的DNA 片段谱带模型,通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射性显影,便能得到DNA的限制性片段多态性,从而构建生物DNA指纹图谱,为生物种、属间亲缘关系、系统发育关系和生物演化提供有力的证据。1.2 RFLP标记的特点 由于RFLP起源于生物基因组DNA的自然变异,使之一方面不受显影性关系、生物所处的生态环境和生物不同发育阶段、器官的影响,具有稳定遗传和专一性的特点;在数量上不受限制,可随机选取能代表整个基因组的RFLP标记,且每个标记变异大,检测方便;用于探测RFLP的克隆探针可随机选择,可以是核糖体DNA,也可以是总DNA。另一方面,RFLP的等位基因具有共显性的特点,所以被广泛应用于多种生物的分析和指纹图谱的构建;RFLP具有种族特异性,对于分析一个分离群体的染色体片段具有重要 Shaanxi Fo rest Science and T echnolog y 陕西林业科技 N o.1,1999,pp.49～52 本文经西北农业大学袁锋教授审阅,特此致谢!
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
遗传学及其应用 阮庆丰 2013年11月10日 摘要 遗传学是20世纪兴起的一门年轻而又发展迅速的学科，随着研究的进展，它的分支已渗入到生物科学的所有领域，成为现代生物学的中心和带头学科。它既是生物学中的一门基础理论学科，同时又是应用性非常强的的一门课程。遗传学新理论、新技术、新成果层出不穷，而新成果又快速的转化为生产力。如遗传工程技术已成为世界多国的支柱产业，而基因诊断和基因治疗等正在为人类展示出美好的前景。这一切也向人们展示，21世纪的遗传学是一个极具活力的学科，它将带动整个生命科学迅速发展，使人类支配和主宰生命世界的能力再有一个巨大的飞跃。本文主要从遗传学的发展史，遗传学的基础和原理以及遗传学在遗传标记方面的应用三个方面，阐述了遗传学的发展和遗传学在生活中的实际应用。 关键词：遗传学发展史原理基础遗传标记 1．遗传学的概念及发展史 1．1遗传学的基本概念 遗传学是研究生物遗传和变异的科学，是生命科学最重要的分支之一。遗传和变异的生物界最普遍和最基本的两个特征。所谓遗传（heredity）,是指亲代与子代之间相似的现象；变异（variation）则是指亲代与子代之间存在的差异。
1．2遗传学的研究对象和任务 遗传学所研究的主要内容是由细胞到细胞、由亲代到子代，亦即由世代到世代的生物信息的传递，而细胞及所含的染色体则是生物信息传递的基础。 遗传学研究的任务在于：阐明生物遗传和变异的现象及其表现的规律；探索遗传和变异的原因及其物质基础，揭示其内在的规律；从而进一步指导动物、植物和微生物的育种实践，防治遗传疾病，提高医学水平，造福人类。 1．3遗传学发展简史 人们在古代从事农事生产过程中便注意到遗传和变异的现象。春秋时有“桂实生桂，桐实生桐”，战国时又有“种麦得麦，种稷的稷”的记载。这说明古代人民对遗传和变异有了粗浅的认识。但直到19世纪才有人尝试把积累的材料加以归纳、整理和归类，并用理论加以解释，对遗传和变异进行系统的研究。总结起来，遗传学的诞生和发展经历了以下阶段： 一、遗传学的诞生 拉马克的“用进废退学说”和“获得性遗传假说”→达尔文的“泛生论学说”→魏斯曼的“种质学说”→孟德尔的“遗传因子假说”→遗传学正式成为一门独立的学科 二、遗传学的发展 (一)经典遗传学的发展 摩尔根的连锁遗传定律→人工诱变→群体遗传、数量遗传和杂种优势理论的确立→遗传物质是DNA或RNA的证实→“一个基因一个酶”学说 (二)现代遗传学的发展 分子遗传学的诞生和发展→基因表达调控的研究→重组DNA技术的诞生和发展→基因多样性的确立→基因组计划的启动和应用 遗传学100余年的发展历史，充分的说明遗传学是一门发展极为迅速的学科，无数事实说明，遗传学的发展正在为人类的未来展示出无限美好的前景。 2.遗传学的原理及基础 2.1遗传学的基本原理 通过前人的观测与实验以及后人对这些实验的总结和验证，遗传学家们已把各种基本概念作为遗传学的原理而建立起来。这些原理有诸如：
分子标记在果树上的应用及前景展望 分子标记指可遗传并可检测到的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记主要是指同工酶、等位酶、贮藏蛋白等等，本文主要介绍DNA标记。理想的分子标记应具有以下几个条件： ①以孟德尔方式遗传。 ②多态性好，自然条件下存在许多变异位点。③遍布整个基因组，能够检测到整个基因组的变异。 ④共显性遗传，即可以区别纯合体和杂合体。⑤表现“中性”，即不影响目标性状的表达。⑥重复性好，便于资源共享。⑦自动化程度高。近年来，关于分子标记的研究进展很快，本文仅就分子标记在果树研究中的应用及存在问题做一介绍，并对应用前景做一展望。 一、分子标记在果树研究中的应用： 1.分子标记在种质资源研究中的应用。 （1）系谱分析和分类。物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。遗传关系越近，基因组DNA的差异越小，反之，差异越大。HARADAT等用RAPD标记对两个三倍体苹果品种“乔纳金”和“陆奥”进行了分析，结果表明，作为母本的金冠提供了减数的二倍体配子。沈向等对杏进行了RAPD分析，将41个品种分为5类。 （2）种质保存和核心种质的建立。如何事理有效地管理和利用种质资源，当今世界出现了两种趋势，其中之一就是建立核心种质。目的是以最少的种质样品重复而最大地包含一个种及其野生种的遗传多样性。分子标记为人们提供了一个有效、快速的途径。目前已建立的核心种质涉及到谷物、豆类、牧草、蔬菜和果树等。AMY K SZEWC-MCFADDEN等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质，HOKANSON等也建立了苹果核心种质。 （3）构建指纹图谱和品种鉴别。高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。特别是对于无性繁殖的果树来说，同物异名、同名异物现象很严重，利用分子标忘本中高效、准确地建立指纹图谱、鉴别果树品
遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记 细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记 生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记 分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达
遗传标记在动物遗传育种的应用 摘要：遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，在重组实验中多用于测定重组型和双亲型。其功能不一定研究得很清楚但因突变性状是明确的，所以容易测定。对于微生物虽多用与生化性状有关的基因，但对高等生物则多用与形态性状有关的基因。也有用着丝粒作为遗传标记的。但在动物遗传育种的应用广泛，并随着科学技术的发展一直不断进步，使得遗传育种的效率和精确性不断增强，也使遗传育种的性状监测更加详细。主要总结概述遗传标记在动物遗传育种的应用。 关键词：遗传标记动物遗传育种 遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。在重组实验中多用于测定重组型和双亲型。作为标记基因，其功能不一定研究得很清楚但因突变性状是明确的，所以容易测定。对于微生物虽多用与生化性状有关的基因，但对高等生物则多用与形态性状有关的基因。也有用着丝粒作为遗传标记的。在微生物遗传学中遗传标记还区分为选择性标记(或称选择性基因)和非选择性标记或称选择性基因)二类。遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记包括形态学标记(morphological marker)、细胞学标记(cytological marker)、生物化学标记(biochemical marker)、免疫学标记(Immune Genetic Markers)和分子标记(molecular marker)五种类型。 利用标记来选择和培育动物具有悠久的历史。自从19世纪中期，奥
地利学者孟德尔首创了将形态学性状作为遗传标记的应用先例以来，遗传标记得到发展和丰富。形态学标记、细胞学标记、生化标记、免疫学标记等一直被广泛应用，然而这些标记都无法直接反映遗传物质的特征，仅是遗传物质的间接反映，且易受环境的影响，因此具有很大的局限性。DNA作为遗传物质的载体，是研究动物遗传特性的一个重要指标。20世纪80年代以来，随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子克隆及DNA重组技术的日趋完善，研究者对基因结构和功能研究的进一步深入，在分子水平上寻找DNA的多态性，以此为标记进行各种遗传分析。DNA分子标记直接反映DNA水平上的遗传变异，能稳定遗传，信息量大，可靠性高，消除了环境影响。DNA水平的遗传标记自产生以来得到广泛应用。遗传标记的应用对遗传学发展起了重要作用，遗传三大定律的发现和哺乳动物连锁群的建立，都是以遗传标记作为工具来进行遗传分析的。 1.1形态学标记(morphological marker) 形态学标记是指肉眼可见的或仪器测量动物的外部特征 (如毛色、体型、外形、皮肤结构等)，以这种形态性状、生理性状及生态地理分布等待征为遗传标记，研究物种间的关系、分类和鉴定。形态学标记研究物种是基于个体性状描述，得到的结论往往不够完善，且数量性状很难剔除环境的影响，需生物统计学知识进行严密的分析。但是用直观的标记研究质量性状的遗传显得更简单、更方便。目前此法仍是一种有效手段并发挥着重要作用。 主要包括：
遗传标记的发展和应用 1 遗传标记的种类 遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。 随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。AFLP标记可能为显性或共显性。SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置
