叶绿体的分离及荧光染色观察
泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；
2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光；
3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】
1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：
差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
3、荧光：
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。
荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。
4、荧光显微镜及其操作的注意事项：
激发光源启动后，15min之内不得关闭电源，一旦关闭电源，3min内不得重新启动；光路对中；选择相对应的激发滤片，阻断滤片和双色滤片；需照片时，应该及时拍照，否则效果可能会降低。激发滤片：得到想要的激发光；双色镜：三角棱镜。起分离激发光和荧光的作用；阻断滤片：阻挡未转化成荧光的激发光，三者组合成为激发滤块；荧光显微镜的物镜与标本离得较近，用于多收集荧光；
5、染色剂吖啶橙：
A、探针特性：AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光；AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核苷酸的磷酸发生静电间相互作用。强结合作用又称插入性方式。AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子插入的数目，每隔三个碱基插入一个AO分子，这种方式的结合，主要是AO分子与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸和结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA结合，其发射波长为640nm呈红色荧光。AO愈合素昂的结合在低浓度下最佳，此时插入性强结合作用方式占优势。
B、AO的主要应用：对细胞内单链或双链DNA/RNA定性或定量测定；分析核酸内部结构及核酸的细胞成分构象；观察DNA凝胶电泳情况；作为细胞内PH梯度的显示剂，用来检测离子交换，钙离子诱导的质子浓度梯度变化等。
【实验器材】
1、材料：新鲜菠菜；
2、试剂：吖啶橙染色剂；0.35mol/L 的NaCl溶液；
3、实验器材：普通或高速离心机；电子天平；荧光显微镜；剪刀；滴管；离心管；盖玻片，载玻片；镊子；普通显微镜等；
【实验步骤】
1、选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl 溶液中；
2、将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，转速5000r/min；
3、将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml 烧杯中；
4、取滤液4ml在1000r /min 下离心2min；
5、取上层清液在3000r /min下离心5min(沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；
6、将沉淀用2-3ml 0.35MNaCl 溶液悬浮；
7、取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察；
8、另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。
9、另取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。
【实验结果】
1、实验图片：
图1：普通光学显微镜下的菠菜叶片表面气孔
图2：荧光显微镜下的气孔周围的叶绿体（红色）（右为放大后的涂片）
图3：普通光学显微镜下的叶绿体
图4：荧光显微镜下的叶绿体 图5：吖啶橙染色后荧光显微镜下的叶绿体 气孔 叶绿体
叶绿体
2、实验结果：
A、气孔为成对存在的肾形保卫细胞构成，保卫细胞中含有叶绿体，保卫细胞中的叶绿体发出红色荧光并围绕气孔排列一圈（如图1图2）；
B、普通光学显微镜下，叶绿体为绿色，橄榄形，若在高倍镜下观察，可以看到叶绿体内部含有颜色较深的绿色小颗粒，即基粒；
C、使用荧光显微镜，在选用B激发滤片，B双色镜和O530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光；
D、加入吖啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，视野中亮绿色的为细胞核碎片等杂质。
3、实验结果分析：
A、在普通显微镜下，观察到气孔由两个保卫细胞组成，然而因为镜头有污染，可以看到照片的正中央位置有些模糊；
B、在荧光显微镜下观察到保卫细胞内部的叶绿体，放大后更加明显，却也有一些模糊；背景为黑色，说明其他的结构没有自发荧光；
C、普通光学显微镜下可以看到绿色橄榄形的叶绿体，还有其他的一些杂质，如细胞核碎片等，但是杂质不是绿色，可以区分；
D、荧光显微镜下的游离叶绿体发出火红色的荧光，可以看到，叶绿体较多，背景为黑色；
E、吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察，可以看到橘红色的叶绿体以及亮绿色的细胞核碎片等杂质，背景为较亮的黄绿色，说明悬液中其他的杂质存在；
F、总体来说，此次实验的结果较为理想，找到了应该找到的结构，并进行了拍照记录，学习了使用荧光显微镜；
【实验反思与总结】
1、注意事项：
A、要得到完整的，有活性的叶绿体，需在低温下迅速提取，图片后立即观察；
B、利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、猝灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
C、在制作荧光标本时，最好使用无荧光载玻片，无荧光盖玻片和无荧光香柏油；
D、用菠菜叶提取叶绿体时，尽量使用鲜嫩的菠菜，去掉梗，打碎叶片时转速不可以过高，否则叶绿体也会遭到一定的破坏；
E、在撕取菠菜叶表皮时，应该选用下表皮并且厚度适中，在1.35M的氯化钠溶液中铺平，盖盖玻片时尽量保证无气泡；
F、由于荧光会慢慢变得不明显，最好吖啶橙染色后立即拍照观察，在照片上分析，这就要求拍照要迅速清晰；
2、思考题：
A、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？
答：有变化,因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样。B、游离叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无差异？为什么？
答：有区别，因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小，颜色和荧光强度就会有差别。
C、根据观察的实验现象，描述自发荧光和次生荧光的区别？
答：某些物质受激发光照射后课直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光，称自发荧光（直接荧光）。
某些物质本身不发荧光，但他经荧光染料染色后，再通过紫外线照射也能够发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出橘红色荧光。
D、叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？
答：匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，手机类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体（差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度。也可同离心力以及悬浮介质的粘度有关，在一定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同；依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分）叶绿体的分离应该在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0-5摄氏度的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
3、实验小结：
此次实验的主要内容是叶绿体的分离与荧光染色观察，并没有涉及用密度梯度离心进行纯化的过程，因此可以看到，在用吖啶橙染色后，仍然有除去橘红色的染色之外的亮绿色以及绿色的背景，说明含有细胞核碎片及其他的杂质，但是叶绿体仍然能够很明显的区分出来；此次实验学会了用荧光显微镜，并且在荧光显微镜下进行拍照。荧光显微镜下的保卫细胞中的叶绿体以及游离的叶绿体都是会自发产生火红色的荧光，说明叶绿体可以自发荧光。
此次实验，锻炼了我的实验技能以及合作能力，巩固了制片与染色的实验技能，我学到了荧光显微镜的结构及光路原理以及使用的注意事项，并且学会了分离细胞器的方法。
【参考文献】
《细胞生物学实验》第三版，高等教育出版社，王崇英，高清祥。
