实验十五质粒DNA的制备和酶切
一、实验目的及背景
质粒时细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极为广泛的应用价值。本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的如碱变性法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石栏层析法等。各个方法分离是依据宿主菌株类型，质粒分子大小，碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且得率较高，获得的质粒可以用于酶切，连接与转化。
碱变性法基本原理是，在pH为12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可去除大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
在获得较纯的质粒后，我们常常会利用核酸限制性内切酶对质粒进行酶切，就可以达到在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造。核酸限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，能够以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为I/II/III型三大类，II型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，他们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别序列一般为4~6个碱基对的反转重复序列，可以切割DNA 产生三种不同的切口：①5’端突出②3’端突出③平末端。在酶切反应中应当注意以下几个问题：内切酶的纯度和用量、内切酶底物（DNA）的纯度和浓度、反应缓冲液、酶解温度与时间。
二、实验试剂
1.LB培养基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，定容至1L，调节
pH至7.5
2.STE溶液：0.1M NaCl、10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA
3.Amp抗生素：50mg/ml
4.溶菌酶：10mg/ml（用10mM Tris- HCl pH8.0新鲜配制）
5.溶液I：50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM EDTA
6.溶液II（新鲜配制）：0.2M NaOH、1% SDS
7.溶液III：5M KAC 10mL、冰醋酸11.5mL、水28.5ml
8.TE溶液：10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA
9.酚氯仿
10.乙醇
11.RNase
12.琼脂糖
13.限制性内切酶
14.DNA（λDNA和质粒DNA）
15.100mmol/L NaCl溶液
16.10mmol/L MgCl2溶液
17.无菌水
三、实验方法
1、挑取琼脂培养板上的单菌落至5mL LB培养液中（含Amp 50μg/ml），37℃强
烈振摇过夜。
2、取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g 4℃离心30秒，弃上清，用1mL
STE液悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。
3、将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液I中，加入10μl溶菌酶（10mg/ml），振
荡混匀，冰上放置1分钟。
4、加入200μl溶液II，盖上管盖，轻柔颠倒5次以混匀内容物，冰上放置3分
钟。
5、加入150μl溶液III，温和振荡数次，冰上放置5分钟。
6、12000g 4℃下离心5分钟，取上清移到一个新的Eppendorf管中。
7、加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，12000g 4℃下离心2分钟。取上清
至另一个Eppendrof管中。
8、加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，-20℃沉淀过夜（或冰浴15min）。
9、12000g 4℃离心5分钟。
10、弃上清，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗沉淀，12000g，4℃离心2分钟。
11、弃上清，抽干残余乙醇。
12、加入50μl TE溶液溶解DNA。
13、取10μl DNA溶解液用TE稀释至1000ul，并测定OD260、OD280，计算
OD260/OD280值，同时利用以下公式计算得率：
质粒DNA得率：稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5mL
14、取10μl DNA溶解液，加入2μl Loading Buffer于1%琼脂糖凝胶，电泳
3小时，电压40伏。
15、电泳凝胶在投射式紫外检测仪上观察，记录结果。
16、限制性内切酶酶解：
①按照如下所示加入各试剂至Eppendorf中：DNA 1μg、10×buffer 2.5
μl、内切酶2μl、无菌水补至25μl，需要注意的是限制性内切酶最后
加入，且在冰上进行操作。
②将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
③将Eppendorf管封上封口膜，置入37℃水浴中反应2小时。
④反应结束后加入EDTA至终浓度为10mmol/L以终止反应。
⑤取10μl反应液与2μl Loading buffer混匀，于1%琼脂糖凝胶上40伏电
压进行电泳，时间约为2-3小时。
⑥紫外透射仪上检查实验结果。
四、结果与分析
1、质粒DNA OD260，OD280的值，由此计算得率和DNA纯度。
2、记录质粒电泳结果并说明结果内容。
3、记录酶切后质粒在琼脂糖凝胶上的电泳结果，并分析实验结果的成因。
五、问题与讨论
1、简要叙述溶液I，溶液II，溶液III的作用，以及实验中分别加入上述溶液
后，反应体系出现的现象及其成因。
2、简要叙述酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因。
3、沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？
4、在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？
5、如何选择DNA和限制性内切酶的用量？
6、反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？