染色体遗传标记 一：基因位点的标记： ?基因所在的染色体。第一个数字表明基因所在的染色体。性染色体用X或Y表示。 ?所在染色体的臂。P是短臂，q是长臂。 ?基因在p或q臂上的位置。基因的位置基于染色体某种特定染色下的亮带和暗带的标准形式。通常用两位数命名（代表区和带），有时后面跟着一个小数点和一个或多个小数（代表亮带或暗带内的亚带）。数字的大小表示离着丝粒的距离。 ?有时，缩写“cen”或“ter”也用于描述基因的位置。“Cen”指基因离着丝粒非常近。“Ter” 代表端粒，表明基因非常靠近p或q臂的末端。 二：染色体和染色体异常的标记 46,XX ：正常女性核型 46,XY：正常男性核型 46,XX,del(14)(q23) ：有46条染色体，女性，14号染色体长臂2区3带缺失。 46,XY,dup(14)(q22q25) ：有46条染色体，男性，14号染色体长臂重复累及2区2带至5带。 46,XX,r(7)(p22q36) ：有46条染色体，女性，7号染色体环。短臂末端（p22）与长臂末端（q36）融合形成环。 47,XY,+21 ：有47条染色体，男性，额外染色体为21号。 不夸张的说，畸形的类型有几百万。以下是一些术语的代码： add =原因不明的额外物质 del = 缺失 de novo = 不是遗传的染色体畸形 der = 衍生染色体 dic ＝双着丝粒 dup = 重复 fra = 脆性位点
idic =具同形双着丝粒的染色体 ins = 插入 inv = 倒位 i or iso =等臂染色体 mar =标记染色体 mat = 母体起源 Minus sign (-) =减号(-),放在染色体号前面表示失去整条染色体,放在染色体号后面表示该染色体变短 mos = 镶嵌型 p = 染色体的短臂 pat = 父本 Plus sign (+) =加号(+),放在染色体号前面表示增加整条染色体,放在染色体号后面表示该染色体加长 q = 染色体长臂 r = 环状染色体 rcp = 互逆 rea = 重排 rec ＝重组染色体 rob =罗伯逊易位:是指D组与G组10个染色体之间的一种特殊类型的易位,过去又称为着丝粒融合 t = 异位 tel = 端粒 ter = 染色体的终点 upd =单亲二体一对染色体(均来自父或母) ? = 不明确
分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。 分子标记辅助育种示意图 DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的类型 分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指
纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。 分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 各种分子标记的原理和优缺点 第一代分子标记：RFLP RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。 RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA 所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P32)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。 优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。
2004年2月甘肃农业大学学报第39卷第1期92～96 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY 双月刊遗传标记技术在动物育种中的研究进展 马彬云，吴建平 （甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070） 摘要：随着生物科学的不断发展，遗传标记辅助选择（MAS）已经在动物改良中获得了较大的遗传进展，其中最关键的环节是识别有效的遗传标记，即这一标记应与控制这些数量性状的基因（QTL）处于连锁不平衡（linkage disequilibrium）状态。就目前遗传标记技术在动物遗传育种中的研究进展进行了综述，并展望了遗传标记技术在该领域的应用前景，以期引出这一技术可能存在的一些问题以供思考。 关键词：MAS；遗传标记；分子标记；动物育种；QTL 中图分类号：S 813.3 文献标识码：A 文章编号：1003-4315(2004)01-0092-05 Research progress of genetic maker technology in animal breeding MA Bin-yun，WU Jian-ping （College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Gansu, Lanzhou 730070, China） Abstract:With the development of Bio-science, Genetics Makers-assisted Selection (MAS) has already obtained prominent genetic progress in animal breeding, in which the key aspect is the identification of useful genetic markers that ought to be in linkage disequilibrium with the major gene which dominates Quantitative Trait Locus (QTL). The paper reviews the application perspective of the technology in the field of animal breeding. Key words：genetic marker；molecule marker；animal breeding；QTL 在动物遗传育种中应用遗传标记（genetic markers）为动物育种高效而精确地选择目标基因型开辟了新道路，也使传统的育种工作跨上了新台阶，从而使可望识别具有优良基因的种畜个体，提高选择强度，缩短世代间隔，以期获得最大的遗传进展已成现实。