实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色 【实验目的】 掌握荧光显微镜的原理和使用； 掌握生物材料荧光染色的原理和应用。 【实验原理】 吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。 在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 （1）0.1mol/l pH7.0 PBS液 A液：NaH2PO4·H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml； B液：Na2HPO4·7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；
取A液16.5ml＋B液33.5ml＋NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。（2）1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍）。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 【方法与步骤】 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min。 （3）滴加0.01%吖啶橙染液5min。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
实验五叶绿体的分离与荧光观察 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 实验目的 一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 实验用品 一、器材 1．主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 2．小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 二、材料 新鲜菠菜。 三、试剂 0.35 mol／L氯化钠溶液，．0.01％吖啶橙(acridine orange)。 实验方法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35 mol／L NaCI 溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5 000 r／min)匀浆3~5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
实验三叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。 2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。 3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。 二、实验原理 叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。 植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。 差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。 三、实验仪器、材料和试剂 1．设备与器材
吖啶橙荧光染色法 【实验原理】 吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染 色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子 也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两 种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液 取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显 示橘红色荧光 【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长 将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。
实验一叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： （1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 （2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理： 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。一次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等身溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0℃~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、实验用品： 1、材料：新鲜菠菜 2、试剂： （1）0.35mol/L氯化钠溶液 （2）0.01%吖啶橙（acridine orange） 3、器材： （1）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。 （2）小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管20支，10ml刻度离心管20支，试管架5个，纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各4片等。 四、实验方法： 1、叶绿体的分离与观察： （1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 （2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆2~3分钟。 （3）将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 （4）取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。 （5）将上清液在3000r/min下离心5分钟。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混
生命科学学院 Life Scie nee College 细 胞 生 物 学 实验报告 姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班
山东大学实验报告 2015年5月10日 学号：2同组者：曾玮璠 姓名：柳伟雄 系年级：生科一班2013级 科目：细胞生物学实验 题目：叶绿体的分离和观察 一、目的和要求 1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法 、原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 是分离细胞器的常用方法。 一个颗粒在离心场中的 沉降速率取决于颗粒的大小、 形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。 在一给定的离心场中， 同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。 一次增加离心力和离心时间， 就能够使非均一悬 浮液中的颗粒按其大小、 密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体 的分离应在等身溶液（0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体 损伤。将匀浆液在1000r/min 的条件下离心2分钟，以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。 然 后，在3000r/min 的条件下离心5分钟，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核） 。分离过程最好在 0C — 5C 的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检 测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即 拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和无荧光油。 三、试剂和器材 1. 材料：新鲜菠菜 2. 试剂：（1） 0.35mol/L 氯化钠溶液（2） 0.01%吖啶橙（acridine orange ） 3、 器材：（1 ）主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜 （2）小型器材：500ml 烧杯2个，250ml 量筒1个，滴管20支，10ml 刻度离心管 纱布若干，无荧光载玻片和盖玻片各 4片等 四、实验步骤 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称 30g 于150ml 0.35mol/LNaCI 溶液中，装入组织捣 碎机 2. 利用组织捣碎机低速（5000r/min ）匀浆2— 3分钟 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中 4. 取滤液4ml 在1000r/min 下离心2min ,弃去沉淀 同组者：曾玮皤 20支，试管架5个,
