桑叶的提取及其抗氧化性的研究
摘要
桑叶是一种具有很高药用价值的植物，广西拥有很丰富的桑叶资源，可就近取材进行，进行桑叶总黄酮的提取及抗氧化活性研究。
本文采用超声波提取桑叶中的总黄酮，通过单因素实验研究桑叶总黄酮的提取条件，建立了合适的提取条件：提取浓度80%、料液比1：50、超声时间50min、超声温度80°C。在此条件下，通过实验可以得出桑叶总黄酮的提取率为4.01%。在单因素提取的基础上，开展了对桑叶总黄酮总还原力的测定,总黄酮对DPPH、羟基自由基（·OH）、以及超氧阴离子（O2-）的抗氧化性实验。得出对DPPH的清除率为80.2；对超氧阴离子（O2-）的清除率为53.60%；对羟基自由基的清除能力为32.69%。
关键词：桑叶；总黄酮提取；超声波；抗氧化研究
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Study on extraction and oxidation resistance of mulberry leaves
Chemical Engineering & amp; process level 2015 1 class Deng Qing Hu
Mentor Teacher WengYanying
Abstract
Mulberry Leaf is a kind of plant with high medicinal value, Guangxi has abundant mulberry leaf resources, which can be carried out in the nearest material, and the extraction and antioxidant activity of total flavonoids from mulberry leaves are studied. In this paper, the total flavonoids of mulberry leaves were extracted by ultrasonic wave, and the extraction conditions of total flavonoids from mulberry leaves were studied by single factor experiment, and the suitable extraction conditions were established: extraction concentration 80%, material liquid ratio 1:50, ultrasonic time 50min, ultrasonic temperature. Under this condition, it can be concluded that the extraction rate of total flavonoids from mulberry leaves is 4.01%. On the basis of single factor extraction, the total reduction force of total flavonoids in mulberry leaves was determined, and the total flavonoids were DPPH and hydroxyl radicals (· OH), and the antioxidant experiment of superoxide anion (O2-). The clearance rate of DPPH was 80.2, the clearance rate of superoxide anion (O2-) was 53.6%, and the scavenging capacity of hydroxyl radicals was 32.69%.
Keywords: mulberry leaf; total flavonoids extraction; ultrasonic; antioxidant study
目录
第一章 前言 2
1.1 研究意义及目的 2
1.2研究内容 3
第二章 实验部分 3
2.1实验仪器 3
2.2实验药品 3
2.3溶液的配制 4
2.4实验方法 5
2.4.1芦丁标准曲线的建立 5
2.4.2超声波提取 6
2.4.3桑叶总黄酮的测定 6