在家畜育种中尤其对于限性性状、低遗传力性状及难以测量的性状，应用标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS），其优越性就更为明显[1]，可显著地提高选择的有效性及遗传改进量。 1 遗传标记技术的研究进展 生物的系统分类，物种的起源和进化，种群遗传结构考察以及生物多样性分析等研究都涉及到遗传分析，遗传分析需要有效的遗传标记。对动物进行MAS亦必须找到恰当的遗传标记。 80年代以来，随着分子生物学的发展，分子克隆技术和DNA重组技术的日趋完善，特别是PCR技术和新的电泳技术的产生，使各种分子遗传标记应运而生，给动物遗传育种工作带来了新的生机和革命性的变化。 1.1 遗传标记辅助选择（MAS） 在动物的遗传育种中，标记辅助选择的出现是伴随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的发展而不断得到广泛的应用，并已经成为目前家畜选育和研究的热点。 标记辅助选择由于充分利用了表型、系谱和遗传标记的信息与只利用表型和系谱信息的常规选种方法相比，具有更大的信息量[2]。 目前，MAS在动物的选育中已取得了一些成功的事例，猪氟烷（halothane, HAL）基因和雌激素受作者简介：马彬云（1976－），硕士研究生，研究方向为动物遗传学和分子遗传学。
食安0801 02 邓凯 近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（genetic markers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。 分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点： ①多态性高； ②遍布整个基因 ③检测手段简单、迅速； ④无基因多效性； ⑤能够明确辨别等位基因； ⑥实验重复性好； ⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。 第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写 20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。目前有2种方法可进行DNA的RFLP 分析：一是根据其原理用RFLP的探针进行特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆；二是对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA 片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP标记呈孟德尔式遗传，大多数RFLP 的等位基因为共显性，在任何分离群体中能区分纯合基因型与杂合基因型。但该技术在 操作过程中涉及了DNA的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，且分析中需要的DNA量大，因此在很大程度上限制了RFLP技术的应用。 第2代分子标记（以PCR技术为核心）包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）、TRAP（Target Region Amplification Polymorphism，目标区域扩增多态性）等分子标记。利用PCR技术的忠实性、效率和特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作，同时也降低了对样品数量和质量的要求，通常用几十纳克（ng）以内的DNA样品就可满足分析的需要。这对于分子标记辅助育种、QTL定
SSR标记技术和ISSR 标记技术雷世勇 2.1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个多为1～5 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即 CA n和 TG n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例 ――鹅掌楸种属及杂种的分子标记北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSR 标记的应用目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、
水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单；4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理：用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例 ――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测：从