叶绿体的分离及荧光染色观察 泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法； 2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光； 3、复习巩固制片及染色的基本技术。 【实验原理】 1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。 2、差速离心和密度梯度离心： 差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。 密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 3、荧光： 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。 荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。 荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
中国海洋大学实验报告姓名：系年级：**级专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验学号：** 一、实验目的： （1）、通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法 （2）、观察叶绿体的间接荧光，并了解荧光显微镜的使用方法 二、实验原理 颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，一次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小。密度的先后分批沉降在离心管的底部分批收集，即可获得各个亚细胞的组分。 叶绿体的分离应该在等渗溶液中进行，以免渗透压影响叶绿体，对其造成损伤。 在荧光显微镜下可以观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。 三、实验材料 新鲜菠菜。 等渗溶液：0.35mol/L氯化钠溶液， 试剂：0.01%吖啶橙(acridine orange)
四、实验方法 １、叶绿体的分离 2、菠菜叶手撕片的制备 ①、下表皮因海绵组织较疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在显微镜下观察。
②、上表皮因栅栏组织较致密，可以用刀片将下表皮刮掉，在显 微镜下观察上表皮的细胞和气孔。 3、菠菜的叶绿体的观察 在普通光学显微镜下，将制得的手撕片放在载玻片的等渗溶液中，游离的叶绿体悬浊液点在在载玻片上，轻轻地盖上盖玻片（防止气泡 产生），即可观察。 在荧光显微镜下，将游离叶绿体悬浊液的的标本放在荧光显微镜下，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察其产生的自发荧 光。 向手撕片的标本、游离叶绿体悬浊液的的标本中加入1-2滴 0.01% 吖啶橙染液，先后用绿光、蓝光对其进行照射，在电脑上观察 其产生的间接荧光。 五、实验结果 气孔保卫细胞 叶绿体 图1菠菜手撕片的标本中，上表皮及其气孔
实验十一叶绿体的分离和荧光观察 一．实验目的 了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般 形态，增加对叶绿体的感性认识。 掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。 掌握显微数码拍照的方法。 二．实验内容 提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。 显微数码拍照。 三．实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。离心后可得沉淀的叶绿体。 四．实验方法与步骤 1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。 2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。 3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。 4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。 5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。 a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。 b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。 c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。而其中混有的细胞核发
出绿色荧光菠菜叶手切片观察。 d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。 5．显微数码拍照。 五．实验结果
叶绿体分离与荧光染色观察
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 叶绿体分离与荧光染色观察 一．实验目的 1．通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。 2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 二．实验原理 1．叶绿体分离的原理 匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。 差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同。 依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 2．差速离心 特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；
日 姓名系年级组别同组者 科目细胞生物学实验题目叶绿体分离与荧光染色观察学号 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器； 沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 3．荧光的概念 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间
实验二叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 二、实验原理 1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中 进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直 接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。 三、实验步骤 1.选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称 3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCl溶液，匀浆3～ 5min。 2.匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。 3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉 淀。 4.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。 5.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体 悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察： ①在普通光镜下观察； ②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察， 找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光 作光源，用暗视野观察。 6.撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通 光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。 四、结果与分析
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