2.5桑叶总黄酮的单因素实验 6
2.5.1提取浓度对得率的影响 6
2.5.2料液比对得率的影响 7
2.5.3超声提取时间对得率的影响 8
2.5.4提取温度对得率的影响 8
2.6抗氧化活性研究 9
2.6.1桑叶总黄酮自身总还原力的测定 9
2.6.2对DPPH的清除作用 10
2.6.3对羟基自由基（·OH）清除率的影响 11
2.6.4对超氧阴离子（O2-）清除率的影响 12
第三章 总
结 13
结论 14
参考文献 14
致谢 15
第一章 前言
1.1 研究意义及目的
桑叶是一种具有非常高的药用价值的植物，是一种比较常见的中药材。它的气味偏淡，味道有轻微的苦涩。桑叶可以疏风散热，清肺，缓解干燥，并且可以明目清肝。桑叶中含有生物碱、多糖、黄酮氨基酸等多种活性物质，而黄酮类化合物是其主要的活性成分[1]。而本次所研究的黄酮类化合物是一种在植物界中广泛分布的天然化合物，它存在于植物中的根、茎、叶还有果实当中，是中草药的有效成分之一。根据统计，至今为止已经分离和经过鉴定的黄酮类化合物大约有四千多种[2]，它们大多数以游离苷元或者配糖体的形式广泛的分布在植物界中[3-5]。黄酮类化合物的种类非常繁多，但是大体可以分为黄酮类等八大类 [6-9]。许多学者通过大量的实验研究分析表明，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌以及抗糖尿病等多种功效。
近几年来，桑叶中总黄酮的研究得到了许多学者的广泛关注，例如田刚[10]等利用均匀设计法对超临界CO2流体提取桑叶总黄酮；张贵会[11]采用单因素实验，然后通过正交法优化研究并确立了新疆药桑叶中的黄酮类化合物的提取条件；贺伟强[12]等采用微波辅助水浸提法提取桑叶总黄酮。这些方法都取得了比较好的提取效果，但是超高压提取需要高压力，微波辅助提取功率过大，酶法提取步骤较为繁琐，酶提取所用时间长、温度高而且溶剂用量多，超临界提取成本较高且操作复杂，因此我们需要一种更简便且有效的提取方法。
本文采用超声波提取法提取，这种方法具有提取效率高、提取时间短、温度相对较低以及操作简单等优点，目前为止已有许多学者使用此方法来提取植物中的总黄酮。例如郑丽等[13]采用超声波法提取紫薯茎叶中的总黄酮并对其进行了工艺优化；刘招娣等[14]利用超声波辅助提取青刺果总黄酮；钟雨珅等[15]用超声波辅助法同时提取桑叶中的总黄酮、单宁。
目前，植物成分中的生物活性研究也越来越受到关注，而抗氧化活性便是很重要的一种。这些研究为寻找天然的抗氧化剂提供了有效的途径。总黄酮的抗氧化性主要体现在总黄酮对DPPH、·OH、以及超氧阴离子（O2-）等的清除能力以及它自身的总还原力。申静等[16]采用AlCl3比色法测定芳香新塔花总黄酮含量，并通过DPPH自由基法、羟基自由基法和测定总还原力的方法来评价它的抗氧化能力；为了得出桑叶茯砖茶总黄酮在体外的抗氧化活性，曾桥等[17]通过实验研究了其对DPPH自由基的清除能力、对羟基自由基的清除能力、对ABTS~+清除能力以及它自身的还原能力；罗海青等[18]
以芦丁作为对照品，采用Al(NO3)3·9H2O-NaNO2显色法以及紫外-可见分光光度法测定黄皮叶总黄酮的质量分数，并采用FRAP(Ferricion reducing antioxidant power)法对黄皮叶黄酮类成分的抗氧化活性进行评价。
1.2研究内容
本论文主要采用超声波提取桑叶中的总黄酮，通过研究不同提取剂浓度、料液比、超声时间以及超声温度对桑叶总黄酮提取率的影响，从而得到最优的提取条件。在最优条件下提取桑叶中的黄酮类化合物，将得到的提取液进行减压浓缩，计算得率，然后进行抗氧化活性研究。
研究桑叶总黄酮自身的还原能力、对DPPH的清除作用、对羟基自由基（· OH）的清除作用以及对超氧阴离子自由基的清除作用。
第二章 实验部分
2.1实验仪器
表1 实验仪器表
Table 1 Experimental Instrument table
仪器名称 型号/规格 生产地
电子天平 SQP 赛多利斯科学仪器有限公司
分析天平 YP5102 上海
紫外-可见分光光度计 A560 上海翱艺
超声波清洗器 KQ-300DB 上海越众
循环水式真空泵 SHZ-D(III) 上海越众
旋转蒸发器 RE-52CS 上海亚荣
恒温水浴锅 B-260 上海亚荣
数显恒温水浴锅 HH-S4 江苏省金坛市
离心沉淀器 802 江苏省金坛市
密封型手提式粉碎机 CLF-02 浙江省温岭市
电热恒温鼓风干燥箱 DF-101S 上海
