全部实验步骤
1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时
230%蔗糖脱水48小时以上
3-25°C包埋(冰冻切片机内)
4冰冻切片冰冻切片步骤
1.冰冻切片4um左右,室温25° C复温30min,浸入4 ° C预冷的丙酮固定10min,
2.PBS( PH为7.2-7.4 )在9cm皿内摇床冲洗3次,每次5min (第一次冲洗时间短些,约
1min后更换)
3.用30%±氧化氢一份,纯甲醇50份(需要现配,避光条件封闭,可以用纸盒盖住皿)30min。
4.PBS( PH为7.2-7.4,酸性)在9cm皿内摇床冲洗3次,每次5min (第一次冲洗时间短
些,约1min后更换),甩去PBS擦干切片周围的水分,用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈,距离组织不宜太近,与切片组织保持5mm左右距离,太近会导致边缘效应。
5.5%BSA室温孵育20min,期间注意观察,以免BSA干燥而导致背景太高,请注意在皿内
玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清,PBS洗1min,擦干周边水分,圈内可不擦,但尽量要甩干,以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BS(抗体浓度为1:100 ),悬空加入一抗工作液50-100UI,枪头不要触
及组织,以免损伤组织结构,滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡,混匀一抗,否
则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内,置于4° C冰箱过夜(最长不可超过48h),注意盖盖,放入后观察玻片是
否处于水平位(否则抗体可能流失,导致玻片组织干掉,出现背景高和假阳性),孵育期间观察抗体是否干,若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片,置常温复温30min,后PBS冲洗1+5+5+5min,
10.滴加1:100生物素标记的二抗(注意选择核对一抗来源,抗体加入稀释后在EP管内弹
匀,掌上离心机离心)室温孵育30min-1h,后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液(SABC室温1h,
后PBS冲洗1+5+5+5min,甩干,以免显色不均。
12.DAB显色,显色时放置在白色纸上,观察显色程度以终止DAB反应,最好把玻片置于显
微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB,观察到阳性区和阴性区差异后终止,此时最好有计时,以便于今后重复试验控制显色时间(一般显色时间2s-10min ,显色时间过长背景高,且可靠性低)
13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内,用自来水流水稀释终止5min,后在显微镜下观察
是否有DAB颗粒附着。
14.甩干水分,苏木素复染(如为加汞的苏木素,显色时间为6-10S,可不用酒精分化,
直接用PBS返蓝,如为非加汞苏木素,需在盐酸酒精分化),苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。
15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明(75%-85%-95%-100%-100%二甲苯1-二甲苯2)个3min,
滴加中性树胶封片,中性树胶浓度以不拉丝为宜
16.封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min),用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。
观察照相。
针对脱片问题,我做了如下处理。但仍存在脱片现象,麻烦您给我提
一些相关的建议。
自来水冲洗玻片,晾干后,多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过
1.单涂胶:往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul,用另一张玻片推片,然后叠
加其上,停留5分钟,中间推动玻片数次,使液体涂抹均匀,分开两张玻片,滤纸吸干玻片下缘,置玻片架上60°C烤干1h备用。
2.双涂胶:往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重
复涂胶1次"600C烤干,备用。
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