玉米和水稻叶绿体的分离及叶绿素含量的测定 摘要：利用高盐低pH值法对C 3植物和C 4 植物进行叶绿体的分离与提取，经研磨-差 速离心-裂解-纯化，可获得完整的叶绿体,进而用丙酮溶解叶绿素，测定光密度值，推算出总叶绿素含量。本方法快速简便、省去传统的蔗糖密度梯度离心和氯化铯 密度梯度离心等昂贵、耗时的步骤，对仪器的要求不高，成本低，适用于实验教 学和科研活动。 关键词：叶绿体；叶绿素；分离；含量测定 Abstract :Plant chloroplast were extracted by the high-salt and low pH method. after skiving, differential centrifugation, cracking and purification we got eligible chloroplast. dissolved the chlorophyl by acetone and calculate the total content of chlorophyl after the absorbency mensurated. The method is fast and simple, it elide some expensive, time-consuming steps such as traditional sucrose density gradient centrifugation and cesium chloride density gradient centrifugation, it suit for teaching and research. Key words：Chloroplast, Chlorophyl，Separate，Content mensurate 1 前言 叶绿体是植物进行光合作用极为重要的细胞器，它具有独立复制的遗传物质。20世纪 初，人们根据植物叶片的花斑现象具有母性遗传的特征，推断在叶绿体上可能存在着核外 的遗传因子。直到20世纪60年代初，随着核酸检测与镜技术发展，叶绿体基因组的存在 才最后由Ris等人证实[1]。目前，cpDNA被广泛地用于细胞质遗传、植物雄性不育、植物 的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等方面的研究[2]。然而，叶绿素是在叶绿体中得到的 一种色素，它广泛存在于植物的叶和茎中的绿色色素，它与蛋白质结合在于叶绿体中，是 绿色植物进行光合作用所必需的催化剂。一般叶绿素是泛指叶绿素类的总称。叶绿素及其 衍生物可广泛用作食品的食用色素，还可用于化妆品的着色剂、脱臭剂等；在医药上可用 来治疗创伤、传染性肝炎、胃及十二指肠溃疡、慢性肾炎及急性胰腺炎，它还能增进造血 机能及促进放射线损害机体的康复，外科上用于治疗灼伤、痔疮及子宫疾患，并有降低胆 固醇、改善便秘等作用[3]。由于叶绿体中的重要功能，所以一直是细胞生物学、遗传学和 分子生物学的重要研究对象。 人们根据光合作用碳素，同化中CO2固定的最初光合产物日不同，把高等植物分成2 类:1)C3植物。这类植物的最初光合产物是3-磷酸甘油酸(三碳化合物),这种反应途径C3途 径,如水稻、小麦、棉花、大豆等大多数植物。2）C4植物。这类植物以草酰乙酸（四碳化 合物）等为光合最初产物，所以这种途径称为C4途径，如玉米、甘蔗、高粱等。一般来说，
中国海洋大学实验报告 2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察 一、实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理 1. 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 2. 叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 3. 因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。 三、实验用品 1. 材料：新鲜菠菜。 2. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 3. 器材： (1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 (2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。 四、实验步骤与方法 一、叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2.低速匀浆3~5min。 3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。 6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 二、菠菜叶手撕片观察 轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3)观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光
【实验原理】 吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。 【实验用品】 1、器材 荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 （1）l PBS液 A液：NaH 2PO 4·H 2O 2.76g，加蒸馏水至100ml； B液：Na 2HPO 4·7H 2O 5.36g，加蒸馏水至100ml； 取A液＋B液＋NaCl ，用蒸馏水稀释至100ml。 （2）1%吖啶橙原液
取吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用PBS溶液稀释10倍）。 3、材料 口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 （1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 （2）95%乙醇溶液固定5min。 （3）滴加%吖啶橙染液5min。 （4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。 【结果与观察】 荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色 【注意事项】 （1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 （2）每种荧光染料，均有自己的最适pH，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23 班级：姓名：一．试验目的 1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。 2．理解叶绿体的分离与保存环境。 3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。 二．实验原理 1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。 2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。 三．实验用具 1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。 2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等 四．实验步骤 1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。 3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。 6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。 7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。 8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。 五．实验结论与思考 1．两次离心的沉淀物颜色有什么不同？过滤的滤渣和第一次离心弃去的沉淀有那些主要成分？ 2．0.35mol/L NaCL溶液的作用是什么？能否将其用蒸馏水代替？ 3．实验用品冷冻以及实验操作在冰浴中进行的目的是什么？ 离心机使用注意事项： （1）离心管必须等量、对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。 （2）启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。 （3）电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。 （4）分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。 背景知识： 组织细胞的破碎方法很多，有破碎技术中细胞破碎法包括机械法（研磨法、匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽
科目细胞生物学实验姓名*** 系年级2011级生物基地学号***日期2013.05.16 同组者*** 叶绿体的分离、纯化及荧光观察 【实验目的】 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。通过控制离心力和离心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，3000r/min 的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。 荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。 叶绿素吸收的光能主要用于光合作用。多余的能量可能以热的形式散发，也可能以激发光的形式散发。这种激发光就称为叶绿素荧光。叶绿素荧光检测技术作为一种强大的工具，广泛应用于生态学和植物生理学研究。 利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，