PH计 PHS-3C 上海佑科仪器仪表有限公司
2.2实验药品
实验药品如表2所示：
表2 实验药品表
Table 2 Experimental drug table
药品名称 型号/规格 产地
亚硝酸钠固体 优级纯 天津市
九水合硝酸铝 分析纯 国药集团
氢氧化钠固体 分析纯 天津市
芦丁标准品 - -
95%乙醇 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
无水乙醇 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
磷酸二氢钠 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
磷酸氢二钠 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
DPPH 分析纯 -
邻二氮菲 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
三氯乙酸 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
铁氰化钾 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
Tris 分析纯 上海捷润化学试剂有限公司
盐酸 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
邻苯三酚 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
氯化铁 分析纯 西陇科学股份有限公司
30%过氧化氢溶液 分析纯 成都市科隆化学品有限公司
维生素C 药用级 -
蒸馏水 - 广西民族师范学院
桑叶 - 崇左市周边桑叶园
FeSO4·7H2O 分析纯 西陇科学股份有限公司
2.3溶液的配制
（1）10%硝酸铝溶液：使用电子天平准确称取17.60g的硝酸铝，溶解后将其转到100mL容量瓶，定容到刻度线。
（2）5%亚硝酸钠：使用电子天平称取5.00g亚硝酸钠，加入少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶，定容至刻度线，备用。
（3）4%氢氧化钠溶液：准确称取10.00g氢氧化钠固体，加入蒸馏水溶解
，待溶液冷却后转移至250mL容量瓶，定容至刻度。
（4）pH=7.4的磷酸缓冲（PBS）液：使用分析天平准确称取4.4765g磷酸氢二钠和1.9501g磷酸二氢钠，分别溶解后定容至250mL容量瓶，混合后用氢氧化钠调节pH至7.4。
（5）Tris-HCl缓冲溶液（pH=7.9）：分别配制0.1mol/L的HCl溶液和0.1mol/L的三羟基氨基甲烷溶液，然后以16:25的比例混合均匀。
（6）0.1mmol/LDPPH溶液：准确称取1.9716mgDPPH固体，加入无水乙醇溶解，待完全溶解后转移到50mL棕色容量瓶中，定容。需要现配现用。
（7）50mmol/L邻苯三酚：准确称取630mg邻苯三酚，加10mmol/L HCl溶液溶解，转移到100mL容量瓶，定容，4°C下避光保存。
（8）7.5mmol/L邻二氮菲：准确称取187.5mg的邻二氮菲固体，加入2.5mL的无水乙醇使其完全溶解，加蒸馏水转移至500mL容量瓶，定容。
（9）1%的六氰合铁酸钾溶液：准确称取1.000g铁氰化钾固体，加水溶解后转移到100mL容量瓶中，使用蒸馏水定容至刻度线。
（10）10%的TCA溶液：准确称取10.00g三氯乙酸，加水溶解后转移至100mL容量瓶，定容。
（11）1%的FeCl3溶液：准确称取100mg FeCl3固体，加水溶解后转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。
（12）7.5mmolFeSO4溶液：准确称取280.53mgFeSO4·7H2O固体，加蒸馏水溶解，定容至100mL容量瓶中。
（13）0.1% H2O2溶液：量取0.166mL H2O2溶液，加少量蒸馏水稀释，然后转移到50mL容量瓶中，定容。
2.4实验方法
2.4.1芦丁标准曲线的建立
准确称取0.0200g芦丁标准品，加入30%的乙醇溶解，加热使之完全溶解，然后转移至100mL容量瓶中，得到浓度为0.2mg/mL的标准溶液备用。使用移液管分别移取上述标准溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、5.00mL、7.00mL、9.00mL于25mL比色管中，加入0.70mL 5%的NaNO2溶液，使其充分摇匀后静置5分钟，然后再加入0.70mL 10%硝酸铝溶液使之发生蟹合反应，摇匀后再静置5分钟，再加入5.00mL 4%的氢氧化钠溶液，用30%的乙醇定容至刻度，充分震荡后静置15分钟。以空白为对照，在510nm处测出吸光度。最后以质量浓度作为横坐标（X）、吸光度值作为纵坐标（Y）绘制出如图2.1所示的标准曲线，其线性方程为Y=10.4375X+0.0419（R2=0.9999）
图2.1 芦丁标准工作曲线
Fig. 2.1 Rutin Standard working curve
2.4.2超声波提取
2.4.3桑叶总黄酮的测定
准确移取1mL提取液至25mL容量瓶中，然后使用提取的乙醇浓度定容到刻度，混合均匀。吸取1mL稀释后的黄酮溶液于25mL的比色管中，按照2.4.1的方法测出其吸光度，并计算出其得率。其计算公式为（2-1）
总黄酮得率=(提取液浓度×提取液总体积×稀释倍数)/桑叶粉末×100% （2-1）
2.5桑叶总黄酮的单因素实验
通过查阅相关文献，设计合适的梯度做单因素实验，本次
实验主要通过探讨提取浓度、料液比、超声时间、温度这四个因素对桑叶总黄酮得率的影响，得出最优的提取条件，然后选取最优条件下的桑叶总黄酮来进行抗氧化活性研究
2.5.1提取浓度对得率的影响
准确称取五份2.00g桑叶粉末于锥形瓶中，分别用浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液浸泡30分钟，其料液比为1:20，在50℃下超声浸提30分钟。按照2.4.3的方法步骤进行分析，其结果如图2.2所示。
图2.2提取浓度对桑叶总黄酮提取得率的影响
Fig. 2.2 Effect of extraction concentration on extraction rate of total flavonoids from mulberry leaves
根据图2.2我们可以看出，在提取浓度为50%-80%时，桑叶总黄酮的得率程上升趋势，在浓度为80%时黄酮得率达到3.23%的最大值，而超过80%后，其提取得率反而下降了。这主要表明，当提取浓度过低时，桑叶中黄酮的有效成分未能够被完全提取出来，而浓度过高可能会提取出其他的杂质，不利于桑叶总黄酮的提取。因此，在其它条件都不发生改变的情况下，可以得出桑叶使用乙醇作为提取剂最佳的提取浓度为80%。
2.5.2料液比对得率的影响
准确称取6份2.00g的桑叶于锥形瓶中，用80%的乙醇浸泡30分钟，其料液比分别为1:10、1:20、1：30、1:40、1:50、1:60。然后控制提取温度在50℃，使用超声浸提30分钟。将得出的数据进行分析，其结果如图2.3所示。
图2.3料液比对得率的影响
Fig. 2.3 Effect of material liquid ratio on the yield of total flavonoids in mulberry leaves
由图2.3我们可以分析出，料液比和桑叶总黄酮的提取得率之间存在着很大的关系。在一定的范围内，当料液比增大时，桑叶总黄酮的提取得率也随着增大，当料液比达到1:50之后，总黄酮的提取得率达到最大，为3.58%。而超过这个料液比后黄酮的提取得率反而有所降低。这说明当乙醇含量过低时，桑叶中的总黄酮未能够完全提取出来，所以提取率较低，而当料液比达到1:50时，桑叶中的总黄酮已经最大限度的提取出来。当继续增大料液比时，总黄酮很有可能会被稀释，并且可能会溶解出其它杂质，从而使得总黄酮的提取得率降低。而料液比过大也会对资源造成浪费，因此，在超声提取桑叶总黄酮中，料液比的最优条件为1:50。
2.5.3超声提取时间对得率的影响
准确称取2.00g桑叶置于锥形瓶中，用浓度为80%的乙醇浸泡30分钟，料液比为1:50，将超声温度设置为50℃，在此条件下，对处理好的待提取物分别提取20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟，对所得的数据进行分析，其分析结果如图2.4所示。
图2.4提取时间对得率的影响
Fig. 2.4 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids in mulberry leaves
根据图2.4我们可以看出